Summary
Courants synaptiques sont enregistrables circonscrits de visualisé boutons synaptiques à la jonction neuromusculaire Drosophila troisième stade larvaire des larves. Cette technique permet la surveillance de l’activité d’un seul bouton synaptique.
Abstract
Drosophila jonction neuromusculaire (NMJ) est un système excellent modèle pour étudier la transmission synaptique glutamatergique. Les auteurs décrivent la technique des enregistrements macropatch focale des courants synaptiques de boutons visualisées à la NMJ de larves de drosophile . Cette technique nécessite la fabrication sur mesure de l’enregistrement de micropipettes, ainsi qu’un microscope composé avec un fort grossissement, objectif à immersion d’eau sur de longues distances, optique (DIC) de contraste interférentiel différentiel et un fluorescent système de fixation. L’électrode d’enregistrement est positionné sur le dessus un bouton synaptique sélectionné visualisé avec DIC optique, épi-fluorescence ou les deux. L’avantage de cette technique est qu’il permet de contrôle de l’activité synaptique d’un nombre limité de sites de libération. L’électrode d’enregistrement a un diamètre de quelques microns, et les sites de sortie positionnés à l’extérieur de la jante électrode n’affectent pas sensiblement les courants enregistrés. Les courants synaptiques enregistrées ont cinétique rapide et peuvent être facilement résolus. Ces avantages sont particulièrement importants pour l’étude des lignées mutantes de voler avec l’augmentation d’activité synaptique spontanée ou asynchrone.
Introduction
Drosophile est un système excellent modèle pour étudier les mécanismes moléculaires contrôlant la transmission synaptique. Le système neuromusculaire chez la drosophile est glutamatergique, et par conséquent la jonction neuromusculaire de drosophile (NMJ) peut être utilisée pour étudier les caractéristiques conservées de libération glutamatergique. Depuis Jan et de Jan étude1, le troisième stade larvaire a été largement utilisé pour étudier la transmission synaptique évoquée et spontanée en surveillant des potentiels de jonction excitateurs (PEJ) ou courants (EJC). PEJ figurent couramment dans les cellules avec une micro-électrode de verre coupants, et elles reflètent l’activité de la NMJ entière, y compris tous les boutons une synapses à la fibre musculaire donnée.
En revanche, l’activité d’un nombre limité des lieux de sortie peut être enregistrée circonscrits en positionnant un embout de micropipette près des bornes neuronales ou varicosités synaptiques. Cette technique a été initialement utilisée par Katz et Miledi2, et des enregistrements extracellulaires focales ont été employées avec succès sur diverses préparations de NMJ, dont grenouille3,4,5,6 de la souris , 7 , 8et crustacés9,10,11,12,13,14,15,16 Drosophile17,18,19,20,21,22,23. Cette approche a été développée par Dudel, qui optimisé macropatch recodage des électrodes24,25. Dans l’implémentation de Dudel, cette technique correspondait étroitement la méthode en vrac-patch-clamp26.
Le NMJ de larves de drosophile a clairement défini les boutons synaptiques, et des lignées transgéniques avec génétiquement encodés tags fluorescents neuronales (voir Table des matières) sont facilement accessibles. Ces avantages nous a permis d’enregistrer des EJCs et mEJCs un bouton synaptique sélectionné20,21,22. Nous décrivons ici cette technique en détail.
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Protocol
1. fabrication d’électrodes de l’enregistrement
protocole de- tirer les électrodes de verre
- utiliser ce qui suit pour l’extracteur de la microélectrode (voir Table des matières) :
- ligne 1 : Heat Tirez 510 - Vitesse 30 fois 250 ; Ligne 2 : Chauffer 490 Pull - Vitesse 30 fois 250.
Remarque : Les unités de temps correspondant à 0,5 ms par unité ; les autres unités sont relatifs. La valeur de la chaleur doit être ajustée pour chaque filament après avoir effectué le test de rampe.
- ligne 1 : Heat Tirez 510 - Vitesse 30 fois 250 ; Ligne 2 : Chauffer 490 Pull - Vitesse 30 fois 250.
- Utiliser un microscope (grossissement de x 35) pour s’assurer que le diamètre intérieur de l’électrode extraite est de l’ordre de 7 à 10 µm ( Figure 1 a). Stocker les capillaires dans des récipients hermétiquement fermés pour éviter l’accumulation de poussière.
- utiliser ce qui suit pour l’extracteur de la microélectrode (voir Table des matières) :
- Feu polissage
- capillaires de feu polonais (80-90 % de la valeur maximale de la chaleur pour 1-2 s) à l’aide d’un micro-forge (voir Table des matières). S’assurer que le diamètre intérieur final de l’électrode poli est 5 µm ( Figure 1 a) 27.
- Flexion
Remarque : deux bandes sont faites afin de positionner l’électrode sur le dessus le muscle dans un objectif de fort grossissement.- Utilisation l’appareil illustré à la Figure 1 b. Fixer l’électrode dans le manipulateur et placez la pointe sur le filament, ne pas en contact avec lui
- Ensemble valeur à 60-70 % du maximum de chaleur et appuyer sur la pédale de la micro-forge pour 1-2 s (voir Table des matières) pour chauffer le filament. Utiliser une aiguille en forme de L pour tirer doucement vers le bas de la pointe de l’électrode ( Figure 1 b agrandie). Réaliser le pli à environ 90 o ( Figure 1).
- Tenir l’électrode sur la flamme de la torche à la main à l’aide de pinces et de réaliser le deuxième pli à une distance de 7 à 10 mm de la première courbe et à un angle d’environ 120 o ( Figure 1).
figure 1. Dernières étapes de la fabrication de la micropipette. (A) électrode conseils après tirant et le polissage de feu. (B.1) le programme d’installation pour le cintrage de pointe. (B.2), la zone boxed est montré élargie sur la droite. L’électrode et le filament sont fixés afin que la pointe de l’électrode est positionné légèrement au-dessus du fil et pas touchante. (C.1) l’électrode d’enregistrement. (C.2), la zone boxed est montré élargie sur la droite. Le premier virage a un angle d’environ 90°, et la distance entre le premier coude et l’extrémité de l’électrode est environ 1 mm. échelle bar = 3 mm. Veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
2. autres étapes préparatoires
- solution de (HL3) préparation heamolymph-like (en mM) : 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, tréhalose 5, 115 saccharose, 5 HEPES et 1 mM CaCl 2 ; ajuster le pH à 7.3 - 7.4. conserver la solution dans le réfrigérateur et le rendre frais chaque semaine.
- Faire des pipettes de stimulation la même manière que l’enregistrement de verre Pipettes, sauf il n’y a pas besoin de les plier.
Remarque : La préparation des électrodes de stimulation est décrit en détail dans 28 et 27. Le diamètre final après polissage de feu devrait être de l’ordre de 5 à 7 µm. - Insert une pipette de stimulation dans un porte microélectrode reliée à une seringue.
- Plaques de dissection de fabrication de petites boîtes de Pétri (35 x 10 mm) avec revêtement époxy de caoutchouc de silicone (voir Table des matières), comme décrit dans 28.
Remarque : Le caoutchouc de Silicone doit être complètement durci avant l’utilisation. - Choisir un troisième stade larvaire errant et disséquer il tel que décrit dans 27 , 28 , 29 , 30.
Remarque : Pour visualiser les boutons, utiliser la souche mouche CD8-GFP (voir Table des matières)- Using pinces (voir Table des matières), ramasser les larves de stade 3 rd d’un flacon.
- Broche les larves, en plaçant la première broche postérieure et l’autre broche antérieure (près de la bouche de crochets).
- Solution ajouter HL3.
- Faire une incision à l’aide de ciseaux de printemps (voir Table des matières) tout le chemin de la goupille supérieure vers le bas l’un sur la face dorsale de la larve.
- Pin le filet de larves, placer 2 broches supplémentaires sur les côtés gauche et droit de la larve.
- Enlever les tripes et les trachées avec une pincette.
- Couper les nerfs juste à l’extérieur du cordon nerveux ventral à l’aide de ciseaux de printemps.
3. Les enregistrements électriques des EJCs
Figure 2. La configuration de l’enregistrement. L’échantillon NMJ épinglé pour le silicium enduit de Pétri (flèche) est positionné sur la scène mobile du microscope composé debout équipé de capacités d’épifluorescence, un objectif fort grossissement et deux micromanipulateurs. Le microscope est stationné sur une table anti-vibration. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Enregistrement
- Place la boîte de Pétri avec la préparation sur la platine du microscope ( Figure 2). Immerger l’électrode de référence dans le bain.
- Remplir l’électrode d’enregistrement avec HL3 solution. Au titre de l’objectif 10 x (voir Table des matières), plonger l’électrode dans le bain et placez-le sur les muscles 6 et 7 des segments abdominaux 2, 3 ou 4 en utilisant le micromanipulateur () (voir la Table des matières) figure 3 A.1 et A.2).
- Utiliser l’objectif x 60 (voir Table des matières). Concentrer sur la zone d’intérêt en utilisant épifluorescente ou optique DIC. Placer l’extrémité de l’électrode sur le dessus de bouton synaptique (B.1-3 de la Figure 3).
- Appuyez sur l’électrode très doucement sur le muscle. Une pression excessive peut endommager le NMJ ou induire une augmentation de l’activité synaptique spontanée. Assurez-vous que l’extrémité de l’électrode n’est pas bouché - si elle est, remplacer it.
- Allumer l’ampli A/D Conseil d’administration et l’ordinateur.
- Choisir le mode de serrage de tension sur l’amplificateur.
- Démarrer le logiciel d’acquisition et de choisir le ' exempte d’écart ' mode.
- Observer l’apparition de mEJCs sur l’écran d’ordinateur.
- Veiller à ce que l’amplitude de le mEJCs est de l’ordre de 0,2 - 0,7 na
Remarque : Plus petit EJC indique que l’électrode d’enregistrement présente des défauts ou s’il n’est pas correctement positionné.
figure 3. Visualisation des boutons synaptiques. Image de fond clair (A) A une hemi-segment inférieur à 10 x grossissement (A.1) et la zone boxed montrant les muscles 6 et 7 (A.2, la flèche indique l’électrode d’enregistrement). Echelle = 50 µm. (B) boutons synaptiques sont visualisés en ligne drosophile avec un marqueur neuronal génétiquement encodé (CD8-GFP) à l’aide de l’imagerie épifluorescente (B.1) ou optique DIC (B.2). Les images sont prises avec le 60 x objectif et le cube de filtre pour l’imagerie de la GFP (voir Table des matières). Synaptic boutons sont marqués par des flèches, et une superposition de fluorescence et d’images DIC apparaît en B.3. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- stimulation
- à l’aide d’un micromanipulateur, sous un contrôle visuel, placer l’électrode de stimulation près de l’axone qui innervent les segments abdominaux 2-4.
- Appliquer une pression négative en tirant sur le piston de la seringue relié à la porte-électrode, afin que l’axone est tirée à l’intérieur de l’électrode ( Figure 2).
- Allumez le stimulateur. Tournez le bouton sur l’unité d’isolement (voir Table des matières) pour définir un courant de zéro et puis doucement augmenter, jusqu'à ce qu’apparaissent des EJCs (ou jusqu'à ce que le seuil est atteint).
- Effectuer la stimulation dans un régime de supraliminaires, avec le courant de stimulation a augmenté environ deux fois plus, par rapport au seuil pour l’observation des EJCs.
Remarque : Dans notre expérience, cette intensité de stimulation est optimale pour éviter les échecs de potentiel d’action et de potentiel d’action de tir. Par exemple, si l’EJC apparaître dans le courant de stimulation de 0,2 mA, utilisez un courant de 0,4 mA tout au long de l’expérience.
- Joint résistance
- mesurer la résistance du joint de l’électrode de macropatch enregistrement en activant l’interrupteur de la résistance d’électrode de l’amplificateur à " joint test " position. Observer que la valeur de résistance du joint en GΩ s’affichera dans les " actuelles " fenêtre.
- S’assurer que la résistance du joint est de l’ordre de 0,5 - 2 M Ω. Les valeurs hors de cette fourchette indiquent que l’électrode est mal poli ou mal positionné.
- Contrôler la résistance du joint tout au long de l’enregistrement, en s’assurant il reste constante tout au long de l’expérience.
4. Analyse
- Analyze enregistrements employant personnalisé de logiciel pour l’analyse (voir Table des matières).
NOTE : Notre laboratoire utilise le logiciel interne Quantan 31, qui est adapté pour la détection des EJCs et mEJCs enregistrées focalement ( Figure 4). Ce logiciel inclut un filtre gaussien numérique et permet la détection des pics quantiques dans le recoupement des événements multiples quantiques ( Figure 4 a). Autres approches sont décrites dans 17.
figure 4. Analyse quantique. Détection de mEJCs (A) et l’EJC (B) par Quantan software. La zone de l’événement est indiquée en vert, et les pics sont marqués par des flèches rouges. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Focal macropatch enregistrements permettent l’activité synaptique suivie de certains boutons synaptiques (Figure 5). Lorsque l’électrode est placée sur le dessus un bouton synaptique (Figure 5 a, site 1), les mEJCs enregistrés (Figure 5, site 1) ont une amplitude excédant sensiblement le niveau de bruit et forte hausse des phases (à une distance de milliseconde subsidiaire). Lorsque l’électrode d’enregistrement est s’éloigne du bouton synaptique de quelques microns (Figure 5 a, site 2), les amplitudes de déclin enregistré mEJCs presque pour le niveau de bruit (Figure 5 b, site 2). L’EJC enregistré se distingue à peine du bruit et ils ont prolongé la hausse phases (Figure 5, site 2 versus site 1).
Le nombre limité de sites de libération, qui contribuent à l’EJC enregistré et mEJCs, ainsi que des cinétiques rapides des courants synaptiques enregistré circonscrits, permet une détection précise des événements de libération chez les mutants avec activité synaptique élevée. Cela peut être clairement illustrée par les enregistrements de mEJCs de complexin mutant nul (Figure 6 a). L’activité spontanée est considérablement élevée dans ce mutant32, et par conséquent mEJPs enregistrés intracellulairement se chevauchent et ne peut pas être clairement distingués les uns des autres (Figure 6 b), tandis que les enregistrements focale22 activer précis détection d’événements libération spontanée (Figure 4 a).
Figure 5. Enregistrements des EJCs et mEJCs d’un bouton sélectionné. (A) placer l’électrode sur un bouton sélectionné (site 1) et il s’éloigne du bouton (site 2). Les images montrent le CD8-GFP NMJ tagged visualisé avec épifluorescente (A.1), enregistrement des électrodes sur la fibre musculaire (A.2), et de superpositions (A.3, A.4), avec l’électrode positionnée sur site 1 (A.3) ou au site 2 ( A.4). barre d’échelle = 10 µm. (B) mEJCs enregistrées à partir du bouton (site 1) sont clairement distinguer le bruit de l’enregistrement et les phases de montée rapides. En revanche, mEJCs enregistré du site 2 ne peuvent être distinguées de façon fiable du bruit de l’enregistrement, leurs amplitudes sont réduites plusieurs fois, et ils ont un temps plus lent. (C) les Amplitudes des EJCs enregistrées à partir du bouton (site 1) dépasse de plusieurs fois que les amplitudes des EJCs enregistrés du site 2, et ils ont aussi cinétique plus rapide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6. Focal macropatch par rapport aux enregistrements intracellulaires. Focales enregistrements permettent une détection précise des mEJCs chez le mutant null complexin (A), tandis que les enregistrements intracellulaires (B) de cette pièce mutante libérer des événements qui se chevauchent et ne peuvent être détectés de manière fiable. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Drosophila représente un organisme modèle avantageux pour étudier la transmission synaptique. Plusieurs configurations d’enregistrement ont été utilisées à la NMJ larvaire, y compris des enregistrements intracellulaires de potentiels synaptiques, enregistrements de courants synaptiques avec deux électrodes voltage clamp33,34et focal macropatch enregistrements de courants synaptiques décrites ici. Cette dernière technique permet la quantification précise de la transmission synaptique à boutons visualisées.
Le succès du protocole décrit dépend de la capacité de visualiser clairement le domaine d’intérêt et de personnaliser la préparation des électrodes d’enregistrement. Ainsi, optique de qualité DIC, un objectif à immersion d’eau fort grossissement avec une longue distance de travail et équipement sur mesure pour le feu de polissage et de flexion des électrodes d’enregistrement sont d’une importance.
L’avantage de cette approche est qu’elle permet de surveiller l’activité de quelques synapses qui sont placés sous l’électrode d’enregistrement. Il convient de noter, toutefois, les boutons positionnés près du bord de l’électrode peuvent aussi contribuer à l’activité enregistrée. Il est essentiel, par conséquent, que la position de l’électrode, ainsi que la résistance du joint, ne change pas au cours de l’expérience.
La capacité de surveiller l’activité d’un seul bouton peut être potentiellement associée ces dernières technologies d’imagerie. Par exemple, la détection optique d’activité à différentes zones actives35 peut être combinée avec enregistrements focales de l’EJC et mEJC, et cela pourrait coupler la résolution spatiale de détection optique avec une résolution temporelle d’enregistrements électriques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Pris en charge par l’octroi de NIH R01 MH 099557
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | - | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | - | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
References
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