Summary
ショウジョウバエ第 3 齢幼虫神経筋接合部シナプス ボタンの可視化から塊状性シナプス電流を記録できます。この手法は、単一のシナプスブートンのアクティビティを監視できます。
Abstract
ショウジョウバエ神経筋接合部 (NMJ) はグルタミン酸作動性シナプス伝達を研究するエクセレント モデル システムです。ショウジョウバエ幼虫 NMJ で可視化研究からシナプス電流の焦点の macropatch 録音の手法について述べる。この方法で高倍率、長距離水浸対物レンズ、差動干渉の対照 (DIC) の光学、蛍光顕微鏡と同様に、マイクロ ピペット、記録のカスタマイズ加工を必要添付ファイル。記録電極は選択したシナプスブートン DIC 光学、エピ蛍光、あるいは両方に可視化の上に配置されます。この方法の利点は、リリースのサイトの限られた数のシナプスの活動を監視できます。記録電極は直径数ミクロン、および電極縁外に配置されるリリース サイト記録電流に大きな影響はないです。記録された性シナプス電流高速キネティックがあるし、容易に解決することができます。これらの利点、または非同期の自発的なシナプス活性の増強と突然変異のはえ系統の研究のため特に重要です。
Introduction
ショウジョウバエは、シナプス伝達を制御する分子機構を研究するエクセレント モデル システムです。ショウジョウバエの神経筋システムは、グルタミン酸とグルタミン酸作動性のリリースの保存の機能を勉強したがってショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ) を使用できます。以来 1 月および 1 月の研究1、3 齢幼虫は興奮性接合電位 (EJPs) または (EJCs) の流れを監視することによって誘発と自発的なシナプス伝達を研究に広く使用されています。EJPs はよく鋭いガラス微小電極を細胞内に記録され、彼らは特定の筋線維のシナプスを作るすべてのボタンを含む全体の NMJ の活動を反映しています。
対照的に、神経やシナプス下肢近くマイクロ ピペット チップを配置することで先んじて、リリースのサイトの限られた数のアクティビティを記録できます。この手法がカッツと Miledi2、採用された当初と焦点細胞外記録が正常にカエル3,4、5マウス6を含むいくつかの NMJ 製剤で採用されています。,7,8甲殻類9,10、11,12,13,14,15,16, ショウジョウバエ17,18,19,20,21,22,23。このアプローチは、記録電極24,25macropatch に最適化した Dudel によってさらに開発されました。Dudel の実装では、この手法の方が、緩いパッチ クランプ法26を一致しました。
ショウジョウバエ幼虫 NMJ、明確なシナプス研究と遺伝的コード化神経細胞蛍光タグ (材料の表を参照) と形質転換線がすぐに利用できます。これらの利点は、EJCs と選択したシナプスブートン20,21,22mEJCs を記録することができました。ここでは、このテクニックの詳細をについて説明します。
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Protocol
1 記録電極の作製
電極引き手の- ガラス電極を引いて
- 次を使用
- プロトコル (材料の表 を参照してください):
- ライン 1: 熱。510 プル - 速度 30 時間 250;2 行目: 熱 490 プル - 速度 30 250 時間します
。 注: 時間の単位は 1 単位当たり 0.5 ms に対応します。他のユニットは相対的です。ランプのテストが実行された後、すべてのフィラメントの熱の値を調整する必要があります 。
- ライン 1: 熱。510 プル - 速度 30 時間 250;2 行目: 熱 490 プル - 速度 30 250 時間します
- に確実に ( 図 1 a) 7-10 μ m の範囲で引っ張られた電極内径顕微鏡 (35 倍) を使用します。塵の蓄積を防ぐために密閉容器に毛細血管を格納します 。
- 火研磨
- 火ポーランド毛細血管 (1 〜 2 秒の最大熱値の 80-90%) マイクロ フォージを使用して (材料の表 を参照してください)。洗練された電極の最終の内径が 5 μ m ( 図 1 a) 27 を確認します 。
- 曲げ
注: 2 つのベンドが高倍率の目的の下に筋肉の上に電極を配置するために作られています。- 図 1 b に示すように装置の使用。マニピュレーターに電極を修正し、それを触れていないフィラメント上の先端の位置
- セット値を最大の 60-70% を熱し、1 〜 2 秒のためマイクロ フォージのペダルを押す (材料の表 を参照)、フィラメントを加熱します。L 字の針を使用すると、電極 ( 図 1 b の拡大) の先端をそっと引き下げます。約 90 o ( 図 1) に曲げることを確認します 。
- 鉗子を使用して手作業でトーチの炎で、電極を保持し、最初曲げから 7-10 mm の距離で、約 120 o ( 図 1) の角度で 2 つ目のベンド 。
図 1。マイクロ ピペット作製の最終手順です。(A) 電極の引っ張ってくると火の研磨後ヒントします。(B.1) 先端曲げのセットアップ。(B.2) ボックスの領域は、右に拡大表示されます。電極とフィラメントは、電極先端がワイヤーの少し上位置とない感動が固定されます。(C.1) 記録電極。(C.2) ボックスの領域は、右に拡大表示されます。約 90 ° の角度であり、最初のベンドと電極の先端間の距離である約 1 mm スケール最初曲げバー = 3 mm. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
2 準備手順を追加
- (mM) の準備 heamolymph のような (HL3) ソリューション: 5 70 塩化ナトリウム、KCl、20 MgCl 2、10 NaHCO 3、5 トレハロース、115 スクロース, 5 HEPES, 1 mM CaCl 2; 7.3 - に pH を調整。7.4. 冷蔵庫でソリューションを維持し、毎週新鮮な。
- が同じ記録方法ガラス刺激 pipets pipets、作る以外にそれらを曲げる必要はありません
。 注: 刺激電極の作製は、 28 と 27 の詳細で説明されます。最終的な直径 5-7 μ m の範囲にする必要があります火災研磨後 。
- 注射器に接続されている電極ホルダーに刺激ピペット挿入します 。
- 小さなシャーレ 35 x 10 mm) シリコーン ゴム エポキシでコーティングから製造解剖板 (材料の表 を参照) 28 の説明に従って
。 注: シリコーンゴムを使用する前に完全に硬化する必要があります 。
- 放浪の 3 齢幼虫をピックアップし、前述の 27 , 28 , 29 , 30 で解剖します
。 注: ボタンを表示するに使用フライひずみ CD8 GFP (材料の表 を参照してください)- 使用鉗子 (材料の表 を参照してください)、バイアルから 3 rd 幼虫をピックアップします 。
- 幼虫は、最初の端子を後部に配置することをピンし、別ピン前方 (口フックに近い).
- 追加 HL3 ソリューションです 。
- はさみを使用して春 (材料の表 を参照) 上のピンから 1 つ下に幼虫の背側にカットを作成します 。
- 幼虫の左右に 2 の追加ピンを配置すること、幼虫のフィレ肉をピンします 。
- 勇気と気管鉗子を使用してを削除します 。
- 春のはさみを使用して腹側神経索外だけ神経をカットします 。
3。EJCs の電気録音
図 2。レコーディングの設定。サンプル NMJ 落射蛍光機能、高倍率の目的および 2 つのマニピュレーターを搭載した直立の化合物顕微鏡の可動式ステージ上にコーティングされたペトリ皿 (矢印) が置かれたシリコンに固定されています。顕微鏡は防振テーブルに駐留しています。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
- 記録
- 顕微鏡ステージ ( 図 2) で準備とシャーレの場所。お風呂に参照電極を挿入します 。
- は、HL3 ソリューションと記録電極をご記入ください。10 倍を目的として (材料の表 を参照)、電極をお風呂に浸すし、筋肉が 6、7 の 2、3、または 4 のマニピュレーターを使用して腹部のセグメント上に配置 (参照 材料表) ( 図 3A.1 と A.2).
- は、60 x に目標を切り替える (材料の表 を参照してください)。エピ蛍光または DIC 光学を使用して関心のある分野に焦点を当てます。シナプスブートン ( 図 3 B.1 3) の上に電極の先端を配置します 。
- は、筋肉に非常にやさしく電極を押します。過度の圧力が略記を損傷したり、シナプス活動の増加を誘発します。電極の先端は詰まっている - 場合は、それを置き換えることを確認
- アンプ、A/D ボード、およびコンピューターのスイッチします 。
- アンプの電圧クランプ モードを選択します 。
- 集録ソフトウェアを起動し、選択、' のギャップ フリー ' モード 。
- コンピューターの画面に mEJCs の外観を観察 。
- 、MEJCs の振幅は 0.2 - の範囲であることを確認 0.7 na という
注: より小さい EJCs を示す記録電極が欠陥を持っていることまたはそのは正しく配置されません 。
図 3。シナプス研究の視覚化。ヘミ セグメント x 倍率 (A.1) と 6 と 7 の筋肉を示すボックスの面積を拡大 10 未満の A (A) 明視野イメージ (A.2、矢印マークの記録電極)。スケールバー = 50 μ m。 (B) シナプス研究は、遺伝子にエンコードされた神経細胞マーカー (CD8-GFP) と ショウジョウバエ ラインで可視化エピ蛍光イメージング (B.1) または DIC 光学 (B.2) を使用します。画像は撮影目的と GFP 用フィルター キューブ x 60 (材料の表 を参照してください)。Synaptic ボタンは矢印の付いたマークされ、B.3 に蛍光と DIC イメージのオーバーレイが表示されます。スケール バー = 10 μ m. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
- 刺激
- 腹部セグメント 2-4 を支配する軸索に近い刺激電極を置くビジュアル コントロールの下で、マニュピュレーターを使用しています 。
- 電極 ( 図 2) の内側軸索が引っ張られるように注射器のピストンを引いて負圧を適用が電極ホルダーに接続されています 。
- 刺激をオン。アイソレーション ・ ユニットのノブ (材料の表 を参照) をゼロの電流を設定し、ゆっくり増加、EJCs が表示されるまで (またはしきい値に達するまで).
- 現在の刺激閾域における刺激増加約 2 回、EJCs の観測のしきい値と比較して実行します
。 注: 我々 の経験でこのような刺激の強度は活動電位の障害や活動電位の発火を避けるために最適です。たとえば、0.2 の刺激電流で表示されます EJCs mA、0.4 の電流を使用して、実験を通して mA 。
- シール抵抗
- に増幅器の電極抵抗スイッチを回して録音 macropatch 電極のシール抵抗を測定 " テストをシール " 位置。GΩ シール抵抗の値が表示されることを確認、" 現在 " ウィンドウ 。
- シール抵抗は 0.5 - 2 M の範囲にあることを確認 Ω。この範囲外の値を示す電極が正しく研磨または適切に位置しないこと 。
- シール抵抗録音データ全体を監視し、それを確かめる実験を通じて一定します 。
4。解析
解析のためのソフトウェアをカスタマイズ- 分析録音を採用 (材料の表 を参照してください).
注: 当研究室は、社内ソフトウェア Quantan 31, EJCs と mEJCs 塊状を記録した ( 図 4) の検出のためにカスタマイズされるを使用します。このソフトウェアは、ガウスのデジタル フィルターが含まれていて、量子多量子イベント ( 図 4 a) の重複ピークの検出が可能します。他のアプローチは 17 で説明します 。
図 4。量子解析。 の mEJCs (A) と EJCs (B) Quantan ソフトウェアによって検出します。イベント エリアは緑色でマークされますが、ピークは赤い矢印で示されます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
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Representative Results
焦点距離 macropatch の録音は、選択したシナプス ボタン (図 5) からシナプス アクティビティの監視を有効にします。シナプスブートン (図 5 a, サイト 1) の上に電極を配置すると、記録された mEJCs (図 5サイト 1) は騒音レベルを大幅に上回る振幅があるし、上昇の段階 (サブ ミリ秒の範囲) でシャープします。とき記録電極に移動されます、シナプスブートンから数ミクロン (図 5 aサイト 2)、記録された mEJCs 減少の振幅によってほぼノイズ レベル (図 5 bサイト 2)。記録された EJCs はノイズとほとんど区別できるし、彼らは上昇の段階 (図 5サイト 1 とサイト 2) 長期化しています。
シナプス電流の急速な速度と同様、記録された EJCs と mEJCs に貢献リリース サイトの限られた数は先んじて記録、昇格したシナプスの突然変異体のリリース イベントの正確な検出を可能に。これは明らかに mEJCs complexin null 変異体 (図 6 a) からの録音によって示すことができます。この突然変異体は32自発を大幅に昇格され、したがって細胞内記録 mEJPs が重なり、焦点録音22を正確な使用すると (図 6 b)、他から明確に区別することはできません。自発的なリリース イベント (図 4 a) の検出。
図 5。EJCs と選択したブートンから mEJCs のレコーディングします。(A) 選択したブートン (サイト 1) 上に電極を置くと、ブートン (サイト 2) から移動します。画像表示タグ NMJ 視覚化エピ蛍光 (A.1), 筋線維 (A.2) に電極を記録 CD8 GFP とオーバーレイ (A.3、A.4)、電極を置いたサイト 1 (A.3) またはサイト 2 (A.4). スケール バー = 10 μ m. (B) mEJCs ブートン (サイト 1) から記録された録音ノイズからはっきり顕著であるし、急速な上昇の段階があります。対照的に、mEJCs 2 のサイトから記録を録音ノイズから確実に区別できない、その振幅が行うので、減少しているし、遅い時間コースがあります。(C) の振幅の EJCs ブートン (サイト 1) からの記録を超える EJCs の振幅記録サイト 2 から何倍してもより迅速な反応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。細胞内記録対焦点 macropatch.焦点の録音は、この突然変異体の展示からの細胞内記録 (B) リリースが重なり、確実に検出することはできませんイベント complexin null 変異株 (A)、mEJCs の正確な検出を有効にします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ショウジョウバエでは、シナプス伝達の研究に有利なモデル生物を表します。いくつかの録画設定は、シナプス電位、2 つの電極電圧クランプ33,34, 焦点の macropatch とシナプス電流の録音の細胞内の録音を含む、幼虫 NMJ で使用されています。ここで説明したシナプス電流の録音。後者の手法では、可視化研究でシナプス伝達の正確な定量をことができます。
記述されていたプロトコルの成功は批判的に関心のある分野を明確に視覚化し、電極の作製をカスタマイズする能力に依存します。したがって、品質 DIC の光学系、長い作動距離、火災研磨と電極の曲げのためのカスタマイズされた装置と高倍率の水浸対物レンズ、非常に重要です。
このアプローチの利点は、記録電極の下には、いくつかのシナプスの活動を監視できます。注意してください、ただし、電極の縁の近くに位置する研究は、記録された活動へも一因かもしれません。そのため、実験の間にシール抵抗と同様に、電極の位置は変わらないことが重要です。
単一神経繊維末端の活動を監視する機能は、最新のイメージング技術と潜在的結合できます。たとえば、EJCs と mEJC の焦点のレコーディングと個々 のアクティブ ゾーン35活動の光学的検出を組み合わせること、電気録音の時間分解能と空間分解能光検出、このカップルできます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
NIH グラント R01 MH 099557 でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | - | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | - | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
References
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