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Biology

Mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड उपचार पर ERK सक्रियण के लिए उपसेलुलर अंश

Published: September 25, 2017 doi: 10.3791/56496
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित और संकेतन झरना और phospho-प्रोटीन के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए.

Abstract

Mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (MDPs) Mitochondrial जीनोम के अन्य ज्ञात जीन के भीतर छोटे खुले पढ़ने फ्रेम द्वारा इनकोडिंग रहे हैं कि पेप्टाइड्स के एक नए वर्ग के हैं. MDPs इस तरह के apoptosis से न्यूरॉन्स की रक्षा के रूप में जैविक प्रभाव की एक विस्तृत विविधता है, चयापचय मार्कर में सुधार, और कीमोथेरेपी से कोशिकाओं की रक्षा. Humanin पहले एचडीपी की खोज की थी और एचडीपी परिवार के बीच सबसे अधिक अध्ययन पेप्टाइड है । झिल्ली रिसेप्टर्स और बहाव humanin के मार्ग संकेत ध्यान से विशेषता है । अतिरिक्त MDPs जैसे MOTS-सी और SHLP1-६ का हाल ही में पता चला है और सिगनल तंत्र का अभी तक आविर्भाव हुआ है. यहाँ हम एक सेल संस्कृति आधारित विधि का वर्णन करने के लिए इन पेप्टाइड्स के समारोह का निर्धारण. विशेष रूप से, पश्चिमी सोख्ता के साथ संयोजन में सेल भिन्नीकरण तकनीक सक्रियण और महत्वपूर्ण संकेतन अणु के translocation के मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं । जबकि वहां कोशिका अंश के अंय तरीके हैं, एक यहां वर्णित एक आसान और सरल तरीका है । इन विधियों का उपयोग इन पेप्टाइड्स और अन्य चिकित्सीय एजेंटों की कार्रवाई के तंत्र को आगे स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है ।

Introduction

उभरते अध्ययनों से पता चलता है कि mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (MDPs) cytoprotection और चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1,2,3. MDPs की उपस्थिति में संकेत transduction मार्ग को समझना हमें तंत्र में अंतर्दृष्टि देता है जिसके द्वारा MDPs विभिंन कार्यों को मिलाना । पहली पहचान एचडीपी, humanin, extracellular संकेत को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है-विनियमित कळेनासे 1/2 (ERK1/2) इसके रिसेप्टर बाइंडिंग4,5के माध्यम से फास्फारिलीकरण. हालांकि, ERK1/2 सक्रियण के बहाव के प्रभाव अभी भी पता लगाया है ।

ERK1/2 झरना प्रसार, सेल प्रवास, सेलुलर चयापचय, अस्तित्व, और apoptosis6,7,8सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में एक आवश्यक मध्यस्थ के रूप में कार्य करता है । इन सभी अलग सेलुलर प्रक्रियाओं आर्केस्ट्रा, ERK1/2 के गतिविधि और सेलुलर स्थानीयकरण कसकर phosphatases और पाड़ प्रोटीन9,10द्वारा विनियमित रहे हैं । अनुवाद के बाद संशोधन के अलावा, गतिशील गढ़शंकर के ERK1/2 भी अपने संकेतन समारोह, गतिविधि, और विशिष्टता11,12को नियंत्रित करता है । ERK1/2 cytosol13में मुख्य रूप से स्थानीयकृत है । एंकरिंग और पाड़ प्रोटीन का एक सेट cytoskeletal तत्वों में ERK1/2 बनाए रखने में मदद, organelles की सतह पर, या कोशिका13में फैलाना । उत्तेजना पर, ERK1/2 phosphorylated है और अपने लंगर प्रोटीन से असंबद्ध हो जाता है, ERK1/2 के नाभिक, mitochondria, Golgi, और lysosomes सहित अंय उपसेलुलर डिब्बों को translocation की अनुमति14, 15 , 16.

हालांकि humanin ERK1/2 संकेतन मार्ग सक्रिय करने के लिए जाना जाता है, ERK1/2 के सक्रियण केवल कुल सेल lysates में मनाया जाता है । जैसा कि पहले वर्णित है, के बाद से ERK1/2 उपसेलुलर स्थानीयकरण इसके बहाव प्रभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, दोनों के उपसेलुलर स्थानीयकरण और phosphorylated ERK1/2 के कुल स्तर का विश्लेषण एक व्यापक समझ प्रदान करने के लिए आवश्यक है humanin-प्रेरित ERK1/2 सक्रियण और अनुप्रवाह लक्ष्य के सक्रियकरण ।

सक्रिय ERK1/2 के लक्ष्य organelles को समझने के लिए, उपसेलुलर आंशिक phosphorylated ERK1/2 के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया गया था । यह विधि आसानी से लागू किया जा सकता है के रूप में यह मानक प्रयोगशाला उपकरण और रिएजेंट का इस्तेमाल । पृथक उपसेलुलर डिब्बों उच्च शुद्धता के हैं, की अनुमति परिणाम स्पष्ट रूप से व्याख्या की है । ERK1/2 के Immunostaining समान परिणाम उत्पंन कर सकते हैं । हालांकि, कुछ उपसेलुलर डिब्बों को कल्पना और विशेष निर्धारण और permeabilization तरीकों की आवश्यकता के लिए अपेक्षाकृत कठिन हैं । ERK1/2 स्तर उपसेलुलर डिब्बों में बदलती हैं, और इस भिंनता झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक संकेतों के कारण जब पूरे सेल lysates देख सकता है । इसलिए, एक immunoblot पृथक उपसेलुलर डिब्बों का उपयोग कर हमें ERK1/2 स्थानीयकरण की एक बेहतर समझ देता है ।

इस विधि की बहुमुखी प्रतिभा को अंय MDPs या STAT3 जैसे अंय संकेत अणुओं के translocation सहित अंय उत्तेजक के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल के संशोधनों को सक्षम बनाता है । हाल ही में छोटे humanin की खोज की तरह पेप्टाइड्स (SHLPs) 16S rRNA क्षेत्र जहां humanin इनकोडिंग है से इनकोडिंग रहे हैं, और वे इसी तरह लेकिन अलग गुण है हेमवती17की तुलना में । उदाहरण के लिए, SHLP2 और SHLP3 सक्रिय ERK1/2 के बाद 8 ज हालांकि humanin 5 मिनट के भीतर ERK1/2 के ERK1/अलग पेप्टाइड के उत्तर में हमें इन पेप्टाइड्स के जीव विज्ञान के एक बेहतर समझ दे देंगे. उभरते सबूत से पता चला है कि संकेत अणुओं के सेलुलर स्थानीयकरण उनके बहाव के प्रभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, STAT3 परंपरागत रूप से कोशिकाओं को आराम में cytosol में स्थानीयकृत जाना जाता है, और फिर यह नाभिक में translocates के जवाब में जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए साइटोकिंस18. STAT3 ने टीसीए चक्र और एटीपी प्रोडक्शन19को mitochondria और विनियमित करने का भी translocates । autophagy विनियमन के बारे में, STAT3 के विभिन्न उपसेलुलर स्थानीयकरण विभिन्न तरीकों से20में autophagy संग्राहक. उदाहरण के लिए, नाभिकीय STAT3 transcriptionally autophagy-संबंधी जीन को नियंत्रित करता है और एक autophagy संग्राहक के रूप में कार्य करती है । Cytoplasmic STAT3 constitutively autophagy संकेत अणुओं के साथ बातचीत से autophagy रोकता है । Mitochondrial STAT3 रोकता है और oxidative तनाव प्रेरित autophagy दबा द्वारा mitophagy रोकता है । इसलिए, इस उपसेलुलर डिब्बा अलगाव विधि अंय संकेत अणुओं की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और साथ ही ERK1/

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. कोशिकाओं को पेप्टाइड उपचार

  1. प्लेट २,०००,००० श-SY5Y या HEK293 कोशिकाओं (2 x 10 6 ) एक 10 सेमी डिश में और उन्हें 2 दिनों के लिए विकसित
  2. (वैकल्पिक) अगले दिन, कोशिकाओं को सीरम मुक्त Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मीडिया एक बार और सीरम मुक्त DMEM के साथ रात भर अगर उपचार की जरूरत है सीरम मुक्त मीडिया में किया जाना है ।
    3. 3 दिन पर
  3. , S14G-humanin पेप्टाइड्स में ०.२ & #181; मी फ़िल्टर, आसुत जल, और 1mM स्टॉक समाधान के रूप में उंहें पुनर्गठन ।
    नोट: पेप्टाइड्स उपयुक्त विलायक में भंग किया जाना चाहिए, जो पेप्टाइड के अनुक्रम विशेषताओं द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ( उदा , समग्र प्रभार) और निर्माता द्वारा प्रदान किया जा सकता है अगर पेप्टाइड्स व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । उदाहरण के लिए, S14G-humanin, SHLP2, और SHLP6, और MOTS-सी को पानी में घुल । Aliquot एक उचित मात्रा में पेप्टाइड्स ( जैसे , ५० & #956; L) फ्रीज और गल चक्र से बचने के लिए । एक बार गल जाए, फिर से इनका प्रयोग न करें ।
  4. Aliquot एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पूर्व गर्म सीरम युक्त या सीरम मुक्त मीडिया और कमरे के तापमान 1 मिमी स्टॉक समाधान जोड़ने के लिए यह एक काम एकाग्रता में बनाने के लिए ( उदा , 1 & #181; m, 10 & #181; एम).
  5. कदम से 6 मिलीलीटर पेप्टाइड समाधान के साथ मीडिया की जगह १.४. और समय की उचित मात्रा के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: ERK.
    6. सक्रिय करता है जो अपनी हालत के आधार पर मशीन समय चुनें
< p class = "jove_title" > 2. Cytosol और नाभिक के लिए उपसेलुलर अंश

  1. कोशिकाओं को दो बार धोने के साथ 10 मिलीलीटर बर्फ ठंडा, बर्फ की 5 मिलीलीटर में थाली बंद कोशिकाओं परिमार्जन, और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    2. ।
  2. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक 4 & #176; C.
  3. महाप्राण ने पंजाबियों को फिर से गोली से सस्पेंड कर २०० & #181; बर्फ के एल-कोल्ड, भिन्नीकरण बफर (10 मिमी HEPES पीएच = ७.६, 3 मिमी MgCl 2 , 10 मिमी KCl, 5% (वी/ग्लिसरॉल, 1% गैर ईओण surfactant (सी 13 एच 22 ओ (सी 2 एच 4 ओ) n ), छेड़-छाड़/फॉस्फेट अवरोधकों).
    नोट: अपने फास्फारिलीकरण स्थिति में प्रोटीन रखने के लिए, फॉस्फेट अवरोधक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चिढ़ाने अवरोध करनेवाला हौसले से जोड़ा जाना चाहिए और नमूने हर समय बर्फ पर रखा जाना चाहिए. दोहरा फ्रीज और नमूनों के गल चक्र से बचना चाहिए । Aliquot नमूनों को छोटी राशि में ( उदा ५० & #956; g) जमने से पहले उन पर-८० & #176; C.
  4. गर्मी बर्फ पर पुन: निलंबित गोली 15 मिनट के लिए और फिर २५० पर 5 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक 4 & #176; C.
  5. supernatant को cytoplasmic अंश के रूप में एकत्र करें और गोली को परमाणु अंश के लिए रखें.
  6. supernatant में सेलुलर मलबे और अंय दूषित पदार्थों को हटाने के लिए १८,००० x g पर 10 मिनट के लिए 4 & #176; C और फिर supernatant को एक नए microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरित करें । यह cytosol अंश है.
  7. २०० में गोली reसस्पेंड & #956; एल आइस-कोल्ड वॉश बफर (10 मिमी HEPES पीएच = ७.६, १.५ mm MgCl 2 , ४२० mm NaCl, 25% (v/v) ग्लिसरॉल, ०.२ mm EDTA, टीज़ेड/फॉस्फेट अवरोधकों) और 5 मिनट के लिए २५० x g पर 4 & #176; C
  8. निकालें supernatant और १०० & #956 में गोली reसस्पेंड; एल बर्फ-शीत, परमाणु निष्कर्षण बफर (20 मिमी HEPES पीएच = ७.६, १.५ मिमी MgCl 2 , ४२० मिमी NaCl, 25% (वी/वी) ग्लिसरॉल, ०.२ mm EDTA, चिढ़ाना/फॉस्फेट अवरोधकों) और sonicate 10 बार (5 एस पर, 10 एस बंद, 30% amp.) पर ice.
  9. केंद्रापसारक पर १८,००० x g के लिए 10 मिनट में 4 & #176; C.
  10. supernatant को एक नए microcentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करते हैं । यह परमाणु अंश है.
  11. एक बीसीए परख
का उपयोग प्रोटीन राशि यों < p class = "jove_title" > 3. क्रूड Mitochondrial अंश

  1. प्रत्येक 10 सेमी डिश में कोशिकाओं को धो लें 10 मिलीलीटर बर्फ के साथ ठंडे पंजाबियों, 5 मिलीलीटर बर्फ ठंडा पंजाबियों जोड़ें, और एक सेल खुरचनी का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग ।
    नोट: पश्चिमी सोख्ता के लिए mitochondria की एक अच्छी उपज प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं के ३ १० cm व्यंजन का प्रयोग करें ।
  2. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण, और १ १५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ३ १० सेमी व्यंजन से सभी गठबंधन ।
  3. के लिए ६०० x g पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं केंद्रापसारक 4 & #176; C.
  4. महाप्राण और फिर से गोली को निलंबित बर्फ के 1 मिलीलीटर-शीत mitochondria अलगाव बफर (10 मिमी Tris-MOPS, 1 मिमी EGTA/Tris, २०० mm सुक्रोज, को समायोजित करने के लिए पीएच = ७.४) ।
  5. Homogenize एक 2 मिलीलीटर homogenizer के 25 स्ट्रोक के साथ कोशिकाओं को बर्फ पर polytetrafluoroethylene लेपित खल के साथ ।
    नोट: यह चरण mitochondrial अखंडता बनाए रखने और mitochondrial अंश की प्राप्ति को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए स्ट्रोक्स की संख्या ऑप्टिमाइज़ की जानी चाहिए । प्रक्रिया शुरू करने से पहले homogenizer शांत ।
  6. एक microcentrifuge ट्यूब करने के लिए homogenate हस्तांतरण और यह ६०० x g पर 10 मिनट के लिए 4 & #176; C नाभिक और अटूट कोशिकाओं को दूर करने के लिए.
  7. इकट्ठा supernatant, यह एक नया microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण, और यह ७,००० x g पर 10 मिनट के लिए 4 & #176 पर केंद्रापसारक; C.
    नोट: गोली ढीला है, देखभाल के साथ supernatant इकट्ठा और गोली परेशान करने की कोशिश नहीं.
  8. निकालें supernatant, फिर से गोली से सस्पेंड २०० & #956; आइस-कोल्ड mitochondria आइसोलेशन बफ़र के एल, और समाधान एक नया microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । ७,००० x पर 10 मिनट के लिए जी पर ट्यूब केंद्रापसारक 4 & #176; C.
  9. दोहराने चरण ३.८ गोली धोने के लिए । यह आवश्यक नहीं है कि इस चरण में एक नए microcentrifuge ट्यूब पर supernatant का अंतरण हो.
  10. धो गोली से supernatant निकालें और फिर से mitochondria युक्त गोली निलंबित ५० & #956; L के RIPA बफर.
  11. 10 min.
    12. के लिए बर्फ पर निलंबन की मशीन
  12. 15 मिनट के लिए १६,००० x g पर निलंबन केंद्रापसारक 4 & #176; C.
  13. supernatant को एक नए microcentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करते हैं । यह mitochondrial अंश है.
  14. एक बीसीए परख का उपयोग प्रोटीन राशि यों तो बढ़ाता है ।
< p class = "jove_title" > 4. Phospho-विशिष्ट प्रोटीन्स के लिए वेस्टर्न सोख्ता

  1. एक एसडीएस-polyacrylamide जेल ट्रो (8-16% बनाए गए जेल) प्रदर्शन और प्रोटीन एक PVDF झिल्ली < सुप वर्ग = "xref" > 4 .
  2. TBST में 5% BSA के साथ झिल्ली की मशीन (०.१% Polysorbate 20) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पृष्ठभूमि गैर विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक करने के लिए ।
    नोट: phosphorylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए, BSA नहीं दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक । दूध कैसिइन, प्रचुर मात्रा में phosphoprotein, जो उच्च विशिष्ट संकेत में परिणाम होता है ।
  3. में प्राथमिक एंटीबॉडी (anti-phospho-ERK1/2) के साथ झिल्ली को 4 & #176; ग रात भर.
  4. अगले दिन, TBST (०.१% polysorbate 20) के साथ झिल्ली धो कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए तीन बार ।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली गर्मी (विरोधी खरगोश एचआरपी) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
  6. TBST (०.१% polysorbate 20) के साथ झिल्ली धोने के कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए तीन बार ।
  7. ECL समाधान के साथ झिल्ली की मशीन और छवि विश्लेषक में झिल्ली छवि ।
  8. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अलग करना बफर के साथ झिल्ली पट्टी और TBST के साथ झिल्ली धो 5 मिनट के लिए तीन बार.
  9. दोहराएँ चरण ४.२ का उपयोग करते हुए ४.७ एंटी-टोटल ERK1/2 एंटीबॉडी.
  10. प्रत्येक अंश की शुद्धता की जांच करने के लिए, एसडीएस-पृष्ठ चलाने और प्रत्येक डिब्बे के लिए एंटीबॉडी पहचानने मार्कर का उपयोग कर immunoblots प्रदर्शन ( जैसे , नाभिक के लिए लामिन B1, GAPDH के लिए cytosol, TOM20 के लिए mitochondria).

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का प्रयोग, हम 1 माइक्रोन और १०० माइक्रोन S14G-humanin, एक शक्तिशाली humanin अनुरूप21के साथ HEK293 और एसएच-SY5Y कोशिकाओं का इलाज किया, क्रमशः, संकेत दिया समय अवधि के लिए पूरा मीडिया में (चित्रा 1एक और चित्रा 1 ख). हम तो कुल प्रोटीन के अर्क से२०२/Tyr२०४ पर ERK1/2 के योग और phosphorylated फार्म की जांच की । S14G-humanin उपचार अपने विनियामक २०२/Tyr २०४ साइट पर ERK1/2 के फास्फारिलीकरण में वृद्धि दिखाई । ERK1/2 के उपसेलुलर स्थानीयकरण, विशेष रूप से अपनी विशिष्टता प्राप्त करने में इसके संकेतन समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । S14G-humanin-मध्यस्थता ERK1/2 सक्रियण के लक्ष्य को समझने के लिए, हम कुल और phosphorylated ERK1 के उपसेलुलर स्थानीयकरण का विश्लेषण किया S14G-humanin उपचार के बाद । HEK293 कोशिकाओं में, phosphorylated ERK दोनों कोशिका और नाभिक में वृद्धि हुई है, लेकिन mitochondria (चित्रा 2ए) में नहीं । दिलचस्प है, phosphorylated ERK कोशिका, नाभिक में कमी आई, और एसएच में mitochondria-SY5Y कोशिकाओं (चित्रा 2बी) । ये परिणाम सुझाते है कि S14G-humanin-मध्यस्थ ERK फास्फारिलीकरण भिंन कक्ष प्रकार और विभिंन स्थितियों में भिंन भूमिका निभा सकता है । इसलिए, आगे के अध्ययनों से S14G के स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हैं-humanin-मध्यस्थता फास्फारिलीकरण के ERK1/2 अन्य उपसेलुलर डिब्बों में, के रूप में phosphorylated ERK1/2 translocates में नाभिक, mitochondria, endosomes/lysosomes, और विभिंन झिल्ली ।

Figure 1
चित्र 1: S14G-humanin HEK293 और श-SY5Y कोशिकाओं में ERK1/2 की फास्फारिलीकरण बढ़ जाती है । ठहराव और ERK सक्रियण के प्रतिनिधि पश्चिमी दाग (A) HEK293 और (B) SH-SY5Y कक्ष । कुल सेल lysates (A) 1 µ m या (B) १०० µ m S14G-humanin उपचार DMEM में संकेत समय अवधियों के लिए 10% FBS के साथ अनुपूरक immunoblotted-phospho और कुल-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) का उपयोग कर रहे थे । इस आंकड़े को किम एट अल से संशोधित किया गया है । 4 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: Phosphorylated ERK1/2 cytosol, नाभिक, और humanin और एसएच-HEK293 कोशिकाओं में S14G-SY5Y उपचार पर अन्य उपसेलुलर डिब्बों के लिए स्थानीयकृत है । प्रतिनिधि पश्चिमी ERK1/2 उपसेलुलर स्थानीयकरण दिखा दाग (n = 3) । (क) HEK293 कोशिकाओं को १ µ मीटर S14G-humanin से उपचारित किया गया. Cytosolic (15 µ g), परमाणु (15 µ g और ५० µ g), और mitochondrial (15 μg) lysates immunoblotted-और कुल-phospho ERK का उपयोग कर रहे थे । (ख) एसएच-SY5Y कोशिकाओं को १०० µ मीटर S14G-humanin से उपचारित किया गया. Mitochondrial अंश S14G-humanin उपचार के बाद 30 मिनट प्राप्त किए गए थे । Cytosolic, परमाणु, और mitochondrial (15 µ g) lysates immunoblotted-और कुल-phospho ERK का उपयोग कर रहे थे । विरोधी GAPDH, विरोधी लामिन बी, विरोधी Tom20 एंटीबॉडी क्रमशः cytosolic, परमाणु, mitochondrial अंश मार्करों, के रूप में इस्तेमाल किया गया । इस आंकड़े को किम एट अल से संशोधित किया गया है । 4. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Table 1
तालिका 1: cytosol, नाभिकीय और Mitochondrial भिंन के लिए बफ़र्स.

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Discussion

यहाँ, हम प्रदर्शन किया कि humanin पेप्टाइड-मध्यस्थता ERK1/2 सक्रियण दो भिन्न प्रकार के कक्ष में होता है, और सक्रिय ERK1/2 के उपसेलुलर स्थानीयकरण शर्तों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं (जैसे, खुराक पेप्टाइड, समय बिंदु और कक्ष प्रकार) । यह दिखाया गया है कि दो अलग रिसेप्टर्स के माध्यम से humanin संकेतों22,23, जो दो सेल लाइनों के बीच संकेत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से humanin की अलग खुराक के लिए आवश्यकता में अंतर समझा सकता है. इस के शारीरिक निहितार्थ पूरी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है लेकिन यह हेमवती के लिए ऊतक निर्भर प्रतिक्रियाओं के लिए एक संभव प्रणाली का सुझाव हो सकता है ।

फास्फारिलीकरण की ERK1/2 ERK1 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और ERK1/2 के फास्फारिलीकरण स्थिति गतिशील परिवर्तन दिखाता है । यह करने के लिए जब ERK1/2 एक विशिष्ट स्थिति के तहत phosphorylated है खोजने के लिए शर्तों का अनुकूलन महत्वपूर्ण/ इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, विभिंन उत्तेजना शर्तों (जैसे, खुराक और मध्यम) की कोशिश करो और समय पाठ्यक्रम आचरण को खोजने के लिए जब फास्फारिलीकरण के उच्चतम स्तर हासिल की है । अध्ययन के बहुमत केवल कुल सेल lysates में ERK1/2 फास्फारिलीकरण पर ध्यान केंद्रित किया है । हालांकि, परिणाम ERK1/2 के रूप में सीमित कार्यात्मक जानकारी प्रदान कर सकते है विभिंन लक्ष्यों के साथ बातचीत और विशिष्ट उपसेलुलर डिब्बों में अलग बहाव झरने मिलाना । इसलिए, phosphorylated ERK1/2 के उपसेलुलर स्थानीयकरण की जांच ERK1/2 सक्रियण की भूमिका का एक बेहतर समझ देता है ।

ERK1/2 सक्रियण के बाद उपसेलुलर भिन्नीकरण आगे के अध्ययन के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (उदा., सह immunoprecipitation) उपंयास बहाव लक्ष्य की पहचान करने के लिए क्योंकि उपसेलुलर अंश ERK1 के बहाव के लक्ष्य के लिए समृद्ध कर सकते हैं/ इस विधि अंय संकेत अणुओं है कि स्थितियों के अनुकूलन के बाद उत्तेजनाओं पर विभिंन उपसेलुलर डिब्बों में translocated है के लिए लागू किया जा सकता है ।

यद्यपि mitochondria को अलग करने के विभिन्न तरीकों को पिछले दशकों में प्रस्तावित किया गया है, वहीं अन्य उपसेलुलर डिब्बों से आंशिक संदूषण है. यहां प्रस्तावित क्रूड mitochondrial आइसोलेशन पद्धति में भी कोशिका संदूषणों की सीमित मात्रा होती है । के रूप में संदूषण की मात्रा छोटा है, हम मानते है कि यह अभी भी सक्रियण पर mitochondria में ERK1/2 के स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए एक वैध तरीका है । के रूप में पेप्टाइड समाधान में जरूरी स्थिर नहीं कर रहे हैं, यह कई बार प्रयोगों के बीच निरंतरता बनाए रखने के लिए मुश्किल है । स्थिर-गल प्रभाव से बचने के लिए और पेप्टाइड गतिविधि की निरंतरता में सुधार करने के लिए पेप्टाइड समाधान के छोटे aliquots बनाने के लिए सुनिश्चित करें ।

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Disclosures

Pinchas कोहेन एक शेयरधारक और CohBar के लिए सलाहकार है, inc केल्विन येन CohBar, inc के लिए एक सलाहकार के रूप में सेवा की है

Acknowledgments

यह काम उंर बढ़ने अनुसंधान कार्यक्रम में SJK को एक एलिसन/अफर Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, और एक ग्लेन फाउंडेशन पुरस्कार और पीसी के लिए NIH अनुदान (1P01AG034906, 1R01GM ०९०३११, 1R01ES ०२०८१२) । सभी लेखक फिल्म में दिखाई देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p44/42 MAPK (ERK1/2) Cell signaling 9102 Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) Cell signaling 4370 Dilution 1:1,000
Lamin B1 Cell signaling 12586 Nuclear Marker, Dilution 1:1,000
GAPDH Cell signaling 5174 Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000
Tom20 Santa cruz SC-17764 Mitochondria marker, Dilution 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugated Cell signaling 7074 Dilution 1:30,000
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 89900
100 mm Culture Dish ThermoFisher SCIENTIFIC 12556002
HNG peptide Genescript
25mm sylinge filter ThermoFisher SCIENTIFIC 09-719A
HEPES Sigma H3375
MgCl2 Sigma M8266
KCl Sigma P9333
Glycerol Sigma G9012
Triton X-100 ThermoFisher SCIENTIFIC BP151-100
EDTA Sigma 3609
MOPS Sigma M1254
EGTA Sigma E3889
Sucrose Sigma S7903
Tris-base ThermoFisher SCIENTIFIC BP152-1
HCL Sigma H1758
PBS Lonza 17-512F
Cell Scraper FALCON 353085
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) ThermoFisher SCIENTIFIC 78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles Thomas Scientific 3432S90
Tween-20 ThermoFisher SCIENTIFIC BP337-500
BSA ThermoFisher SCIENTIFIC BP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BIO RAD 4561104
Mini Trans-Blot Module BIO RAD 1658030
Trans-Blot Turbo Transfer System BIO RAD 1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit BIO RAD 1704272
Clarity Western ECL Blotting Substrates BIO RAD 1705060
Restore Western blot stripping buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 21059
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher SCIENTIFIC 11965-092
Sonicator, Medel: FB120 ThermoFisher SCIENTIFIC 695320-07-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
  2. Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
  3. Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
  4. Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
  5. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  6. Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
  7. Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).
  8. Cagnol, S., Chambard, J. -C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
  9. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  10. Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
  11. Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
  12. Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
  13. Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
  14. Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
  15. Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
  16. Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
  17. Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
  18. Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
  19. Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
  20. You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
  21. Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
  22. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  23. Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).

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सेलुलर जीवविज्ञान १२७ अंक Mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (MDPs) ERK mitochondria भिन्नीकरण पेप्टाइड उपचार cytosol और नाभिक भिन्नीकरण फास्फारिलीकरण
Mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड उपचार पर ERK सक्रियण के लिए उपसेलुलर अंश
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Kim, S. J., Xiao, J., Cohen, P.,… More

Kim, S. J., Xiao, J., Cohen, P., Yen, K. Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment. J. Vis. Exp. (127), e56496, doi:10.3791/56496 (2017).

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