Summary
このプロトコルでは、ミトコンドリア由来ペプチドと細胞を刺激し、シグナル伝達カスケードとリン蛋白質の局在化を評価する方法について説明します。
Abstract
ミトコンドリア由来ペプチド (MDPs) は、ミトコンドリアのゲノムの他の知られている遺伝子の中で小型の開いたリーディング ・ フレームによってエンコードされているペプチドの新しいクラスです。MDPs は、アポトーシスからニューロンを保護する、代謝マーカーの改善、化学療法から細胞を保護するなどの生物学的効果のさまざまながあります。Humanin 発見される最初の民主党、民主党の家族の間で最も研究のペプチド。膜受容体と humanin の下流のシグナル伝達経路を慎重に特徴づけられています。MOTS c など SHLP1 6 追加 MDPs を最近発見されているし、シグナリング メカニズムは解明することいません。ここでこれらのペプチドの機能を決定する細胞文化ベース手法について述べる。特に、西部のしみとの組み合わせでのセル分別の技術の活性化の定量及び重要なシグナル伝達分子の転流を可能にします。セル分別の他の方法がありますが、ここで説明は簡単でわかりやすい方法です。さらにこれらのペプチドとその他の治療薬の作用メカニズムを解明するため、これらのメソッドを使用できます。
Introduction
新興の研究は、ミトコンドリア由来ペプチド (MDPs) がより, および代謝の1,2,3で重要な役割を果たすことを示しています。MDPs の存在下での信号伝達経路を理解する MDPs は様々 な機能を調節するメカニズムへの洞察力をくれます。最初の識別された民主党、humanin、細胞外シグナル調節キナーゼ 1/2 (ERK1/2) を増加する示されているバインド4,5その受容体をリン酸化します。しかし、ERK1/2 活性化の下流の効果はまだエコイノベーションです。
ERK1/2 カスケードは、さまざまな増殖、細胞遊走、細胞代謝、生存、およびアポトーシス6,7,8を含む細胞プロセスで重要な仲介者として機能します。すべてを調整するには、これらの明瞭な細胞プロセス、アクティビティ、ERK1/2 の細胞内局しっかりとホスファターゼと足場蛋白質9,10によって規制されました。翻訳後修飾に加えて ERK1/2 の動的往復もそのシグナル伝達関数、アクティビティ、および特異性11,12を調節します。ERK1/2 は主に細胞質13でローカライズされます。一連のアンカーと足場蛋白質の細胞小器官の表面や細胞質13で拡散の骨格要素の ERK1/2 を維持するため。刺激、ERK1/2 リン酸化、ERK1/2 核、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム14,を含む他の細胞内コンパートメントへの転流をできるようにそのアンカリングのタンパク質から解離になります。15,16。
Humanin ERK1/2 シグナル伝達経路をアクティブに知られているが、合計のセル lysates においてのみ ERK1/2 の活性化です。リン酸化 ERK1/2 は包括的な理解を提供するために必要な ERK1/2 内局その波及効果, 両方の細胞内局在の解析とのレベルの合計の重大な役割を果たしているので前述のようhumanin ERK1/2 活性化の下流ターゲットのアクティブ化。
アクティブ ERK1/2 ターゲット細胞内小器官を理解するには、リン酸化 ERK1/2 ウェスタンブロッティング続いて細胞レベル下の分別を行った。このメソッドは、これは標準的な実験装置および試薬を活用して簡単に実装することができます。孤立した細胞内コンパートメントは、高純度、結果を素直に解釈することができます。ERK1 染色/2 似たような結果が生じる。ただし、特定の細胞内コンパートメントは視覚化する、特別な固定・透過方法を必要とする比較的難しいです。ERK1/2 レベル細胞レベル下コンパートメントによって異なり、全体のセル lysates を見ている時、この変化が原因で、偽陽性と偽否定的な信号。したがって、ERK1/2 ローカリゼーションの理解も、イムノブロット分離細胞レベル下コンパートメントを使用してくれます。
メソッドの汎用性により、他 MDPs STAT3 など他のシグナリング分子の転流を含む他の興奮剤の効果を調査するためのプロトコルの変更です。最近発見された小さな humanin のようなペプチド (SHLPs) は 16S rRNA 地域どこ humanin がエンコードされていると HN17と比較して似ていますが、異なるプロパティがあるからエンコードされます。たとえば、SHLP2 と SHLP3 は 8 h humanin 内局在 ERK1/2 の異なるペプチドへの応答で審査 5 分以内 ERK1/2 がアクティブになりますを与える私たちこれらのペプチドの生物学のよりよい理解後、ERK1/2 をアクティブにします。出現の証拠は、シグナル分子の細胞内の局在が彼らの下流の効果の重要な役割を果たしていることを示した。例えば、STAT3 が伝統的静止期細胞の細胞質でローカライズされる主に知られているが、それがサイトカイン18への応答における遺伝子発現をアクティブにする核に移行します。STAT3 はまたミトコンドリアに移行し、TCA サイクル、ATP 生産19を調節します。オートファジー規制に関する STAT3 の異なる細胞内局は、さまざまな方法20でオートファジーを変調します。たとえば、核 STAT3 は転写オートファジー関連遺伝子の発現制御し、オートファジーの変調器として機能します。細胞質の STAT3 恒常オートファジー シグナル分子との相互作用によってオートファジーを抑制します。ミトコンドリア STAT3 阻害し、酸化ストレス誘導されるオートファジーを抑制することによって mitophagy を防ぐことができます。したがって、この細胞レベル下コンパートメントの分離方法は他シグナリング分子、ERK1/2 の役割を理解するために重要です。
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Protocol
1 セルにペプチド治療
- プレート 200 万 SH SY5Y または HEK293 細胞 (2 x 10 6) 10 cm に皿、2 日間のそれらを育てる
- (省略可能) 次の日、無血清ダルベッコとセルを洗浄して ' s 更新。イーグル培地 (DMEM) メディアの一度と無料 DMEM 治療血清無料メディアで実行する必要がある場合は一晩血清 incubate 。
- 3 日目、0.2 μ m フィルター、蒸留水、1 mM 原液としてそれらを再構成 S14G humanin ペプチドを溶解します
。 注: ペプチドは、ペプチド (例えば、全体の電荷) のシーケンスの特性によって決定されることができます、場合は市販されているペプチドに製造元が提供可能性があります適切な溶媒で溶解する必要があります。たとえば、S14G humanin、SHLP2、および SHLP6、および MOTS c は水に溶かします。因数の凍結を避けるために、解凍サイクル適切なボリューム (例えば、50 μ L) 中のペプチド。解凍後、それらを使用しないでもう一度 。
- に予め温めておいた血清含有の約数または血清の自由な媒体 50 mL コニカル管、室温 1 mM 原液使用濃度 (例えば、1 μ M、10 μ M) に参加することを追加します 。
- 1.4 のステップから 6 mL ペプチド ソリューションとメディアを交換しますセル間インキュベート時間の適切な量と。
。 注: ERK をアクティブにあなたの条件に応じてインキュベーション時間を選択します 。
2。細胞質と核の細胞レベル下の分別
- 10 mL の氷冷 PBS で 2 回細胞を洗浄、5 ml の氷冷 PBS のプレートから細胞をこすり、細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します 。
- 4時 5 分 500 x g で細胞を遠心分離機 ° C
- PBS を吸引し、氷、分別バッファーの 200 μ L でペレットを再停止 (10 mM HEPES pH 7.6, 3 mM MgCl 2、10 mM KCl, 5% (v/v) グリセロール 1% 非イオン性界面活性剤 (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) =n) プロテアーゼ/ホスファターゼの抑制剤).
注: のリン酸化状態で蛋白質を維持するには、ホスファターゼ阻害剤同様のプロテアーゼ阻害剤をたてに追加するか、サンプルがまったくの氷で保たれるべきである回します。凍結と融解を繰り返しサンプルのサイクルは避けるべきであります。-80 でそれらを固定する前に少量 (例えば 50 μ g) に割り切れるサンプル ° C - 15 分間氷の上再懸濁のペレットをインキュベートし、4時 5 分 250 × g で遠心分離 ° C
- 細胞質画分として清を収集し、核分画用ペレット 。
- は、細胞残渣および 4 ° C で 10 分間、18,000 × g で他の汚染物質を削除し、新しい微量遠心チューブに上清を転送上清を遠心分離機します。これは細胞質分画.
- 200 μ L 冷たい洗浄バッファーでペレットを再懸濁します (10 mM HEPES pH = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM の NaCl、25% (v/v) グリセロール、0.2 ミリメートルの EDTA、プロテアーゼ/ホスファターゼの抑制剤) と 250 x g で 4 ° C で 5 分間遠心
- 上澄みを除去し、100 μ L 冷たい、核抽出バッファーでペレットを再懸濁します (20 mM HEPES pH = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM の NaCl、25% (v/v) グリセロール、0.2 ミリメートルの EDTA、プロテアーゼ/ホスファターゼの抑制剤) と超音波照射 10 回 (5 s、10 sオフ、30% アンプです。)氷の
- 4 ° C で 10 分間 18,000 × g で遠心します。
- は、新しい微量遠心チューブに上清を転送します。これは核分画.
- BCA アッセイを用いたタンパク質の量を定量化するため
3. 粗ミトコンドリア分画
- 各 10 cm 皿 10 mL の氷冷 PBS のセルを洗浄、5 mL の氷冷 PBS を追加および細胞スクレーパーを使用してセルをデタッチします
。 メモ: 西部のしみが付くことのミトコンドリアの良好な収率を取得するセルの 3 つの 10 cm 皿を使用しています 。
- 細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送し、1 つ 15 ml の円錐管に 3品 10 cm からすべて結合します 。
- 4時 10 分 600 x g で細胞を遠心分離機 ° C
- 、PBS を吸引し、冷たいミトコンドリア分離バッファーの 1 mL にペレットを再中断 (10 mM トリス-モップ 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸/トリス、200 mM ショ糖、ph 調整 = 7.4).
- 氷の四フッ化エチレン樹脂コーティング杵と 2 mL ホモジナイザーの 25 のストロークを持つ細胞をホモジナイズしてください
注: この手順は、ミトコンドリアの整合性を維持し、ミトコンドリア画分の収量を最大化するために重要です。セル タイプごとにストローク数を最適化する必要があります。手順を開始する前に、ホモジナイザーを precool. - 微量遠心チューブにホモジュネートを転送し、核と切れ目のない細胞を削除する 4 ° C で 10 分間 600 × g で遠心分離機します 。
- 、上澄みを集め、新しい遠心管にそれを転送、4時 10 分 7,000 x g で遠心分離機のそれ ° C
注: ペレットが緩んで、注意して上澄みを集め、ペレットを邪魔しないようにします 。
- は、上澄みを除去、再ペレットを冷たいミトコンドリア分離バッファー 200 μ l を中断し、ソリューションを新しい微量遠心チューブに転送します。4時 10 分 7,000 x g でチューブを遠心分離機 ° C
- ペレットを洗浄する 3.8 手順を繰り返します。この手順では、新しい微量遠心チューブに上清を転送する必要はありません 。
- 洗浄のペレットから上澄みを除去し、50 μ L RIPA バッファーのミトコンドリアを含む餌を再停止します 。
- 加温 10 分間氷の上の懸濁液
- 4時 15 分 16,000 x グラムの懸濁液を遠心分離機 ° C
- は、新しい微量遠心チューブに上清を転送します。これはミトコンドリアの一部です 。
- BCA アッセイを用いた蛋白質量を定量化します 。
4。リン酸化型特異タンパク質ウエスタンブロット
- SDS ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (あらかじめ作られた 8-16% ゲル) を行い、PVDF 膜 4 に蛋白質を転送します 。
- インキュベート TBST で 5 %bsa を用いた膜 (0.1% ポリソルベート 20) 背景非特異的結合部位をブロックする室温で 30 分間
。 注: リン酸化タンパク質検出用 BSA ないミルクの膜をブロックします。ミルクにはカゼイン、豊富なリン蛋白質、高い非特異的シグナルの結果が含まれています 。
- 4 ° C で一次抗体 (抗-リン-ERK1/2) と膜を一晩インキュベートします 。
- 次の日洗って tbst 膜 (0.1% ポリソルベート 20) 室温で 5 分間を 3 回します 。
- 膜二次抗体 (抗家兎 HRP) 室温で 1 時間インキュベートします 。
- Tbst 膜を洗って部屋の温度で 5 分間を 3 回 (0.1% ポリソルベート 20).
- ECL ソリューションと膜をインキュベートし、画像解析装置の膜をイメージします 。
- 室温で 5 分間 3 回 tbst 膜の洗浄 15 分の除去バッファーと膜のストリップ
- 4.7 4.2 反合計 ERK1/2 抗体を使用して手順を繰り返します 。
- 、各分画の純度を確認する SDS ページを実行し、各コンパートメントを (例えば、核、細胞質の GAPDH とミトコンドリアの TOM20 ラミン B1) のマーカーを認識する抗体を用いた immunoblots を実行します 。
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Representative Results
ここに示す手順を使用して、我々 は 1 μ M、100 μ M と SH SY5Y HEK293 細胞を扱わ S14G humanin、強力な humanin のアナログ21、それぞれに完成でメディア (図 1A 図 1 の指定された期間B). 木202/Tyr204総蛋白抽出物から、ERK1/2 の全体とリン酸形を検討します。S14G humanin の治療は、その規制木202/Tyr204サイトで ERK1/2 のリン酸化の増加を示した。ERK1/2 の細胞レベル下のローカリゼーションは、その特異性を得ることに特にそのシグナル伝達関数で重要な役割を果たしています。S14G humanin 媒介 ERK1/2 活性化の対象を理解するには、合計の細胞内分布を分析し、, ERK1/2 S14G humanin 治療をリン酸化.HEK293 細胞におけるリン酸化 ERK の両方増加細胞質と核、ミトコンドリア (図 2A) ではないです。興味深いことに、ERK のリン酸化は細胞質、核、および SH SY5Y (図 2B) 細胞内のミトコンドリアで減少しました。その S14G humanin 媒介 ERK のリン酸化は、異なる種類の細胞と異なる条件で異なる役割を果たすことが示唆されました。したがって、それ以上の調査がリン酸化 ERK1/2 核、ミトコンドリア、エンドソーム/リソソームに移行 ERK1/2 他の細胞内コンパートメント S14G humanin 介したリン酸化の局在を解析する必要と各種膜。
図 1:S14G humanin 増加 ERK1/2 HEK293 および SH SY5Y 細胞におけるリン酸化します。HEK293 (A) と (B) SH SY5Y 細胞における ERK の活性化の定量化と代表の西部のしみ。セル lysates の合計以下の (A) 1 μ M または (B) 100 μ M S14G humanin 治療 10 %dmem で示されたため FBS 期間られた抗リン-、合計 ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) を使用しています。この図は、キムらから変更されています。4 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:ERK1/2 のリン酸化は細胞質、核、および SH SY5Y と HEK293 細胞に S14G humanin 治療時に他の細胞内コンパートメントにローカライズされています。ERK1/2 細胞内局在を示す代表的な西部のしみ (n = 3)。(A) HEK293 細胞は 1 μ M を施した S14G humanin。ゾル性細胞質 (15 μ g)、原子力 (15 μ g ・ 50 μ g)、リンと合計 ERK 抗体を用いたミトコンドリア (15 μ g) lysates られたと。(B) SH-SY5Y 100 μ M で細胞が治療された S14G humanin。ミトコンドリア画分 S14G humanin 治療後 30 分が得られました。ゾル性細胞質、核、ミトコンドリア (15 μ g) lysates られたリンと合計 ERK 抗体を用いたします。アンチ GAPDH、アンチ ラミン B 反 Tom20 抗体はそれぞれ細胞質、核、ミトコンドリア分画マーカーとして使用されました。この図は、キムらから変更されています。4.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1:細胞質、核、バッファーとミトコンドリア分画.
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Discussion
ここでは、我々 は実証 humanin ペプチドを介した ERK1/2 活性化は、2 つの異なる細胞型と活性 ERK1/2 の細胞内局は条件 (例えばペプチド、時点、およびセルの線量によって異なることがあります。型)。それはその humanin を示されている 2 つの異なる受容器22,23, humanin の異なる用量の要件と同様に、2 つの細胞間シグナル伝達に違いを説明するかもしれない信号。これの生理学的意味が完全に研究されていないが、それは HN に依存して応答する組織の 1 つの可能なメカニズムを示唆している可能性があります。
ERK1/2 のリン酸化は、ERK1/2 のシグナル伝達に重要な役割を果たしている、ERK1/2 のリン酸化状態はダイナミックな変化を示しています。ERK1/2 で特定の条件/刺激下でリン酸化されるときを検索する条件を最適化することが重要です。このため、異なる刺激条件 (例えば、線量および媒体) をみてリン酸化の最高レベルを達成したときに見つけることの時間コースを実施します。研究の大多数の合計セル lysates の ERK1/2 リン酸化のみを対象します。ただし、ERK1/2 と異なるターゲットと対話したり、特定の細胞内コンパートメントに異なるダウン ストリーム カスケードを調節すると、結果は限られた機能の情報を得られます。したがって、ERK1/2 活性化の役割の理解を与えるリン酸 ERK1/2 の細胞内分布を調べるします。
ERK1/2 活性化後の細胞レベル下の分別は、ERK1/2 の下流標的の細胞レベル下の分別豊かにできるので新たな下流標的を識別するためにさらなる研究 (例えば、co 免疫沈降) のソースとして使用できます。このメソッドは、条件の最適化後刺激時に別の細胞内コンパートメントに転流されて他のシグナリング分子に適用できます。
過去数十年でミトコンドリアを分離するさまざまな方法が提案されている他の細胞内コンパートメントから部分的な汚染があります。粗ミトコンドリア分離手法をここで提案には、限られた細胞質の汚染物質も含まれています。汚染の量が小さく、活性化時にミトコンドリアに ERK1/2 の局在を検出するための有効な方法だと考えています。ペプチドはソリューションでは必ずしも安定ではないと時々 実験間の一貫性を維持することは困難です。必ずペプチド液凍結融解の影響を避けるために、ペプチドの活性の一貫性を保つための小さい因数。
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Disclosures
ピンカス ・ コーエンは株主とコンサルタント、円は CohBar 株式会社のコンサルタントとして役立った CohBar、株式会社ケルビン
Acknowledgments
この作品は、SJK、高齢化研究プログラムでエリソン/遠く員によって支えられた、グレン財団賞と NIH の PC への許可 (1P01AG034906、1R01GM 1R01ES 090311 020812)。映画の中にすべての著者が表示されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
References
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