Summary
הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.
Abstract
תהליכים תאיים ליבה כגון שכפול ה-DNA וסגרגציה, סינתזה של חלבון, ביוסינטזה דופן התא, חלוקת התא להסתמך על תפקידו של חלבונים, המהווה מרכיב חיוני להישרדות החיידק. ניתן להשתמש סדרת צבעי במטרה כפי הגששים טוב יותר להבין תהליכים אלה. צביעת עם צבעי lipophilic מאפשר התבוננות מבנה הממברנה, ויזואליזציה של השומנים microdomains, גילוי של קרום מגדלים פורחים. השימוש של חומצות אמינו פלורסנט-d (FDAAs) כדי לחקור את האתרים של פפטידוגליקן ביוסינטזה ניתן לציין פגמים פוטנציאליים להן קיר התא או המתבנת צמיחת תאים. לבסוף, חומצת גרעין כתמי ניתן לציין ליקויים אפשריים-סגרגציה שכפול או כרומוזום ה-DNA. Cyanine DNA כתמי תווית לחיות תאים ומתאימים ל זמן לשגות מיקרוסקופ שמאפשר מתצפיות נוקלאואיד מורפולוגיה של במהלך גדילת התאים. ניתן להחיל פרוטוקולים עבור תיוג התא חלבון המוטנטים דלדול לזהות פגמים מבנה הממברנה, דופן התא להן או כרומוזום סגרגציה. יתר על כן, זמן לשגות מיקרוסקופ ניתן לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים כמו חלבון חיוני יוסר ולא יכולה לספק תובנות פונקציה של חלבונים נוספים. לדוגמה, דלדול של חלבונים חיוניים חלוקת התא תוצאות filamentation או הסתעפות, ואילו דלדול של התא צמיחה חלבונים עלול לגרום לתאים להפוך קצר יותר או עגולות. כאן, פרוטוקולים צמיחת תאים, במטרה תיוג של מיקרוסקופיית זמן לשגות ניתנים עבור המחלה חיידקי צמח Agrobacterium tumefaciens. יחד, במטרה צבעי ומיקרוסקופיה זמן לשגות מאפשרים אפיון תהליכים חיוניים ב א tumefaciens. לבסוף, הפרוטוקולים הניתנים ניתן לשנות בקלות כדי לחקור חיוני בתהליכי חיידקים אחרים.
Introduction
התקדמות דרך מחזור התא חיידקית מחייבת התיאום של תהליכים רבים כולל ביוסינטזה ממברנה, דופן התא, שכפול ה-DNA, סגרגציה של חלוקת התא. כדי להבין באופן מלא את המורכבות של ביולוגיה של התא חיידקי, זה הכרחי לחקור אירועים אלה חיוניים; עם זאת, זוהי משימה לא טריוויאלי שכן הכדאיות תא בסכנה כאשר רכיבי מפתח של המסלולים הללו הם mutagenized. מיקרוסקופ Epifluorescence יחד עם צבעי במטרה היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור תהליכים חיוניים אלה wildtype, זני חיידקים מוטנטים.
צבע ספציפי פפטידוגליקן לכלול אנטיביוטיקה פלורסנט (ואנקומיצין-FL, bocillin-FL) וחומצות אמינו פלורסנט-d (לדוגמה: 7-hydroxycoumarin-3-קרבוקסילית חומצה-3-אמינו-d-אלנין, HADA; d 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino--אלנין , נדא; tetramethylrhodamine-3-אמינו-d-אלנין; ג'אר). חיידקים גראם חיוביים, השימוש של ריכוזים לא קטלני של פלורסנט תחליפי אנטיביוטיקה כדי לחקור אתרים של פפטידוגליקן ביוסינטזה כבר אסטרטגיית יעיל כדי לחשוף פפטידוגליקן ההכנסה דפוסי1,2, 3,4. בעוד תיוג פלורסנט ואנקומיצין שימש כדי לקבל תובנות פפטידוגליקן ההכנסה דפוסים קבועים חיידקים גראם שליליים5, הממברנה החיצונית בדרך כלל מספק מחסום חדירות שמונעת שימוש פלורסנט אנטיביוטיקה כמו בדיקה של הביוסינתזה פפטידוגליקן בתאים חיים. לעומת זאת, בפולסים של חומצות אמינו פלורסנט-d או חומצות אמינו d עם קבוצות פונקציונליות biorthogonal תווית covalently מחוזות ההכנסה פפטידוגליקן האחרונות במגוון רחב של חיים תאים חיידקיים6,7. דפוסי פפטידוגליקן ההכנסה שנצפו עם חומצות אמינו d סינתטי כוללים punctate במחיצה הבין-פרוזדורית (Escherichia coli ו- Bacillus subtilis), קוטב ו במחיצה הבין-פרוזדורית (Agrobacterium tumefaciens , ליסטריה), במחיצה הבין-פרוזדורית היחידה (Staphylococcus aureus), הפסגה (Streptomyces venezuelae)6,7. מקרים אלה מצביעים על חיידקים מפגינים דפוסי מגוונות של דופן התא להן כי השימוש של חומצות אמינו d סינתטיים כמו הגששים לבחינת המתבנת הצמיחה היא אסטרטגיה יקר בחיידקים רבים.
צובעים את תווית כרומוזומים חיידקי כוללים חומצה deoxyribonucleic (DNA) ספציפיים groove קטין הקלסר (4, 6-diamidino-2-phenylindole; דאפי) צובעת cyanine זיקה גבוהה (ירוק וכתום; ראה רשימת חומרים). דאפי צביעת תאים קבוע מסייע ספירה של חיידקים מן הסביבה דגימות8, ואילו דאפי מכתים של תאים חיים משמש לציון הכדאיות חיידקי9. לעומת זאת, cyanine צבענים כמו כתום וירוק מתוארים לעתים קרובות כמו קרום התא "מת" impermeant כתמי לספור תאים כלכלית9. למרבה הפלא, כאשר נוגדנים אלה משמשים כדי לחקור את המורפולוגיה של נוקלאואיד חיידקי במהלך צמיחת תאים, דאפי, כתום וירוק כל הוצגו להיות קרום permeant, ובעל יכולת תיוג תאים חיים10. E. coli תאים חיים, דאפי צביעה של DNA מופיע ' מאטום לשקוף ' עקב אוטומטי-זריחה של הציטופלסמה, חשיפות חוזרות ונשנות של תאים שהוכתמו דאפי אור אולטרה סגול (UV) perturbs את מבנה נוקלאואיד10. E. coli מכתימים או B. subtilis עם תפוז מגלה כי זה צבע ממברנה permeant ומספק לאורך זמן זריחה על הכריכה ל- DNA בתאים חיים מבלי להשפיע על צמיחת תאים, שכפול ה-DNA או סגרגציה כרומוזום10 . מקרים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש cyanine DNA צבעי לפקח המורפולוגיה של nucleoids במהלך גידול תאים של חיידקים רבים.
Phospholipid-specific stryl צבענים כמו N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) dibromide pyridinium (4-64; ראה רשימה) הם תרכובות cationic ולשייך מעדיפים אניון פוספוליפידים כגון cardiolipin ו- phosphatidylglycerol11. דפוסים ברורים הם נצפו כאשר 4-64 משמש להוספת תווית הקרום של חיידקים שונים. Escherichia coli, 4-64 מועשר בתמציות הפולנים, בלהקות לאורך החומה לרוחב, ולאחר12תאים האתרים חטיבת pre-divisional של המנוח. ב. Bacillus subtilis, 4-64 תיוג מאפשר את החזיית השומנים ספירלות13. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 תוויות הממברנה החיצונית, הוא ציין תבנית אופיינית "פרסה" שבו הקוטב צמיחה נטול תיוג14,15. תצפיות אלה מציינים כי חיידקים אלו שהפגינו הפצות השומנים הטרוגנית בשל נוכחותם של השומנים תחומים אשר תורמים אסימטריה הסלולר. שינויים בדפוסי תיוג 4-64, כגון הנוכחות של תיוג ' מאטום לשקוף ', מגדלים פורחים או שלפוחית, invaginations או הצטמקות קרום יכול להיות אינפורמטיבי באפיון מוטציות להשפיע על ההפצה או ביוסינטזה של ליפידים.
מעבר צביעת תאים, הקובע את הפונקציה של חלבונים המשתתפים בתהליכים חיוניים הכרחי. האפיון של חלבונים חיוניים היא טכנית מאתגר כי זה בלתי אפשרי למחוק גנים חיוניים וללמוד את ההשלכות פנוטיפי. לפיכך, גישות אלטרנטיביות המדלדלים החלבון הופיעו. לדוגמה, ניתן לשים על גנים חיוניים תחת השליטה של יזם inducible ולא יזם מקורי שלה. היזמים inducible הם מגיבים מולקולות קטנות כגון; אבץ vanillate17,23, אראבינוז22, איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21,16 xylose23, ובכך שעתוק של הגן היעד מפסיק, החלבון עניין תיגמר כאשר משרן מוסר. גישות חלופיות עבור depleting חלבונים חיוניים עניין כוללים riboswitches סינתטי24 אשר השתמש מולקולה קטנה-RNA אינטראקציות לעכב שעתוק של גנים היעד, CRISPR הפרעות25,26 כדי לחסום שעתוק של גנים היעד, חלבון inducible השפלה27,28 אשר משתמש בתגי פפטיד חלבונים היעד עבור השפלה על ידי פרוטאז ClpXP. דלדול זנים לספק זמן קצר בלבד עבור אפיון לפני התאים מאבד הכדאיות, לכן, הדמיה מיקרוסקופי של תאים לאורך זמן במהלך דלדול חלבון היא גישה רב-עוצמה עבור אפיון. אכן, מיקרוסקופיה של תאים חיידקיים חי איפשר לחוקרים לקבל תובנות לגבי התהליכים הביולוגיים הבסיסיים, כולל את המנגנונים של תחזוקה צורת התא, הפרשת מידור29.
Tumefaciens א הוא פתוגן חיידקי הצמח30 ,31,טבעי המהנדס הגנטי32. לפיכך, מנגנונים הקשורים פתוגניות, לרבות פתוגן-פונדקאי אינטראקציות33,34,35, הפרשת36מארח טרנספורמציה30,31, 37 נחקרו בהרחבה. לתכנן אסטרטגיות במניעת מחלות tumefaciens א מתווכת או לשפר את הצמח טרנספורמציה, תהליכים חיוניים להישרדות tumefaciens א צריך להיות מובן יותר. השימוש של צבעי במטרה ופיתוח אסטרטגיה דלדול חלבון tumefaciens א18 האחרונות מספק אמצעים כדי לחקור תהליכים חיוניים.
. הנה, פרוטוקולים מפורט לבדיקה מיקרוסקופית wildtype מוטציה, חלבון דלדול זנים של tumefaciens א הינם מסופקים. הפרוטוקולים שני הראשונים מתארים כיצד להכין תאים, התווית אותם עם צבע במטרה. הפרוטוקול השלישי מספק הנחיות צעד אחר צעד עבור הכנת agarose רפידות (איור 1) והדמיה של תאים חיידקיים (איור 2, איור 3, איור 4). פרוטוקולים אלה יכול להיות גם מתאים חיידקים אחרים עם עיבודים נוספים לקחת בחשבון תנאים מדיה שונים, שיעורי צמיחה, דרישות החמצן של מבנה התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמיחה של זנים tumefaciens א
-
Culturing זנים tumefaciens א
- השתמש עצה מקל או pipet עץ סטרילי כדי לחסן 1 מ"ל של צמיחה ATGN מדיה (ראה רשימת חומרים על המתכון) עם מושבה בודדת של המתח הרצוי.
הערה: עבור זנים דלדול א tumefaciens , ATGN צריכה להכיל 1 מ"מ IPTG כמו משרן כדי לשמור על ביוסינטזה של החלבון חיוני. - גדלים זנים tumefaciens א לילה ב- ATGN ב- 28 מעלות צלזיוס ברעידות-225 סל ד.
- למדוד את הצפיפות האופטית של התאים על 600 nm (OD600) באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את התרבות התא כדי OD600 = ~0.2 ולהמשיך לגדול עד OD600 = ~0.6 מתמלאת. עבור זנים דלדול, להמשיך לגדול עם משרן עד OD600 = ~0.6 מתמלאת.
- השתמש wildtype ו מוטנטים זני tumefaciens א -OD600 = ~0.6 במטרה להכתים ו/או מיקרוסקופ בצילום מואץ (ראו סעיפים 2 ו- 3.1). עבור זנים דלדול, לשטוף משרן (ראו סעיף 1.2.)
- השתמש עצה מקל או pipet עץ סטרילי כדי לחסן 1 מ"ל של צמיחה ATGN מדיה (ראה רשימת חומרים על המתכון) עם מושבה בודדת של המתח הרצוי.
-
הסרה של משרן פלואורסנציה זנים דלדול חלבון tumefaciens א
- גלולה 1 מ"ל של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית בטמפרטורת החדר.
- לשטוף, להסיר את תגובת שיקוע resuspend בגדר בתקשורת טריים ללא משרן ו הצניפה התאים כפי שתואר לעיל (1.2.1). לשטוף התאים סך של 3 פעמים בתקשורת טריים.
- Resuspend בגדר הסופי בתקשורת טריים ותתרכזו לתאים יתר600 = ~0.8 עבור צביעת מיידית עם יעד ספציפיות צבע (סעיף 2 ו- 4B איור-D) או מיקרוסקופ בצילום מואץ (סעיף 3.2 ואיור 4A) . לחלופין, מראש לרוקן את התאים עבור משך הזמן הרצוי על ידי גידול התאים בתקשורת ללא משרן לפני צביעת והדמיה של התאים.
2. במטרה להכתים של תאים tumefaciens א
-
תיוג פלורסנט דופן התא חומצה אמינו d
הערה: FDAAs הן רעיל חומצות אמינו d פלורסנט אשר משולבים ברצון פפטידוגליקן tumefaciens א . הליך זה תיוג פשוטות רגשים צמיחה תכנים תאים חיים6. פרוטוקולים של סינתזה של ארבעה FDAAs הינם זמינים38.- גלולה 500 µL של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית. Resuspend בגדר תא ב- 100 µL של התקשורת טריים.
- להוסיף 5 µL של 5 מ מ FDAA כדי לשטוף מרוכז התאים ואת תקופת דגירה של 2 דקות בחושך.
הערה: להגביל FDAA חשיפה לאור. תקופת הדגירה משתנה בהתאם אחוז הצמיחה של המתח. בדרך כלל, דגירה פעמים צריך להיות 5-10% של זמן ההכפלה6. - גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף תא כדורי בתמיסת פוספט buffered (PBS) שלוש פעמים.
- Resuspend צנפה ב- PBS µL ~ 50.
הערה: הנפח של PBS משמש resuspension עשויים להשתנות בהתבסס על גודל גלולה. - החלת 0.8-1 µL תאים agarose pad ולאחר התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מיד (ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2).
- לחלופין, לעצור עוד תווית התאגדות על ידי תיקון התאים עם אתנול 70% קר כקרח. Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל אתנול 70% קר כקרח, דגירה על קרח למשך 15 דקות.
- איסוף תאים על ידי צנטריפוגה, resuspend, נפח קטן של PBS עבור הדמיה במועד מאוחר יותר. חנות תא המתלים ב 4 ° C ו תמונה בתוך 48 שעות.
-
DNA מכתים עם דאפי או כתם כתום
הערה: כדי לצפות דנ א מבנה תאים מסומנים עם דאפי או כתום (הכתם תאים מתים). למרות בסגנון קלאסי מתואר "כתם תאים מתים", כתום הוא permeant, photostable, ואינו משפיע על הצמיחה של תאים חיידקיים, המאפשרים לחיות תאים DNA הדמיה10. ב א tumefaciens, יצירות תיוג תפוזים טוב בתאים חיים ומתאים לכל זמן לשגות מיקרוסקופ (איור 3). לעומת זאת, אולטרה סגול (UV) אור החשיפה הכרחי עבור תאים שהוכתמו דאפי הדמיה הוא פוטוטוקסי (איור 3) והוא ובכך דאפי מכתים המתאימה ביותר עבור צביעת תאים חיים מיידית הדמיה או צביעת תאים קבוע.- דאפי צביעת תאים
- גלולה 1 מ"ל של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית.
- לחלופין, כדי לתקן תאים לפני צביעת, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל אתנול 70% קר כקרח. דגירה על קרח במשך 10-15 דקות לאסוף התאים על ידי צנטריפוגה כפי שמתואר 2.2.1.1.
- Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS המכיל 1 µL של דאפי מניות פתרון (1 מ"ג/מ"ל; ראה טבלת חומרים). לערבב בעדינות על-ידי pipetting, תקופת דגירה של 5 דקות בחושך.
- גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב g x כ-7,000 במשך 5 דקות, resuspend ב 1 מ"ל של PBS כדי להסיר עודפי דאפי. רוחצים את התאים עוד פעמיים את resuspend בגדר PBS 50 µL או מדיה.
- החלת 0.8-1 µL תאים agarose pad ולאחר התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מיד. ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2.
הערה: פרוטוקול זה אינה אופטימלית עבור זמן לשגות מיקרוסקופ להתבונן כרומוזום דינמיקה (איור 3). שקול להשתמש מכתים כתום כחלופה (ראו סעיף 2.2.2).
- כתמים כתומים של תאים חיים
- גלולה 1 מ"ל של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 1 µL של תפוז פתרון מניות (ראה רשימה). לערבב בעדינות על-ידי pipetting, תקופת דגירה של 5 דקות בחושך.
- גלולה תאים על ידי צנטריפוגה, resuspend ב 1 מ"ל של PBS כדי להסיר עודפי כתום. רוחצים את התאים עוד פעמיים את resuspend בגדר ב- 50 µL PBS.
- החלת 0.8-1 µL תאים agarose pad ולאחר התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מיד. ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2.
הערה: פרוטוקול זה עובד היטב עם תאים חיים ומתאים לכל זמן לשגות מיקרוסקופ להתבונן כרומוזום דינמיקה (איור 3). אם זה לא נוח ליצור תמונה מיד, ניתן לתקן תאים ב- 70% קר כקרח אתנול (ראו סעיף 2.2.1.2).
- דאפי צביעת תאים
-
ממברנה תיוג
הערה: הפלורסנט יפה lipophilic styryl 4-64 כבר בשימוש נרחב להתבונן הקרום של תאים חיידקיים. בניגוד חיידקים רבים, 4-64 הנקרא tumefaciens א תאים לא תווית בצורה אחידה, אבל מעדיף לעתים קרובות להציג "פרסה" דפוס14,15. למרבה הפלא, הקוטב הצמיחה היא כמעט ריק הכתם בעוד הקוטב הישן תוצמד באופן אינטנסיבי. לפיכך, 4-64 מאפשר הדמיה של דפוסי הצמיחה התא והן מבנה הממברנה tumefaciens א.- להוסיף FM 4-64 ריכוז הסופי של µg/mL 8 ב- 1 מ"ל של תרבית תאים שלב מעריכית, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בחושך.
- גלולה תאים עם תוויות על ידי צנטריפוגה ב g x כ-7,000 במשך 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית, resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל ל- PBS. לשטוף התאים בסך הכל שלוש פעמים כדי להסיר צבע עודף.
- Resuspend בתאים נפח קטן של PBS, כתם על רכיב pad agarose לשיקוף מיד. (ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2)
התראה: תאים חייב לדימות מיד לבחון דפוסי תיוג אופיינית.
3. הדמיה של תאים tumefaciens א
-
הכנת משטח Agarose
הערה: איור 1 כולל, רצף תמונות (לוח א') ו סכמטית כרית agarose טיפוסי מוכן מיקרוסקופ בצילום מואץ (לוח ב'). רפידות Agarose מוכנים בדרך כלל לפי הצורך.- 3.1.1. השתמש coverslip מדריך, חתך 22 מ מ x 22 מ מ מרובע של מעבדה סרט (ראה רשימה) על-ידי הפעלת אזמל בקצוות.
- לגזור ריבוע במרכז הסרט מעבדה עוזב ~ 2-5 מ מ הגבול כדי לשמש אטם עבור משטח agarose. למחוק את מרכז אזור החיתוך.
- מקם את האטם הסרט לשקופית זכוכית (75 מ"מ x 25 מ"מ) ניקיתי עם אמוניה, מנקה ללא אלכוהול (ראה רשימה) וחום עד הסרט מעט נמס על גבי זכוכית (תמונה עליונה באיור 1A). להמיס הסרט מעבדה, להשתמש בקצה ערכה גוש חום עד 70 ° C או להמיס בקלילות מעל להבה.
- הכן agarose פתרון על ידי ערבוב ~0.075 g agarose (ראה רשימה) ב 5 מ של התקשורת בקבוקון קטן. מחממים את הפתרון במיקרוגל עם מתערבל תקופתיים לערבב עד התפרקה agarose הפתרון ברור. לשמור את הפתרון agarose 55-70 ° C ולהשתמש לבנייה של רפידות agarose מרובים תוך 48 שעות.
- פיפטה המדיה המכילה 1.2-1.5% agarose אל מרכז האטם.
הערה: הנפח של המדיה הוא בדרך כלל 50-60 µL אך ישתנו בהתבסס על גודל האטם. הוספת מדיה לשקופית קר יכולה לגרום agarose שבמהלכו מהר מדי, כך לשקופית יש לשמור על משטח חם. הקצה של גוש חום מוגדר 70 ° C עובד טוב. מים agarose או agarose במאגר פתרונות כגון פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) יכול לשמש במקום המדיה המכילה agarose עבור יישומים שבהם תא המשך הצמיחה אינה נדרשת. עבור הדמיה דלדול זנים, משרן ניתן להציג או נעדר בתקשורת. נוכחות של משרן יכול לשמש בתור פקד ואילו היעדר משרן תחשוף את דלדול פנוטיפ. - המקום coverslip מעל האטם לפיזור אחיד של agarose.
- במקום שקופיות על משטח קריר, רמת שבמהלכו עבור ~ 2 מינימלית להימנע overdrying של משטח agarose כמו התוצאה תהיה משטח קמטים על משטח agarose ואיגום של התליה תא כאשר מוחל על פני השטח.
- החלק בזהירות את coverslip את משטח agarose.
התראה: אל תאיץ שלב זה. משטח agarose יכול לקרוע בקלות, רכיב pad agarose לא אחידה עלולה להקשות הדמיה. - לאפשר משטח agarose מהאוויר להתייבש במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר להופעת המשטח יבש. באמצעות אזמל, להסיר רצועה קטנה של agarose כדי ליצור כיס אוויר (האמצעי תמונה, איור 1A); לכיס אוויר בדרך כלל ~ 2 מ"מ x 7-10 מ"מ, tumefaciens א התאים נוטים לגדול ביותר ליד לכיס אוויר (איור 1C).
הערה: עבור הדמיה של תאים קבוע או בתנאים שבו הצמיחה שאינו מפוקח, כיס אוויר אינו הכרחי. - ספוט 0.8-1 µL של תאים על משטח agarose, לכסות עם coverslip החדש. הנח בעדינות את coverslip מעל משטח agarose להפיץ את התאים על פני משטח agarose.
- לאטום את הקצוות של coverslip באמצעות VALAP נמס (ראה את הטבלה חומרים למתכון; איור 1A, בתחתית התמונה). כשל לאטום לאורך כל בקצוות ובפינות של coverslip יכולה לגרום התייבשות משטח agarose, אשר יוביל נסחף של תאים במהלך דימות. הערה: איטום coverslip נדרשת רק עבור הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך.
איור 1: הכנת משטח Agarose. (א) תמונה רצף פרוטוקול הכנה agarose pad. תמונה 1 הוא שקופית עם gasket הסרט מעבדה. בתמונה 2, הם דמיינו את משטח agarose ואת כיס אוויר. בסופו של דבר, התמונה 3 מראה את משטח agarose מלאה עם התאים תחת coverglass ואטום עם VALAP. (B) A תרשים סכמטי של רכיב pad agarose עבור זמן לשגות מיקרוסקופ מסופק. תכונות מפתח של משטח agarose מסומנות על התרשים. (ג) לכיס אוויר לקדם צמיחה של tumefaciens א -agarose רפידות. מוצגות תמונות של תאים tumefaciens א wildtype גדל על רכיב pad agarose במשך 20 שעות. התמונות צולמו ב עמדות יותר ויותר רחוק לכיס אוויר. המרחק מהקצה הקרוב ביותר של התמונה לכיס אוויר מוצג מעל כל תמונה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
-
הדמיה
הערה: התערבות דיפרנציאלית ניגודיות, חדות שלב ו epifluorescence הדמיה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצויד autofocusing שותק מבוססי חומרה, שלב אוטומטיות, מסננים רגיל, מקור אור LED, טבילה שמן X 60 מטרות (1.4 NA) עבור שלב חדות או התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC), מצלמה 1 ג הכפלת אלקטרון תשלום מצמידים-התקן (EMCCD). המיקרוסקופ יוצב בחדר מבוקרת טמפרטורה. לחלופין, הבמה החמים או קאמרית יכול לשמש כדי לשמור על טמפרטורה עקבית במהלך דימות.- מיקרוסקופ Epifluorescence
הערה: עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה של תאים חיים, זה הכרחי להגביל את מספר התמונה רכישות ולמטב את זמן החשיפה כדי למזער את photobleaching ואת phototoxicity. עבור הדמיה של כל צבע, מומלץ למצוא זמן חשיפה אופטימלית בלתי מספקת זיהוי קרינה פלואורסצנטית מספיק אך לא תוביל photobleaching או phototoxicity. דמויות 2-4פעמים חשיפה של 200 ms שימשו לכל התמונות זריחה. עבור רצפי זמן לשגות בתרשים 3, תמונות נרכשו בכל 10 דקות במשך 3 שעות.- במקום שמן טבילה על המטרה הרצויה ומניחים את השקופית הפוך לתוך מחזיק שקופיות על הבמה. השימוש בידית התמקדות להביא את התאים להתמקד.
- לרכוש תמונות שלב (או DIC) ומסנן קרינה פלואורסצנטית הרצוי.
הערה: מקסימלי עירור, פליטה אורכי הגל עבור שהכתמים בשימוש איור 2, איור 3ו- 4 איור הם כדלקמן: HADA (405/460), נאדה (450/555), ג'אר (555/570), 4-64 (515/640), דאפי (360/460), כתום (547/570).
- מיקרוסקופ בצילום מואץ
הערה: במהלך זמן לשגות מיקרוסקופ התכונות הבאות הן מחשב הנשלט: x, y ו- z עמדה, תריסים, קרינה פלואורסצנטית ומסננים. מערכת פוקוס אוטומטי המבוסס על חומרה היא אופטימלית כדי לשמור על ריכוז במהלך דימות זמן לשגות. לחלופין, ניתן להשתמש הלולאה-מבוססות תוכנה מיקוד אוטומטי.- במקום שמן טבילה על המטרה הרצויה ומניחים את השקופית הפוך לתוך מחזיק שקופיות על הבמה. השימוש בידית התמקדות להביא את התאים להתמקד.
- אופציונלי: לרכוש מרובים (x, y) עמדות. לבחור באקראי 10 שדות של תאים בסמיכות לכיס אוויר של הידיות agarose.
- הגדרת זמן רצף רכישת תמונת שלב או DIC במרווח הזמן הרצויים.
הערה: את הרצף זמן לשגות המוצג באיור 4, DIC תמונות נרכשו עם 30 ms חשיפה בכל 10 דקות במשך 14 שעות. בעת שימוש פלורסצנטיות דימות במהלך זמן לשגות מיקרוסקופ, להתאים את רכישת מרווח וחשיפה הזמן כדי למזער את photobleaching ואת phototoxicity.
- מיקרוסקופ Epifluorescence
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במטרה תיוג של wildtype א tumefaciens תאים
כדי להמחיש את המורפולוגיה תא לא מושפע על ידי שטיפת מדרגות או טיפול עם 1% דימתיל סולפוקסיד (אשר נמצא בשימוש כדי לדלל את צבעי פלורסנט), התאים היו עם תמונה ישירות מתרבות (איור 2 א, לוח השמאלי), לאחר שטיפת התאים על ידי צנטריפוגה כמתואר ב- 1.2 (איור 2 א, פאנל שמאלי), או לאחר המקננת התאים עם דימתיל סולפוקסיד 1% 10 דקות ולשטוף את התאים (איור 2 א, לוח נכון). תמונות אלה ממחישים כי מורפולוגיה לא מושפע כביסה או הנוכחות של דימתיל סולפוקסיד. בנוסף, גדילת התאים לא מושפע כביסה או טיפול דימתיל סולפוקסיד מבוסס על ניתוח עקומת גדילה (נתונים לא מוצג). בנוסף, תיקון tumefaciens א עם אתנול כקרח אינו גורם שינויים ברוטו במורפולוגיה (איור 2 א, בלוח הימני).
בשלב הבא, צבע ספציפי היעד שימשו לצפות להן קיר התא, ממברנה תחומים ו- DNA בתוך התאים tumefaciens א wildtype. הדפוסים של ההכנסה פפטידוגליקן חדשים נצפו בעקבות תיוג עם שלוש חומצות אמינו פלורסנט-d: HADA (איור 2B, עזב את החלונית), נאדה (איור 2B, במרכז החלונית) וג'אר (איור 2C, לוח נכון). בניסויים כל שלוש תיוג, תיוג פפטידוגליקן החדש היה מועשר צמיחה מוט או מחצה של התאים. דפוסי הצמיחה אלה נצפו באופן עקבי עם כל FDAAs שלוש, המציין כי ניתן לשנות את הבחירה FDAA כדי לאפשר תיוג כפול עם כתמים או תאים המבטאים חלבונים שכותרתו fluorescently אחרים. לצבוע lipophilic 4-64 תוויות מעדיפים אזור הקוטב הישן של תאים tumefaciens א וכתוצאה מכך דפוס הפרסה אופייני (איור 2C). כתום (איור דו-ממדי, פאנל שמאלי) והן דאפי (איור דו-ממדי, לוח נכון) DNA תווית בתוך חיים תאים tumefaciens א . בתאים pre-divisional המנוח, שני nucleoids נפרדים הם נצפו עם כתמים כתומים, ואילו ה-DNA תיוג מופיע מתמשכת עם דאפי מכתים (איור דו-ממדי) עקבי עם תוצאות ניסויים שנצפתה e. coli10.
התאמת DNA צבעני מיקרוסקופ בצילום מואץ
על מנת לקבוע אם דאפי או כתום מתאימים עבור הדמיה בצילום מואץ של מורפולוגיה נוקלאואיד במהלך צמיחת תאים, אחוז שווה ללא תווית, התווית על-ידי דאפי ותאים tumefaciens א wildtype התווית על-ידי כתום היו מעורבים, זוהו רפידות agarose. בזמן 0, הראשונית התמונות צולמו באמצעות שלב ניגודיות, דאפי TRITC מסננים כדי לקבוע אם כל תא סומן. תערובות תא היו אז עם תמונה תחת שלושה מצבים שונים: (1) שלב ניגודיות מיקרוסקופ בלבד, ניגודיות (2) שלב מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות את TRITC מסנן ו (3) שלב ניגודיות וכן epifluorescence מיקרוסקופ באמצעות המסנן ' דאפי '. תמונות נרכשו כל 10 דקות במשך 3 שעות. כל התאים גדל טוב ללא קשר הכתם פלורסנט כאשר תמונה עם שלב במיקרוסקופ ניגוד המציין הזה לא כתום או דאפי מכתים לפגום צמיחת תאים (איור 3, החלונית העליונה). כל התאים גדלה גם היטב כאשר צילמו על ידי מיקרוסקופ שלב מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות המסנן ' TRITC ' (איור 3, במרכז החלונית). המדבקה הכתומה כפוף photobleaching, אבל יכול להיות שנצפו כבר לפחות שעתיים (13 חשיפות של 200 ms), המציין את התאמת צבע זה עבור מיקרוסקופ לטווח קצר של תאים חיים. ללא קשר תיוג, כל התאים מפסיקים לגדול בתוך שעה כאשר צילמו על ידי מיקרוסקופ שלב מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות המסנן ' דאפי ' (איור 3, החלונית התחתונה). התבוננות זו ממחישה כי א tumefaciens רגיש חשיפה UV ומציין כי צבעי הדורשים פילטר UV עבור הדמיה להימנע לניסויים מיקרוסקופ זמן לשגות.
הדמיה בצילום מואץ, במטרה תיוג של Tumefaciens א דלדול זן
קולח transposon מוטגנזה מכוונת39 והן כשל לבנות מחיקה זן18,40 מציינים כי החלבון הרגולטור הראשי, CtrA, הינו חיוני ביותר tumefaciens א. כדי להדגים את הערך של ניתוח מיקרוסקופי של דלדול זנים, זן דלדול שתואר לעיל ctrA 18 היה נתון אפיון באמצעות מיקרוסקופ. איור 4A, שימשה זמן לשגות מיקרוסקופ כדי להשוות את הצמיחה של תאים דלדול ctrA איזה ביטוי ctrA היה מושרה (למעלה), uninduced (למטה). בנוכחות CtrA, תא בודד הולידה microcolony בתוך 14 h. לעומת זאת, בעת CtrA הייתה דלה, תאים lysed או נכשל לחלק. תאים נכשל לחלק הציג שינויים מורפולוגיים ברוטו כולל עיגול מתא אמצע, הפולנים התא. מקרים אלה מצביעים על כך CtrA יש תפקיד חשוב בוויסות של חלוקת התא.
איור 4B-D, צבעי פלורסנט שימשו כדי לאפיין את המתח דלדול ctrA לאחר אינדוקציה או דלדול של ctrA עבור ה 10 תאים היו הדופק המסומנת נדא למשך 2 דקות (איור 4B). מתי CtrA היה נוכח (החלונית העליונה), נצפתה ביוסינטזה פפטידוגליקן קוטבי. לעומת זאת, labelling נדא נרחב ארע הפולנים, נפיחויות תא בינוני גדול אירעה בעת CtrA הייתה דלה. התבוננות זו עולה בקנה אחד עם המשך פפטידוגליקן סינתזה למרות כישלון של התאים כדי לחלק. לצבוע דנ א cyanine כתום שימש לאפיין DNA הפצה בנימה דלדול ctrA (איור 4C). CtrA היה נוכח, גדל התאים היה ריפודי כתופיים של ה-DNA, סגרגציה של nucleoids היה לכאורה בתא pre-divisional מאוחר; לעומת זאת, בעת CtrA הייתה דלה, DNA הופץ באורח לא אחיד לאורך כל התאים. מקרים אלה מצביעים על כי CtrA תורם מתאים שכפול ה-DNA או סגרגציה. לבסוף, ctrA דלדול תאי הודבקו תוויות עם 4-64 (איור 4D). בנוכחות CtrA, קרום התא סומן עם דפוס הפרסה אופייני שבו הקוטב הצמיחה היה ללא כתם. תאים של CtrA, 4-64 הופיע לתייג את כל הקרום למרות קוטב אחד היתה מוכתמת התוכני. התבוננות זו עולה כי ממברנות נותרו ללא פגע, למרות הארגון microdomain השומנים תשובש כאשר CtrA תיגמר.
איור 2: להחליפן בתמונות של תאים Agrobacterium tumefaciens wildtype המסומנת צבע ספציפי היעד. (א) שלב לעומת זאת תמונות תאים tumefaciens א לפני ו אחרי פרוטוקול כביסה, כאשר שטופלו דימתיל סולפוקסיד 1%, או לאחר קיבוע עם אתנול קר כקרח. (B) קוטב הצמיחה של תאים tumefaciens א מוצג על ידי תיוג עם פלורסנט חומצות אמינו d את HADA, נאדה, ג'אר. (ג) Staining של tumefaciens א עם הכתם 4 lipophilic-64. (ד) Staining של תאים tumefaciens א עם צבעים DNA ספציפיים דאפי וכתום. עבור לוחות B-D, מוצגים שלב ניגודיות (למעלה) ותמונות epifluorescence (למטה). תא מתאר ניתנים בתמונות פלורסצנטיות לעיון. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השוואה של דאפי וכתום תיוג של ה-DNA של חיה א tumefaciens תאים. יחסי שווה ללא תווית התווית על-ידי דאפי, התווית על-ידי כתום wildtype tumefaciens א התאים היו מעורבים, הבחין על רפידות agarose. בזמן 0, הראשונית התמונות צולמו באמצעות שלב ניגודיות, TRITC דאפי מסננים כדי לקבוע אם התאים הודבקו תוויות. (א) בצילום מואץ של תאים ללא תווית התווית על-ידי דאפי, התווית על-ידי כתום עם תמונה על ידי מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. (B) בצילום מואץ של תאים ללא תווית התווית על-ידי דאפי, התווית על-ידי כתום עם תמונה על ידי מיקרוסקופ שלב מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות המסנן ' TRITC '. (ג) בצילום מואץ של תאים ללא תווית התווית על-ידי דאפי, התווית על-ידי כתום עם תמונה על ידי מיקרוסקופ שלב מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות המסנן ' דאפי '. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: להחליפן בתמונות של המתח דלדול ctrA בתנאים המושרה, uninduced. (א) מיקרוסקופיה בצילום מואץ של המתח דלדול ctrA בתנאים שבהם היה ctrA מזורזת (למעלה) או מדולדל (למטה). המספרים מעל כל לוח מציינים את זמן בשעות. (B) שלב ניגודיות (משמאל) ותמונות (מימין) epifluorescence של תאים המסומנת נאדה. (ג) שלב ניגודיות (משמאל) ותמונות קרינה פלואורסצנטית (מימין) של תאים עם כתום תוויות. (ד) שלב ניגודיות (משמאל) ותמונות קרינה פלואורסצנטית (מימין) של תאים עם תוויות עם 4-64. תא מתאר נמסרו בתמונות פלורסצנטיות לעיון. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מכיל סדרה של הליכי החקירה של זנים wildtype מוטציה, דלדול tumefaciens א . ראוי לציין כי כל הנהלים המפורטים בסעיף פרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות זני חיידקים אחרים עם שינויים נוספים חשבון צמיחה מדיה, טמפרטורות של שיעורי צמיחה.
השימוש של צבעי במטרה הוא כלי רב ערך עבור מתן אפיון מפורט של אירועים מחזור התא בתאי חיידקים. כאן, דפוסי ההכנסה פפטידוגליקן נצפו באמצעות חומצות אמינו פלורסנט-d, השומנים תחומים היו דמיינו 4-64, ומוענקת nucleoids היו דאפי או כתום. כל אחד מהפרוטוקולים ניתן להתאים לשימוש בחיידקים אחרים לאחר מיטוב פרוטוקול שטיפת ולהבטיח כי הטיפול דימתיל סולפוקסיד אינו פוגע בצמיחה או מורפולוגיה. שיקולים מרכזיים כוללים המבחר של מאגר שטיפת מדרגות, דגירה זמני עבור תווית התאגדות של מבחר fluorophore המתאים כדי למנוע אוטומטית-זריחה או לאפשר מולטיפלקס מחקרים תיוג. לדוגמה, חלופה על הכתם lipophilic אדום-פלורסנט ממברנה (4-64) היא כתם ירוק-פלורסנט ממברנה (1-43). באופן דומה, בלו, ירוק-אדום-פלורסנט-d-חומצות אמינו הינם זמינים6,38 , חומצות אמינו d עם ידיות biorthogonal יכול להיות מצומדת כדי fluorophores נפוצות באמצעות לחץ על כימיה6,7. לבסוף, בנוסף cyanine כתום-פלורסנט DNA לצבוע, ירוקה לצבוע דנ א cyanine פלורסנט זמין ומבצע טוב עם חיים תאים חיידקיים10. הדמיה של מבנה התא מפתח עם צבעי במטרה תוויות יכול להיות משולב עם התצפית של חלבונים פלורסנט כדי לקבל תובנות מכניסטית חיוני בתהליכי חיידקים.
פרוטוקולים אלה כוללים את הצורך תנאים להשגחה מיקרוסקופיים מהכתמים דלדול tumefaciens א , זה צריך להיות אפשרי להרחיב את הגישות הללו חלבון דלדול זנים של חיידקים אחרים. האפיון של דלדול זנים יכול להיות מאתגר במיוחד כמו שיש פרק זמן מוגבל כדי להשלים חקירות לפני התאים מפסיקים לגדול או lyse. זה חיוני שלמאחה לשטוף את התאים כדי להסיר כל עקבות של לצבוע עודף במהלך תיוג; אולם, כמה תאים של חלבונים חיוניים יש פגמים שלהם משטחים תא אשר יכול לגרום להם להיות רגישים כדי לשטוף את השלבים. הגדלת הנפח ההתחלתי של תרביות תאים יכולים לסייע לפצות על אובדן תאים במהלך השלבים לשטוף. זנים דלדול אשר חשף קרום התא או קירות התא יכול להיות נוטה תא פירוק כאשר גדל בתרבות נוזלי ללא משרן. הכללת osmoprotectant (5% סוכרוז זו פועלת היטב עבור tumefaciens א) יכול לעזור לשמור על מורפולוגיה תאים והגבלת פירוק התא במהלך המחסור. זה הכרחי לקבוע את הכמות המתאימה של זמן מראש לרוקן את התאים לפני צביעת עם תיוג הפלורסנט מדעית. תאים עם ממברנות permeablized או קירות התא יכול להיות נוטה תא פירוק או תיוג לא בררניים עם ריאגנטים פלורסנט ביצוע הדמיה של המנוח נקודות זמן דלדול מאתגר במיוחד.
שלב קריטי עבור זמן לשגות מיקרוסקופ tumefaciens א (או תאים חיידקיים אחרים) הוא הכנת משטח agarose. משטח agarose צריך להיות כדי לוודא מיקוד טוב לאורך זמן לשגות מיקרוסקופ ניסויים. בנוסף, coverslip ייסתמו לחלוטין כדי למנוע משטח agarose של ייבוש ושינוי המטוס מוקד. עבור tumefaciens א, חמצן נדרשת עבור גדילת התאים. הדמיה ליד כיס אוויר יש צורך לקבל תהליך צמיחה של tumefaciens א במהלך ניסויים זמן זמן לשגות מיקרוסקופ (איור 1C). אם תאים לא יגדל או מפסיקים לגדול לאחר כמה שעות, רצוי להכין את רכיב pad agarose עם כיס אוויר גדול יותר, תמונה ליד כיסי אוויר. אפילו כרית agarose מתוכננת היטב עם כיס אוויר תקין יכול רק לתמוך tumefaciens א צמיחה לכל היותר ~ 24 h. אם כבר זמן לשגות רצפים נחוצים, חלופה ניגש כגון תאים מיקרופלואידיקה או זרימה צריך להיחשב. אם התאים להיסחף בפוקוס במהלך דימות, ודא כי משטח agarose היא רמת אטום כראוי תחת coverslip. שימו לב כי אפילו עם agarose מושלמת ליד pad, זה אפשרי כי כמה תאים תיסחף מחוץ לפוקוס, ובכך הדמיה ושדות מרובים refocusing בתדירות גבוהה מומלץ מאוד. לחיידקים אחרים, גישות אלטרנטיביות של הכנת agarose רפידות להתייחס42,41,43 בצורה הטובה ביותר לענות לדרישות צמיחה של החיידק. רפידות Agarose שימושיים גם שיתק תאים במהלך דימות של תאים עם תוויות או קבוע כאשר בצילום מואץ אינה נחוצה. במקרה זה, איטום coverslip את אינה גישות הכרחי, אלטרנטיביות לבניית רפידות agarose אשר ניתן לאחסן עד מאוחר יותר עשוי להיות מתאים43.
באופן כללי, שימוש במטרה צבעי מיקרוסקופ בצילום מואץ יכול לספק תובנות על התהליכים הבסיסיים של חיידקים. כאן, אנו ממחישים הדפוס הרגיל הפרסה של תיוג עם 4 lipophilic-64 לצבוע ולקרוא את מאפיין קוטב ו במחיצה הבין-פרוזדורית עם חומצות אמינו פלורסנט-d ב- tumefaciens א. תצפיות על אלה דפוסים tumefaciens א עקביים עם צמיחת חיידק זה44 קוטבי, סביר להניח כי מחקרים דומים עשויים לחשוף מידע אודות הצמיחה תכנים בחיידקים אחרים. מציאת cyanine צבעים כגון כתום מתאימים עבור זמן לשגות מיקרוסקופ מחקרים10 (איור 3) יאפשר מחקרים זהיר של מורפולוגיה נוקלאואיד במהלך גידול תאים של זנים wildtype ו מוטנטים. הדמיה צבעי פלורסנט במטרה במהלך דלדול של חלבון חיוני יכול לספק תצפיות מפתח כדי לקבוע את תפקוד החלבון. לבסוף, מאז רבים של צבעים אלה זמינים עם תכונות ספקטרליות שונות, מחקרים באמצעות תוויות מרובות בו זמנית צריך לאפשר תובנות התיאום של תהליכים חיוניים במהלך מחזור התא התקדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים מיכאל VanNieuwenhze (אוניברסיטת אינדיאנה) על המתנה של FDAAs בשימוש איור 2 באיור 4. אנו מודים חברי המעבדה חום לקבלת משוב במהלך הכנת כתב היד הזה. המחקר במעבדה חום על צמיחת תאים tumefaciens א וחילוק נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS1557806).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
References
- Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
- Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
- Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26 (2010).
- Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
- Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496 (2013).
- Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
- Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
- Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
- Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
- Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
- Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219 (2014).
- Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
- Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
- Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
- Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
- Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137 (2007).
- Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
- Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
- Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
- McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
- Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
- Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730 (2014).
- Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488 (2016).
- Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322 (2014).
- Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519 (2013).
- Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
- Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
- Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682 (2013).
- Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363 (2011).
- Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).
