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Biology

लाइव सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी माइक्रोबियल सेल विकास के दौरान आवश्यक प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए

Published: November 24, 2017 doi: 10.3791/56497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

Summary

बैक्टीरिया में आवश्यक प्रक्रियाओं के समारोह को समझना चुनौतीपूर्ण है । लक्ष्य विशेष रंजक के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी माइक्रोबियल सेल विकास और कोशिका चक्र प्रगति में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । यहां, एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens को आवश्यक प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन के लिए लाइव सेल इमेजिंग के लिए विधियों को हाइलाइट करने के लिए जीवाणु मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है ।

Abstract

इस तरह के डीएनए प्रतिकृति और अलगाव के रूप में कोर सेलुलर प्रक्रियाओं, प्रोटीन संश्लेषण, सेल दीवार के संश्लेषण, और कोशिका विभाजन जीवाणुओं के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं जो प्रोटीन के समारोह पर भरोसा करते हैं । इन प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए लक्ष्य-विशिष्ट रंगों की श्रृंखला को जांच के रूप में उपयोग किया जा सकता है । lipophilic रंगों के साथ धुंधला झिल्ली संरचना, लिपिड microdomains के दृश्य, और झिल्ली blebs का पता लगाने के अवलोकन में सक्षम बनाता है । फ्लोरोसेंट-डी-अमीनो एसिड (FDAAs) का उपयोग peptidoglycan के स्थलों की जांच करने के लिए, कोशिका दीवार की उत्पत्ति या कोशिका वृद्धि के स्वरूप में संभावित दोषों का संकेत कर सकते हैं । अंत में, न्यूक्लिक एसिड दाग डीएनए प्रतिकृति या गुणसूत्र अलगाव में संभावित दोषों का संकेत कर सकते हैं । Cyanine डीएनए दाग लेबल रहने वाली कोशिकाओं और समय के लिए उपयुक्त हैं-चूक सूक्ष्मता सेल विकास के दौरान nucleoid आकृति विज्ञान के वास्तविक समय टिप्पणियों को सक्षम करने के लिए. कोशिका लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रोटीन कमी म्यूटेंट के लिए लागू किया जा सकता झिल्ली संरचना में दोषों की पहचान करने के लिए, कोशिका दीवार की उत्पत्ति, या गुणसूत्र अलगाव । इसके अलावा, समय चूक माइक्रोस्कोपी एक आवश्यक प्रोटीन के रूप में रूपात्मक परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है हटा दिया और प्रोटीन समारोह में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, आवश्यक कोशिका विभाजन प्रोटीन की कमी रेशा या शाखाओं में परिणाम है, जबकि सेल वृद्धि प्रोटीन की कमी कोशिकाओं के कारण हो सकता है छोटे या राउंडर । यहां, सेल वृद्धि के लिए प्रोटोकॉल, लक्ष्य विशेष लेबलिंग, और समय चूक माइक्रोस्कोपी जीवाणु संयंत्र रोगज़नक़ एग्रोबेक्टीरियम tumefaciensके लिए प्रदान की जाती हैं । एक साथ, लक्ष्य विशिष्ट रंजक और समय चूक माइक्रोस्कोपी ए. tumefaciens में आवश्यक प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन सक्षम करें । अंत में, उपलब्ध कराए गए प्रोटोकॉल आसानी से अंय बैक्टीरिया में आवश्यक प्रक्रियाओं की जांच संशोधित किया जा सकता है ।

Introduction

बैक्टीरियल कोशिका चक्र के माध्यम से प्रगति झिल्ली और कोशिका दीवार के संश्लेषण, डीएनए प्रतिकृति और अलगाव, और कोशिका विभाजन सहित कई प्रक्रियाओं के समन्वय की आवश्यकता है. बैक्टीरियल कोशिका जीवविज्ञान की जटिलता को पूरी तरह समझने के लिए, इन आवश्यक घटनाओं का अध्ययन करना आवश्यक है; हालांकि, यह एक गैर तुच्छ काम के बाद से सेल व्यवहार्यता समझौता है जब इन रास्ते के प्रमुख घटक mutagenized हैं । Epifluorescence माइक्रोस्कोपी लक्ष्य के साथ युग्मित विशिष्ट रंजक wildtype और उत्परिवर्ती बैक्टीरियल उपभेदों में इन आवश्यक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है ।

Peptidoglycan-विशिष्ट रंजक फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक्स शामिल (vancomycin-FL, bocillin-FL) और फ्लोरोसेंट-डी-अमीनो एसिड (उदाहरण के लिए, 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic एसिड-3-अमीनो-डी-alanine, हाडा; 4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-7-nitrobenzofurazan-3-एमिनो-डी-alanine ̈नदा; tetramethylrhodamine-3-अमीनो-डी-alanine; टाडा). ग्राम में सकारात्मक बैक्टीरिया, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक सादृश्य के उपघातक सांद्रता के उपयोग peptidoglycan के साइटों की जांच करने के लिए एक प्रभावी रणनीति peptidoglycan प्रविष्टि पैटर्न1,2प्रकट करने के लिए किया गया है, 3,4. जबकि फ्लोरोसेंट vancomycin लेबलिंग निश्चित ग्राम में peptidoglycan प्रविष्टि पैटर्न में अंतर्दृष्टि लाभ के लिए इस्तेमाल किया गया है नकारात्मक जीवाणु5, बाहरी झिल्ली आम तौर पर एक पारगम्यता बाधा है कि फ्लोरोसेंट के उपयोग को रोकता है प्रदान करता है जीवित कोशिकाओं में peptidoglycan के लिए एक जांच के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं । इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट के लघु दालों-डी-अमीनो एसिड या डी-एमिनो एसिड biorthogonal कार्यात्मक समूहों के साथ covalently हाल ही में peptidoglycan प्रविष्टि के लेबल क्षेत्रों बैक्टीरियल कोशिकाओं6,7के रहने की एक विस्तृत श्रृंखला में । peptidoglycan प्रविष्टि है कि सिंथेटिक डी अमीनो एसिड के साथ मनाया गया है के पैटर्न कबरा और septal (ई कोलाई और बैसिलस सबटिलिस), ध्रुवीय और septal (एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens और लिस्टिरिया monocytogenes), septal केवल (Staphylococcus स्ताफ्य्लोकोच्चुस), और शिखर (Streptomyces वेनेजुएला)6,7. इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि बैक्टीरिया सेल दीवार के विविध पैटर्न का प्रदर्शन उत्पत्ति और है कि सिंथेटिक डी के उपयोग के रूप में विकास पैटर्न की जांच के लिए एमिनो एसिड की जांच कई बैक्टीरिया में एक मूल्यवान रणनीति है ।

रंग है कि जीवाणु गुणसूत्रों लेबल deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) विशिष्ट माइनर नाली बांधने की मशीन (4, 6-diamidino-2-phenylindole शामिल हैं; DAPI) और उच्च अपनत्व cyanine रंजक (हरा और नारंगी; सामग्री सूची देखें). DAPI स्थिर कोशिकाओं के दाग पर्यावरण के नमूनों से बैक्टीरिया की गणना में सहायता करता है8, जबकि जीवित कोशिकाओं के DAPI धुंधला जीवाणु व्यवहार्यता9संकेत करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके विपरीत, नारंगी और हरे रंग के रूप में cyanine रंजक अक्सर झिल्ली impermeant "मृत" सेल दाग के रूप में वर्णित गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को9गणना कर रहे हैं । उल्लेखनीय है, जब इन एजेंटों कोशिका वृद्धि के दौरान बैक्टीरियल nucleoid की आकृति विज्ञान जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, DAPI, नारंगी, और हरे सभी झिल्ली permeant और जीवित कोशिकाओं लेबलिंग के लिए सक्षम होना दिखाया गया10। लाइव ई. कोलाई कोशिकाओं में, डीएनए के DAPI धुंधला कोशिका और पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश perturbs nucleoid संरचना करने के लिए DAPI-सना हुआ कोशिकाओं के दोहराया जोखिम से ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण फैलाना प्रतीत होता है10। नारंगी के साथ ई. कोलाई या बी सबटिलिस धुंधला पता चलता है कि इस डाई झिल्ली permeant है और सेल विकास, डीएनए प्रतिकृति, या गुणसूत्र अलगाव प्रभाव के बिना जीवित कोशिकाओं में डीएनए के लिए बाध्यकारी पर लंबे समय तक चलने प्रतिदीप्ति प्रदान करता है10 . इन टिप्पणियों का सुझाव है कि cyanine डीएनए रंजक कई बैक्टीरिया में कोशिका वृद्धि के दौरान nucleoids की आकृति विज्ञान की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

फॉस्फोलिपिड-विशिष्ट stryl रंजक जैसे N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) फिनाइल) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; सामग्री सूची देखें) cationic यौगिकों और नकारात्मक शुल्क के साथ तरजीही रूप से संबद्ध हैं फॉस्फोलिपिड जैसे cardiolipin और phosphatidylglycerol11। अलग पैटर्न मनाया जब 4-64 विभिंन बैक्टीरिया की झिल्ली लेबल के लिए प्रयोग किया जाता है । ई कोलाईमें, 4-64 डंडे में समृद्ध है, पार्श्व दीवार के साथ बैंड में, और देर से पूर्व के विभाजन साइटों में प्रभागों कोशिकाओं12। बैसिलस सबटिलिसमें, 4-64 लेबलिंग में सक्षम बनाता है लिपिड13सर्पिल का दृश्य । एग्रोबेक्टीरियम tumefaciensमें, 4-64 बाहरी झिल्ली लेबल और एक विशेषता "घोड़े की नाल" पैटर्न जिसमें वृद्धि पोल लेबलिंग से रहित है में मनाया जाता है14,15। इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि ये जीवाणु लिपिड डोमेन जो सेलुलर विषमता में योगदान की उपस्थिति के कारण विषम लिपिड वितरण प्रदर्शन । इस तरह के प्रसार लेबलिंग की उपस्थिति के रूप में 4-64 लेबलिंग पैटर्न में परिवर्तन, blebs या बुलबुले, invaginations, या झिल्ली संकोचन निस्र्पक म्यूटेंट में जानकारीपूर्ण जा सकता है कि प्रभाव के वितरण या लिपिड के संश्लेषण ।

धुंधला कोशिकाओं से परे, प्रोटीन आवश्यक प्रक्रियाओं में भाग लेने के समारोह का निर्धारण करना आवश्यक है । आवश्यक प्रोटीन का लक्षण वर्णन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह आवश्यक जीन को नष्ट करने और phenotypic परिणामों का अध्ययन करने के लिए संभव नहीं है । इस प्रकार, वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि प्रोटीन गिरेगा उभरा है । उदाहरण के लिए, एक आवश्यक जीन अपने देशी प्रमोटर के बजाय एक inducible प्रमोटर के नियंत्रण में रखा जा सकता है । Inducible प्रवर्तकों जैसे छोटे अणुओं के लिए उत्तरदायी होते हैं; जिंक16, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, और xylose23, इस प्रकार लक्ष्य जीन की प्रतिलिपि रहता है और ब्याज की प्रोटीन जब उत्प्रेरण निकाल दिया है समाप्त हो गया है । ब्याज की कमी आवश्यक प्रोटीन के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण सिंथेटिक riboswitches24 जो छोटे अणु-आरएनए बातचीत का उपयोग करने के लिए लक्ष्य जीन की प्रतिलिपि बाधा, CRISPR हस्तक्षेप25,26 लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन ब्लॉक करने के लिए, और inducible प्रोटीन गिरावट27,28 जो पेप्टाइड टैग का उपयोग करता है ClpXP द्वारा क्षरण के लिए प्रोटीन लक्ष्य को छेड़ो । कमी उपभेदों के लक्षण वर्णन के लिए केवल एक कम समय कोशिकाओं व्यवहार्यता खो देते हैं, इसलिए, प्रोटीन की कमी के दौरान समय पर कोशिकाओं की सूक्ष्म इमेजिंग लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है । दरअसल, बैक्टीरियल कोशिकाओं के रहने वाले माइक्रोस्कोपी मौलिक जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए सक्षम है, सेल आकार रखरखाव, स्राव, और compartmentalization29के तंत्र सहित ।

a. tumefaciens एक जीवाणु संयंत्र रोगज़नक़ है30 और प्राकृतिक आनुवंशिक इंजीनियर31,३२। इस प्रकार, pathogenicity से संबंधित तंत्र, जिसमें मेज़बान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन३३,३४,३५, स्राव३६, और होस्ट परिवर्तन30,31, ३७ बड़े पैमाने पर जांच की गई है । रणनीति है कि ए. tumefaciens मध्यस्थता रोग को रोकने या संयंत्र परिवर्तन को बढ़ाने के डिजाइन करने के लिए, ए. tumefaciens अस्तित्व के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को बेहतर समझने की जरूरत है । लक्ष्य विशिष्ट रंजक और ए. tumefaciens18 के लिए एक प्रोटीन कमी रणनीति के हाल के विकास के उपयोग के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक साधन प्रदान करता है ।

यहां, wildtype के सूक्ष्म विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, उत्परिवर्ती, और प्रोटीन की कमी के उपभेदों के ए. tumefaciens प्रदान की जाती हैं । पहले दो प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे कोशिकाओं को तैयार करने के लिए और उंहें लक्ष्य विशिष्ट रंगों के साथ लेबल । तीसरा प्रोटोकॉल agarose पैड (चित्रा 1) और इमेजिंग बैक्टीरियल कोशिकाओं (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4) तैयार करने के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है. इन प्रोटोकॉल भी अतिरिक्त अनुकूलन के साथ अंय बैक्टीरिया के लिए अलग मीडिया की स्थिति, विकास दर, ऑक्सीजन आवश्यकताओं, और सेल संरचनाओं के लिए खाते के लिए उपयुक्त हो सकता है ।

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Protocol

1. A. tumefaciens उपभेदों की वृद्धि

  1. संवर्धन A. tumefaciens संवेदनहीन
    1. एक बाँझ लकड़ी छड़ी या प्लास्टिक टिप का प्रयोग करें ATGN विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर लगाना के लिए (नुस्खा के लिए सामग्री की सूची देखें) वांछित तनाव के एक एकल कॉलोनी के साथ ।
      नोट: A. tumefaciens कमी उपभेदों के लिए, ATGN आवश्यक प्रोटीन का संश्लेषण बनाए रखने के लिए एक उत्प्रेरण के रूप में 1 मिमी IPTG शामिल होना चाहिए ।
    2. २२५ rpm पर झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर ATGN में रातोंरात ए tumefaciens उपभेदों बढ़ता है ।
    3. ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) में एक spectrophotometer का उपयोग कर कोशिकाओं के ऑप्टिकल घनत्व को मापने । एक आयुध डिपो६०० = ~ ०.२ के लिए सेल संस्कृति को पतला और जब तक विकसित करने के लिए जारी६०० = ~ ०.६ तक पहुंच गया है । कमी उपभेदों के लिए, उत्प्रेरण के साथ विकसित करने के लिए जारी रखें जब तक आयुध डिपो६०० = ~ ०.६ तक पहुँच गया है.
    4. आयुध डिपो में ए. tumefaciens के wildtype और उत्परिवर्ती उपभेदों का प्रयोग करें६०० = ~ ०.६ लक्ष्य के लिए विशिष्ट धुंधला और/या समय चूक माइक्रोस्कोपी (देखें वर्गों 2 और ३.१) । कमी उपभेदों के लिए, बाहर उत्प्रेरण धोने (१.२ अनुभाग देखें.)
  2. ए tumefaciens प्रोटीन कमी उपभेदों के लक्षण वर्णन के लिए उत्प्रेरण के हटाने
    1. घातीय संस्कृति की गोली 1 मिलीलीटर (आयुध डिपो६०० = ~ 0.4-0.6) द्वारा ७,००० x जी में 5 मिनट के लिए एक डेस्कटॉप में कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक ।
    2. धोने के लिए, supernatant को दूर करने और उत्प्रेरण और गोली के रूप में ताजा मीडिया में गोली reसस्पेंड (1.2.1) ऊपर वर्णित के रूप में कोशिकाओं । ताजा मीडिया में कोशिकाओं को कुल 3 बार धोएं ।
    3. ताजा मीडिया में अंतिम गोली reसस्पेंड और एक आयुध डिपो६०० = ~ ०.८ लक्ष्य विशिष्ट रंजक (खंड 2 और चित्रा 4B-डी) या समय चूक माइक्रोस्कोपी (धारा ३.२ और चित्रा 4a) के साथ तत्काल धुंधला के लिए कोशिकाओं ध्यान केंद्रित . वैकल्पिक रूप से, पूर्व-धुंधला और कोशिकाओं की इमेजिंग करने के लिए पहले उत्प्रेरण के बिना मीडिया में कोशिकाओं को बढ़ द्वारा समय की वांछित राशि के लिए कोशिकाओं को चूस.

2. लक्ष्य-विशिष्ट A. tumefaciens कोशिकाओं के दाग

  1. फ्लोरोसेंट डी-एमिनो एसिड सेल दीवार लेबलिंग
    नोट: FDAAs गैर विषैले फ्लोरोसेंट डी अमीनो एसिड है जो आसानी से ए. tumefaciens peptidoglycan में शामिल कर रहे हैं । यह सरल लेबलिंग प्रक्रिया की जांच लाइव कोशिकाओं में विकास पैटर्न6। चार FDAAs के संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल३८उपलब्ध हैं ।
    1. गोली ५०० घातीय संस्कृति के µ एल (आयुध डिपो६०० = ~ 0.4-0.6) द्वारा एक डेस्कटॉप केंद्रापसारक में 5 मिनट के लिए ७,००० x जी पर केंद्रापसारक । १०० µ में सेल गोली ताज़ा मीडिया के एल reसस्पेंड ।
    2. 5 मिमी FDAA के 5 µ एल जोड़ें धोया और केंद्रित कोशिकाओं और अंधेरे में 2 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: प्रकाश करने के लिए FDAA जोखिम सीमा । मशीन के समय तनाव की वृद्धि दर के आधार पर भिंन होगा । आमतौर पर, मशीन समय दोहरीकरण समय6का 5-10% होना चाहिए ।
    3. से कोशिकाओं को गोली केंद्रापसारक और फॉस्फेट के साथ धोने सेल छर्रों बफर खारा (पंजाब) तीन बार ।
    4. में गोली स्थगित ~ ५० µ एल पंजाबियों ।
      नोट: फिर से निलंबन के लिए इस्तेमाल किया पंजाब की मात्रा गोली के आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
    5. लागू करें 0.8-1 कोशिकाओं के µ एल एक agarose पैड और छवि के लिए epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग तुरंत (देखें वर्गों ३.१ और ३.२).
      1. वैकल्पिक रूप से, बर्फ ठंडा ७०% इथेनॉल के साथ कोशिकाओं फिक्सिंग से आगे लेबल शामिल करना बंद करो । बर्फ के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड-ठंडा ७०% इथेनॉल और 15 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
      2. एक बाद के समय में इमेजिंग के लिए पंजाब के एक छोटे से मात्रा में केंद्रापसारक और reसस्पेंड द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा । ४८ घंटे के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस और छवि पर स्टोर सेल सस्पेंशन.
  2. DAPI या नारंगी दाग के साथ डीएनए धुंधला
    नोट: डीएनए संरचना का निरीक्षण करने के लिए, कोशिकाओं या तो DAPI या नारंगी (मृत सेल दाग) के साथ लेबल रहे हैं । हालांकि क्लासिक एक "मृत-सेल दाग" के रूप में वर्णित है, नारंगी permeant, photostable है, और बैक्टीरियल कोशिकाओं के विकास को प्रभावित नहीं करता है, लाइव सेल डीएनए इमेजिंग को सक्षम करने10। ए. tumefaciensमें, ऑरेंज लेबलिंग कोशिकाओं के रहने में अच्छी तरह से काम करता है और समय चूक माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) के लिए उपयुक्त है. इसके विपरीत, पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश इमेजिंग DAPI-सना हुआ कोशिकाओं के लिए आवश्यक जोखिम phototoxic है (चित्रा 3) और इस प्रकार DAPI धुंधला सबसे अच्छा तत्काल इमेजिंग या धुंधला स्थिर कोशिकाओं के लिए जीना कोशिकाओं धुंधला के लिए अनुकूल है ।
    1. DAPI कोशिकाओं के दाग
      1. घातीय संस्कृति की गोली 1 मिलीलीटर (आयुध डिपो६०० = ~ 0.4-0.6) द्वारा ७,००० x g में 5 मिनट के लिए एक डेस्कटॉप केंद्रापसारक में केंद्रापसारक ।
      2. वैकल्पिक रूप से, धुंधला करने से पहले कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, ७०% बर्फ के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड-शीत इथेनॉल । 10-15 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन 2.2.1.1 में वर्णित के रूप में केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा ।
      3. DAPI स्टॉक समाधान के 1 µ l युक्त पंजाब के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड (1 मिलीग्राम/एमएल; सामग्री तालिकादेखें) । pipetting और अंधेरे में 5 मिनट के लिए गर्मी से धीरे मिश्रण ।
      4. 5 मिनट के लिए ७,००० x जी पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं और पंजाब के 1 मिलीलीटर में reसस्पैंड अतिरिक्त DAPI हटाने के लिए । कोशिकाओं को धो दो और बार और ५० µ एल पंजाबियों या मीडिया में गोली reसस्पेंड ।
      5. लागू एक agarose पैड और छवि epifluorescence माइक्रोस्कोपी तुरंत का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं के 0.8-1 µ एल । ३.१ और ३.२ वर्गों देखें ।
        नोट: इस प्रोटोकॉल गुणसूत्र गतिशीलता (चित्रा 3) का पालन करने के लिए समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए इष्टतम नहीं है. एक विकल्प के रूप में नारंगी धुंधला का उपयोग करने पर विचार (अनुभाग -8 देखें) ।
    2. नारंगी लाइव कोशिकाओं के धुंधला
    3. घातीय संस्कृति की गोली 1 मिलीलीटर (आयुध डिपो६०० = ~ 0.4-0.6) द्वारा ७,००० x g में 5 मिनट के लिए एक डेस्कटॉप केंद्रापसारक में केंद्रापसारक । ऑरेंज स्टॉक समाधान के 1 µ एल युक्त पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड (सामग्री सूची देखें) । pipetting और अंधेरे में 5 मिनट के लिए गर्मी से धीरे मिश्रण ।
    4. केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं और पंजाब के 1 मिलीलीटर में reसस्पेंड अतिरिक्त नारंगी हटाने के लिए । कोशिकाओं को धो दो और बार और ५० µ l पंजाब में गोली reसस्पेंड ।
    5. लागू एक agarose पैड और छवि epifluorescence माइक्रोस्कोपी तुरंत का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं के 0.8-1 µ एल । ३.१ और ३.२ वर्गों देखें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल लाइव कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से काम करता है और समय के लिए उपयुक्त गुणसूत्र गतिशीलता (चित्रा 3) का पालन करने के लिए चूक माइक्रोस्कोपी है । यदि यह तुरंत छवि के लिए सुविधाजनक नहीं है, कोशिकाओं को बर्फ ठंडा ७०% इथेनॉल में तय हो सकता है (धारा 2.2.1.2 देखें) ।
  3. झिल्ली लेबलिंग
    नोट: lipophilic styryl फ्लोरोसेंट डाई 4-64 जीवाणु कोशिकाओं की झिल्ली का पालन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है । कई बैक्टीरिया के विपरीत, 4-64 लेबल ए. tumefaciens कोशिकाओं समान रूप से लेबल नहीं है, बल्कि अक्सर एक "घोड़े की नाल" पैटर्न14,15प्रदर्शन । उल्लेखनीय है, विकास ध्रुव दाग के लगभग विहीन है, जबकि पुराने ध्रुव तीव्रता से लेबल है । इस प्रकार, 4-64 दोनों कक्ष विकास पैटर्न और झिल्ली संरचना के दृश्य में सक्षम बनाता है A. tumefaciens।
    1. 8 µ जी के अंतिम एकाग्रता के लिए एफएम 4-64 जोड़ें/एक घातीय चरण सेल संस्कृति के 1 मिलीलीटर में मिलीलीटर और अंधेरे में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    2. गोली ७,००० एक्स जी में 5 मिनट के लिए एक डेस्कटॉप केंद्रापसारक और पंजाब के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड के लिए पर केंद्रापसारक से कोशिकाओं लेबल । अतिरिक्त डाई हटाने के लिए कोशिकाओं को तीन बार धो लें ।
    3. पंजाबियों की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित और तुरंत छवि के लिए एक agarose पैड पर हाजिर । (अनुभाग ३.१ और ३.२ देखें)
      चेतावनी: कोशिकाओं को तुरंत चित्र की विशेषता लेबलिंग पैटर्न का निरीक्षण किया जाना चाहिए ।

3. ए. tumefaciens कोशिकाओं की इमेजिंग

  1. Agarose पैड वडा
    नोट: चित्रा 1 एक छवि अनुक्रम (पैनल एक) और एक ठेठ agarose समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार पैड की योजनाबद्ध (पैनल बी) शामिल हैं । Agarose पैड आमतौर पर जरूरत के रूप में तैयार कर रहे हैं ।
    1. 3.1.1. एक गाइड के रूप में एक coverslip का प्रयोग करें और एक 22 मिमी एक्स 22 मिमी प्रयोगशाला फिल्म के वर्ग (सामग्री सूची देखें) किनारों के आसपास एक स्केलपेल चलाकर काट ।
    2. प्रयोगशाला फिल्म के केंद्र से बाहर एक वर्ग कट ~ 2-5 mm सीमा agarose पैड के लिए एक गैसकेट के रूप में सेवा करने के लिए । केंद्र कटआउट त्यागें ।
    3. एक गिलास स्लाइड पर फिल्म गैसकेट प्लेस (७५ mm x 25 mm) एक अमोनिया और शराब के साथ साफ-मुक्त क्लीनर (सामग्री सूची देखें) और गर्मी जब तक फिल्म थोड़ा गिलास पर पिघला हुआ है ( चित्र 1aमें शीर्ष छवि) । प्रयोगशाला फिल्म पिघला, एक गर्मी ७० डिग्री सेल्सियस के लिए सेट ब्लॉक के किनारे का उपयोग करें या एक लौ पर हल्के से पिघल ।
    4. मिश्रण से agarose समाधान तैयार करें ~ ०.०७५ g agarose (सामग्री सूची देखें) एक छोटी कुप्पी में मीडिया के 5 मिलीलीटर में । agarose भंग और समाधान स्पष्ट है जब तक मिश्रण करने के लिए आवधिक घूमता के साथ एक माइक्रोवेव में समाधान गर्मी. 55-70 ° c पर agarose समाधान रखें और ४८ घंटे के भीतर एकाधिक agarose पैड के निर्माण के लिए उपयोग करें ।
    5. पिपेट मीडिया 1.2 से युक्त-गैसकेट के केंद्र में 1.5% agarose ।
      नोट: मीडिया की मात्रा आमतौर पर ५०-६० µ एल है, लेकिन पाल बांधने की रस्सी आकार के आधार पर भिंन होगा । मीडिया को सर्दी की स्लाइड में जोड़ने से agarose को भी जल्दी जमना पड़ सकता है, इस प्रकार स्लाइड को गर्म सतह पर रखना चाहिए । एक गर्मी ७० ° c के लिए सेट ब्लॉक के किनारे अच्छी तरह से काम करता है । पानी agarose या फास्फेट बफर खारा (पंजाब) जैसे बफर agarose समाधान अनुप्रयोगों जिसमें सेल वृद्धि की आवश्यकता नहीं है के लिए agarose युक्त मीडिया के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । इमेजिंग कमी उपभेदों के लिए, उत्प्रेरण वर्तमान या मीडिया में अनुपस्थित हो सकता है । उत्प्रेरण की उपस्थिति एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि उत्प्रेरण की अनुपस्थिति घट phenotype प्रकट होगा ।
    6. पाल बांधने की रस्सी पर एक coverslip प्लेस को समान रूप से agarose वितरित ।
    7. एक शांत, स्तर की सतह पर स्लाइड प्लेस के लिए जमना ~ 2 मिनट । agarose पैड के अधिक सुखाने से बचने के रूप में इस agarose पैड पर एक झुर्रियों वाली सतह में परिणाम और सेल निलंबन के पूलिंग जब सतह पर लागू किया जाएगा ।
    8. ध्यान से agarose पैड बंद coverslip स्लाइड ।
      चेतावनी: इस कदम भीड़ नहीं है । agarose पैड आसानी से आंसू कर सकते है और एक असमान agarose पैड इमेजिंग मुश्किल बना सकते हैं ।
    9. पैड की सतह सूखी दिखाई देता है जब तक कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट के लिए सूखी हवा के लिए agarose पैड की अनुमति दें । एक स्केलपेल का प्रयोग, एक एयर पॉकेट (मध्यम छवि, चित्र 1a) बनाने के लिए agarose की एक छोटी सी पट्टी को हटा दें; एयर पॉकेट आम तौर पर है ~ 2 मिमी x 7-10 मिमी और ए. tumefaciens कोशिकाओं हवा जेब (चित्रा 1C) के पास सबसे अच्छा बढ़ने के लिए करते हैं.
      नोट: स्थिर कोशिकाओं के इमेजिंग के लिए या शर्तों के तहत जहां विकास पर नजर रखी नहीं है, एक हवा जेब आवश्यक नहीं है ।
    10. agarose पैड पर कोशिकाओं के 0.8-1 µ एल स्पॉट और एक नए coverslip के साथ कवर । धीरे agarose पैड की सतह भर में कोशिकाओं को वितरित करने के लिए agarose पैड के शीर्ष पर coverslip जगह है ।
    11. पिघल वलाप का उपयोग कर coverslip के किनारों को सील (देखें सामग्री तालिका रेसिपी के लिए; चित्र 1a, निचला छवि) । सभी किनारों और coverslip के कोनों के साथ सील विफलता agarose पैड के सूखने का कारण बन सकता है, जो इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं के बहाव को बढ़ावा मिलेगा । नोट: coverslip की सीलिंग केवल दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग के लिए आवश्यक है ।

Figure 1
चित्र 1: Agarose पैड तैयारी. (A) agarose पैड तैयारी प्रोटोकॉल की छवि अनुक्रम । छवि 1 प्रयोगशाला फिल्म गैसकेट के साथ एक स्लाइड है । 2 छवि में, agarose पैड और एयर पॉकेट कल्पना कर रहे हैं । अंत में, 3 छवि एक coverglass के तहत कोशिकाओं के साथ पूरा agarose पैड से पता चलता है और वलाप के साथ बंद कर दिया । (ख) समय-चूक माइक्रोस्कोपी के लिए एक agarose पैड की एक योजनाबद्ध प्रदान की जाती है । agarose पैड की मुख्य विशेषताएं योजनाबद्ध पर लेबल हैं । (ग) एयर पॉकेट agarose पैड पर ए. tumefaciens के विकास को बढ़ावा दिया । wildtype ए. tumefaciens कोशिकाओं की छवियां 20 घंटे के लिए एक agarose पैड पर हो दिखाए जाते हैं । छवियों को हवा जेब से तेजी से दूर पदों पर ले जाया गया । हवा की जेब के लिए छवि के निकटतम किनारे से दूरी प्रत्येक छवि के ऊपर दिखाया गया है । स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

  1. इमेजिंग
    नोट: विभेदक हस्तक्षेप इसके विपरीत, चरण इसके विपरीत, और epifluorescence इमेजिंग एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ हार्डवेयर आधारित स्वत: फोकस, एक स्वचालित चरण, मानक फिल्टर, एक एलईडी प्रकाश स्रोत, 60X तेल विसर्जन से सुसज्जित किया जाता है उद्देश्य (१.४ NA) के लिए चरण कंट्रास्ट या विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग), और एक एक से अधिक इलेक्ट्रॉन गुणा-चार्ज-युग्मित-डिवाइस (EMCCD) कैमरा । माइक्रोस्कोप एक तापमान नियंत्रित कमरे में रखा जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, एक मंच गर्म या चैंबर इमेजिंग के दौरान लगातार तापमान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. Epifluorescence माइक्रोस्कोपी
      नोट: लाइव कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, यह छवि अधिग्रहण की संख्या को सीमित करने और photobleaching और phototoxicity को कम करने के लिए जोखिम समय का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है. प्रत्येक डाई की इमेजिंग के लिए, यह एक इष्टतम जोखिम समय है जो पर्याप्त प्रतिदीप्ति पता लगाने प्रदान करता है खोजने के लिए सिफारिश की है, लेकिन photobleaching या phototoxicity के लिए नेतृत्व नहीं करता है । आंकड़ों में 2-4, २०० एमएस के एक्सपोजर टाइंस सभी प्रतिदीप्ति छवियों के लिए इस्तेमाल किया गया । समय-चूक चित्रा 3में दिखाया दृश्यों के लिए, छवियों 3 एच के लिए हर 10 मिनट का अधिग्रहण किया गया.
      1. इच्छित उद्देश्य पर विसर्जन तेल लगाएं और उल्टे स्लाइड को मंच पर स्लाइड होल्डर में रखें । फोकस knobs का उपयोग करने के लिए ध्यान में कोशिकाओं को लाने के लिए ।
      2. चरण (या उद्योग) और वांछित प्रतिदीप्ति फिल्टर में छवियों को प्राप्त करें ।
        नोट: चित्रा 2में इस्तेमाल दाग के लिए अधिक से अधिक उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, चित्रा 3, और चित्रा 4 इस प्रकार हैं: हाडा (405/460), नाडा (450/555), टाडा (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), नारंगी (547/570).
    2. समय चूक माइक्रोस्कोपी
      ध्यान दें: समय के दौरान चूक माइक्रोस्कोपी निम्नलिखित विशेषताएं कंप्यूटर नियंत्रित कर रहे हैं: एक्स, वाई, और जेड स्थिति, बंद, और प्रतिदीप्ति फिल्टर. एक हार्डवेयर-आधारित ऑटो-फोकस सिस्टम समय-चूक इमेजिंग के दौरान फ़ोकस बनाए रखने के लिए इष्टतम है । वैकल्पिक रूप से, एक सॉफ्टवेयर आधारित ऑटो-फोकसिंग लूप का उपयोग किया जा सकता है ।
      1. इच्छित उद्देश्य पर विसर्जन तेल लगाएं और उल्टे स्लाइड को मंच पर स्लाइड होल्डर में रखें । फोकस knobs का उपयोग करने के लिए ध्यान में कोशिकाओं को लाने के लिए ।
      2. वैकल्पिक रूप से: प्राप्त एकाधिक (एक्स, वाई) पदों । बेतरतीब ढंग से agarose पैड की हवा की जेब के लिए करीब निकटता में कोशिकाओं के 10 क्षेत्रों का चयन करें ।
      3. सेट-अप करने के लिए इच्छित समय अंतराल पर चरण या उद्योग में छवि के लिए समय अनुक्रम अधिग्रहण ।
        नोट: समय चूक अनुक्रम के लिए चित्रा 4में दिखाया गया है, के लिए 30 एमएस जोखिम के साथ हर 10 मिनट 14 घंटे के लिए । समय चूक माइक्रोस्कोपी के दौरान प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करते हैं, photobleaching और phototoxicity को कम करने के लिए अधिग्रहण अंतराल और जोखिम समय समायोजित करें ।

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Representative Results

wildtype का लक्ष्य-विशिष्ट लेबल िंग अ. tumefaciens कक्ष
आदेश में कि कक्ष आकृति विज्ञान धो कदम या उपचार द्वारा 1% DMSO के साथ प्रभावित नहीं है (जो फ्लोरोसेंट रंजक को पतला करने के लिए प्रयोग किया जाता है), कोशिकाओं संस्कृति से सीधे imaged थे (आंकड़ा 2a, अभी तक छोड़ दिया पैनल), द्वारा कोशिकाओं को धोने के बाद केंद्रापसारक के रूप में १.२ में वर्णित (चित्रा 2a, बाएं पैनल), या 10 मिनट के लिए 1% DMSO के साथ कोशिकाओं की मशीन के बाद और (चित्रा 2a, सही पैनल) धोने । इन छवियों कि आकृति विज्ञान धोने या DMSO की उपस्थिति से प्रभावित नहीं है कि वर्णन । इसके अलावा, सेल विकास धोने या DMSO विकास वक्र विश्लेषण (नहीं दिखाया गया है) के आधार पर उपचार द्वारा प्रभावित नहीं है । इसके अलावा, बर्फ के साथ ए tumefaciens फिक्सिंग-शीत इथेनॉल आकृति विज्ञान (चित्रा 2a, अभी तक सही पैनल) में सकल परिवर्तन का कारण नहीं है ।

अगला, लक्ष्य विशिष्ट रंजक सेल दीवार की उत्पत्ति, झिल्ली डोमेन, और wildtype . tumefaciens कोशिकाओं के भीतर डीएनए का पालन किया गया । नई peptidoglycan प्रविष्टि के पैटर्न तीन फ्लोरोसेंट-डी अमीनो एसिड के साथ लेबलिंग के बाद मनाया गया: हाडा (चित्रा 2 बी, बाएं पैनल), नाडा (चित्रा बीसी, केंद्र पैनल), और टाडा (चित्रा 2c, सही पैनल) । सभी तीन लेबलिंग प्रयोगों में, नए peptidoglycan लेबलिंग को ग्रोथ पोल या कोशिकाओं के पट पर समृद्ध किया गया था । इन विकास पैटर्न लगातार सभी तीन FDAAs के साथ मनाया गया, यह दर्शाता है कि FDAA चयन अंय दाग या फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के साथ दोहरी लेबलिंग सक्षम संशोधित किया जा सकता है । lipophilic डाई 4-64 तरजीही एक विशिष्ट घोड़े की नाल पैटर्न (चित्रा 2c) में जिसके परिणामस्वरूप tumefaciens कोशिकाओं के पुराने ध्रुव क्षेत्र लेबल । दोनों नारंगी (चित्रा 2d, बाएँ पैनल) और DAPI (चित्रा 2d, दाएँ पैनल) लाइव ए. tumefaciens कोशिकाओं के भीतर लेबल डीएनए. देर से पूर्व में प्रमंडलीय कोशिकाओं, दो अलग nucleoids नारंगी धुंधला के साथ मनाया जाता है, जबकि डीएनए लेबलिंग DAPI धुंधला (चित्रा 2d) प्रयोगों के परिणाम के साथ सुसंगत के साथ फैलाना प्रतीत होता है ई. कोलाई10में मनाया ।

समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए डीएनए रंजक की उपयुक्तता
आदेश में निर्धारित करने के लिए यदि या तो DAPI या नारंगी समय के लिए उपयुक्त हैं-चूक इमेजिंग के दौरान nucleoid आकृति विज्ञान, unलेबल की एक बराबर अनुपात, DAPI-त्यसपछि, और नारंगी-लेबल wildtype A. tumefaciens कोशिकाओं को मिलाया गया था और पर देखा agarose पैड. 0 समय पर, प्रारंभिक छवियां चरण कंट्रास्ट, DAPI, और TRITC फ़िल्टर्स का उपयोग करके यह निर्धारित करने के लिए ली गई थी कि प्रत्येक कक्ष को लेबल किया गया था । सेल मिश्रण तो तीन विभिंन स्थितियों के तहत imaged थे: (1) चरण इसके विपरीत माइक्रोस्कोपी ही, (2) चरण कंट्रास्ट और epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर TRITC फ़िल्टर और (3) चरण कंट्रास्ट और epifluorescence माइक्रोस्कोपी DAPI फ़िल्टर का उपयोग कर । छवियों को 3 घंटे के लिए हर 10 मिनट का अधिग्रहण किया गया । सभी कोशिकाओं को अच्छी तरह से किया फ्लोरोसेंट दाग जब चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का संकेत है कि न तो नारंगी या DAPI धुंधला सेल विकास (चित्रा 3, शीर्ष पैनल) के साथ imaged के बावजूद हुआ । सभी कोशिकाओं को भी अच्छी तरह से जब चरण माइक्रोस्कोपी और epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged TRITC फ़िल्टर (चित्रा 3, केंद्र पैनल) का उपयोग कर बढ़ी । ऑरेंज लेबल photobleaching के अधीन है, लेकिन कम 2 घंटे (२०० ms के 13 कुल जोखिम) के लिए मनाया जा सकता है, जीवित कोशिकाओं की अल्पकालिक माइक्रोस्कोपी के लिए इस डाई की उपयुक्तता का संकेत. लेबलिंग के बावजूद, सभी कोशिकाओं को एक घंटे के भीतर बढ़ रही है जब चरण माइक्रोस्कोपी और epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged DAPI फ़िल्टर (चित्रा 3, नीचे पैनल) का उपयोग कर बंद करो । यह अवलोकन दर्शाता है कि ए. tumefaciens यूवी एक्सपोजर के प्रति संवेदनशील है और इंगित करता है कि इमेजिंग के लिए एक यूवी फिल्टर की आवश्यकता होती है कि रंजक समय चूक सूक्ष्म प्रयोगों के लिए बचा जाना चाहिए ।

समय-चूक इमेजिंग और एक के लक्ष्य विशेष लेबल िंग अ. tumefaciens घट तनाव
दोनों संतृप्त transposon mutagenesis३९ और एक विलोपन तनाव का निर्माण करने में विफल18,४० संकेत मिलता है कि मास्टर नियामक प्रोटीन, CtrA, ए. tumefaciensमें आवश्यक है । के लिए कमी उपभेदों, एक पहले वर्णित ctrA कमी तनाव के सूक्ष्म विश्लेषण के मूल्य का प्रदर्शन18 माइक्रोस्कोपी द्वारा लक्षण वर्णन के अधीन था । चित्रा 4a, समय-चूक माइक्रोस्कोपी में ctrA घट कोशिकाओं है जिसमें ctrA अभिव्यक्ति प्रेरित (ऊपर) और प्रेरित (नीचे) था की वृद्धि की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । CtrA की उपस्थिति में, एक एकल सेल 14 घंटे के भीतर एक microcolony को जंम दिया । इसके विपरीत, जब CtrA समाप्त हो गया था, कोशिकाओं को या तो लीजड या विभाजित करने में विफल रहा है । कोशिकाओं है कि मध्य सेल से और सेल खंभे पर इकट्ठा सहित सकल रूपात्मक परिवर्तन की प्रदर्शनी विभाजित करने में विफल रहे । इन टिप्पणियों का सुझाव है कि CtrA सेल प्रभाग के विनियमन में एक महत्वपूर्ण समारोह है ।

चित्रा 4B-डीमें, फ्लोरोसेंट रंजक प्रेरण या ctrA की कमी के बाद 10 एच कोशिकाओं के लिए ctrA कमी तनाव की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया 2 मिनट के लिए नाडा के साथ लेबल पल्स थे (चित्रा 4B) । जब CtrA (शीर्ष पैनल) मौजूद था, ध्रुवीय peptidoglycan के संश्लेषण मनाया गया । इसके विपरीत डंडे में व्यापक नाडा ्र हुई और बड़े मध्य कोशिका की सूजन तब हुई जब CtrA समाप्त हो गया. इस प्रेक्षण कोशिकाओं को विभाजित करने की विफलता के बावजूद जारी peptidoglycan संश्लेषण के अनुरूप है । cyanine डीएनए डाई ऑरेंज ctrA घट तनाव (चित्रा 4c) में डीएनए वितरण की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया था. जब CtrA मौजूद था, बढ़ती कोशिकाओं डीएनए का एक भी वितरण किया था और nucleoids के अलगाव एक देर से पूर्व डिवीजनल सेल में स्पष्ट था; इसके विपरीत, जब CtrA समाप्त हो गया था, डीएनए असमान कोशिकाओं भर में वितरित किया गया था । इन टिप्पणियों का सुझाव है कि CtrA उचित डीएनए प्रतिकृति या अलगाव के लिए योगदान देता है । अंत में, ctrA घट कोशिकाओं 4-64 (चित्रा 4d) के साथ लेबल थे । CtrA की उपस्थिति में, कोशिका झिल्ली एक विशेषता घोड़े की नाल पैटर्न जिसमें वृद्धि पोल दाग से रहित था के साथ लेबल था । कोशिकाओं में CtrA के समाप्त, 4-64 के लिए पूरी झिल्ली लेबल दिखाई दिया, हालांकि एक पोल और अधिक तीव्रता से सना हुआ था । इस अवलोकन से पता चलता है कि झिल्ली बरकरार रहती है, हालांकि लिपिड microdomain संगठन बाधित हो सकता है जब CtrA समाप्त हो गया है ।

Figure 2
चित्र 2: लक्ष्य विशिष्ट रंगों के साथ लेबल किए गए wildtype एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens कक्षों की प्रतिनिधि छवियां । (क) वाशिंग प्रोटोकॉल के पहले और बाद के a. tumefaciens कक्षों की चरण कंट्रास्ट छवियां, जब 1% DMSO के साथ, या बर्फ-शीत इथेनॉल के साथ निर्धारण के बाद इलाज किया गया हो । (ख) ए. tumefaciens कोशिकाओं के ध्रुवीय विकास फ्लोरोसेंट डी अमीनो एसिड हाडा, नाडा, और टाडा के साथ लेबलिंग द्वारा दिखाया गया है । (ग) lipophilic 4-64 दाग के साथ ए. tumefaciens के दाग । (घ) डीएनए के साथ ए. tumefaciens कोशिकाओं के दाग-विशिष्ट रंजक नारंगी और DAPI. पैनलों बी डी के लिए, चरण कंट्रास्ट (ऊपर) और epifluorescence (नीचे) छवियां दिखाई जाती हैं । सेल रूपरेखा संदर्भ के लिए प्रतिदीप्ति छवियों में प्रदान की जाती हैं । स्केल बार = 2 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लाइव ए. tumefaciens कोशिकाओं में डीएनए के DAPI और ऑरेंज लेबलिंग की तुलना. लेबल के समान अनुपात, DAPI-लेबल, और नारंगी-लेबल्ड wildtype A. tumefaciens कक्षों को मिश्रित और agarose पैड पर देखा गया । 0 समय पर, प्रारंभिक छवियां चरण कंट्रास्ट, TRITC, और DAPI फ़िल्टर्स का उपयोग करके यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कक्ष लेबल किए गए थे । (क) अनलेबल की समय-चूक, DAPI-लेबल, और नारंगी-लेबल वाले कक्ष विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged कोशिकाओं । (ख) TRITC फ़िल्टर का उपयोग करते हुए चरण माइक्रोस्कोपी और epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged अनलेबल्ड, DAPI-लेबल, और नारंगी-लेबल वाले कक्षों की समय-चूक । (ग) DAPI फ़िल्टर का उपयोग करते हुए चरण माइक्रोस्कोपी और epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged अनलेबल्ड, DAPI-लेबल, और नारंगी-लेबल की हुई कोशिकाओं की समय-चूक । स्केल बार = 2 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रेरित और प्रेरित स्थितियों में ctrA घट तनाव के प्रतिनिधि छवियां । (एक) शर्तों के तहत ctrA कमी तनाव की समय चूक माइक्रोस्कोपी जहां ctrA प्रेरित (ऊपर) या समाप्त (नीचे) था । प्रत्येक पैनल के ऊपर की संख्या घंटे में समय का संकेत है । (B) चरण कंट्रास्ट (बाएं) और epifluorescence (दाएं) नाडा के साथ लेबल की गई कक्षों की छवियां । (C) चरण कंट्रास्ट (बाएं) और प्रतिदीप्ति (दाएं) नारंगी के साथ लेबल की गई कक्षों की छवियां । (D) चरण कंट्रास्ट (बाएं) और प्रतिदीप्ति (दाएं) 4-64 के साथ लेबल किए गए कक्षों की छवियां । संदर्भ के लिए प्रतिदीप्ति छवियों में सेल रूपरेखा प्रदान की गई । स्केल बार = 2 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में ए. tumefaciens wildtype, उत्परिवर्ती, और कमी उपभेदों की जांच के लिए प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला है । यह ध्यान देने योग्य है कि प्रोटोकॉल अनुभाग में सूचीबद्ध प्रक्रियाओं के सभी आसानी से अतिरिक्त संशोधनों के साथ अंय जीवाणु उपभेदों के लिए विकास मीडिया, तापमान, और विकास दर के लिए खाते में अनुकूलित किया जा सकता है लायक है ।

लक्ष्य विशेष रंजक का उपयोग बैक्टीरियल कोशिकाओं में कोशिका चक्र की घटनाओं की एक विस्तृत लक्षण वर्णन प्रदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । यहां, peptidoglycan सम्मिलन पैटर्न फ्लोरोसेंट-डी-अमीनो एसिड का उपयोग कर मनाया गया, लिपिड डोमेन 4-64 के साथ visualized थे, और nucleoids या तो DAPI या नारंगी के साथ लेबल थे. प्रोटोकॉल के प्रत्येक धोने प्रोटोकॉल के अनुकूलन के बाद अंय बैक्टीरिया में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और यह सुनिश्चित करना है कि DMSO उपचार विकास या आकृति विज्ञान ख़राब नहीं करता है । मुख्य विचार के लिए एक बफर के चयन धोने के कदम, लेबल के लिए मशीन लगाना समय शामिल है, और एक उपयुक्त fluorophore के चयन के लिए ऑटो प्रतिदीप्ति से बचने के लिए या मल्टीप्लेक्स लेबलिंग अध्ययन को सक्षम करने के लिए । उदाहरण के लिए, lipophilic लाल-फ्लोरोसेंट झिल्ली दाग (4-64) के लिए एक विकल्प हरे-फ्लोरोसेंट झिल्ली दाग (1-43) है । इसी प्रकार, नीला-, हरा-, और लाल-फ्लोरोसेंट-डी-एमिनो एसिड उपलब्ध है6,३८ और डी-एमिनो एसिड biorthogonal हैंडल के साथ क्लिक करें रसायन6,7के माध्यम से आम fluorophores को संयुग्मित जा सकता है । अंत में, ऑरेंज के अलावा-फ्लोरोसेंट cyanine डीएनए डाई, एक हरी फ्लोरोसेंट cyanine डीएनए डाई उपलब्ध है और लाइव बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से करता है10. प्रमुख सेल लक्ष्य विशेष रंजक के साथ लेबल संरचनाओं के दृश्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रेक्षण के साथ संयुक्त किया जा सकता है बैक्टीरिया में आवश्यक प्रक्रियाओं में यंत्रवत अंतर्दृष्टि लाभ ।

इन प्रोटोकॉल ए. tumefaciens कमी दाग के सूक्ष्म अवलोकन के लिए आवश्यक शर्तों में शामिल है और यह अंय बैक्टीरिया में प्रोटीन कमी उपभेदों के लिए इन तरीकों का विस्तार संभव होना चाहिए । घट उपभेदों के लक्षण वर्णन विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है के रूप में वहां एक सीमित समय सीमा है जांच पूरी करने से पहले कोशिकाओं बढ़ रही है या लाइसे बंद करो । यह पर्याप्त रूप से कोशिकाओं को धोने के लिए लेबलिंग के दौरान अतिरिक्त डाई के सभी निशान हटाने के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि, कुछ आवश्यक प्रोटीन के समाप्त कोशिकाओं को अपने सेल में दोष है सतहों जो उंहें कदम धोने के प्रति संवेदनशील होने के लिए कारण हो सकता है । सेल संस्कृतियों के शुरुआती वॉल्यूम को बढ़ाने से वॉश स्टेप्स के दौरान कोशिकाओं के नुकसान की भरपाई में मदद मिल सकती है । कमी उपभेदों जो कोशिका झिल्ली या सेल दीवारों समझौता किया है सेल lysis के लिए प्रवण हो सकता है जब उत्प्रेरण बिना तरल संस्कृति में हो । एक osmoprotectant का समावेश (5% सुक्रोज के लिए अच्छी तरह से काम करता है . tumefaciens) में कमी के दौरान कक्ष आकृति विज्ञान और सीमा सेल lysis बनाए रखने में मदद कर सकते हैं । यह empirically करने के लिए समय की उचित राशि का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है पूर्व कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट डाई के साथ धुंधला करने से पहले गिरेगा । permeablized झिल्ली या कोशिका दीवारों के साथ कोशिकाओं को सेल lysis या देर से कमी समय अंक की इमेजिंग विशेष रूप से चुनौती दे फ्लोरोसेंट reएजेंट के साथ गैर चयनात्मक लेबल का खतरा हो सकता है ।

समय के लिए एक महत्वपूर्ण कदम ए tumefaciens (या अंय जीवाणु कोशिकाओं) के चूक माइक्रोस्कोपी agarose पैड की तैयारी है । agarose पैड को समय-चूक माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के दौरान अच्छा ध्यान सुनिश्चित करने के लिए स्तर की जरूरत है । इसके अलावा, coverslip पूरी तरह से सुखाने और फोकल विमान बदलने से agarose पैड को रोकने के लिए बंद किया जाना चाहिए । A. tumefaciensके लिए, कोशिका वृद्धि के लिए ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है । एक एयर पॉकेट के पास इमेजिंग लंबे समय से चूक माइक्रोस्कोपी प्रयोगों (चित्रा 1C) के दौरान ए. tumefaciens की मजबूत वृद्धि प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. यदि कोशिकाओं को बढ़ने या बस कुछ ही घंटों के बाद बढ़ती रोक विफल, यह एक बड़ा हवा जेब और हवा जेब के पास छवि के साथ एक agarose पैड तैयार करने के लिए सलाह दी जाती है । यहां तक कि एक उचित हवा जेब के साथ एक अच्छी तरह से निर्माण agarose पैड ~ 24 एच की एक अधिकतम के लिए केवल एक. tumefaciens विकास का समर्थन कर सकते हैं । यदि लंबे समय तक चूक अनुक्रम आवश्यक हैं, microfluidics या प्रवाह कोशिकाओं के रूप में वैकल्पिक दृष्टिकोण पर विचार किया जाना चाहिए । यदि कोशिकाओं इमेजिंग के दौरान ध्यान से बाहर बहाव, सुनिश्चित करें कि agarose पैड स्तर है और ठीक से coverslip के तहत बंद । ध्यान दें कि यहां तक कि एक के पास सही agarose पैड के साथ, यह संभव है कि कुछ कोशिकाओं को ध्यान से बाहर बहाव होगा, इस प्रकार कई क्षेत्रों इमेजिंग और अक्सर refocusing अत्यधिक की सिफारिश कर रहे हैं । अन्य बैक्टीरिया के लिए, agarose पैड की तैयारी के वैकल्पिक दृष्टिकोण४१,४२,४३ सबसे अच्छा जीवाणु के लिए वृद्धि आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए विचार किया जाना चाहिए. Agarose पैड भी समय चूक आवश्यक नहीं है जब लेबल या फिक्स्ड कोशिकाओं की इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए उपयोगी होते हैं । इस मामले में, सील coverslip आवश्यक नहीं है और agarose पैड जो बाद में जब तक संग्रहीत किया जा सकता है के निर्माण के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण४३उपयुक्त हो सकता है ।

कुल मिलाकर, लक्ष्य विशिष्ट रंजक और समय चूक माइक्रोस्कोपी के उपयोग बैक्टीरिया में मौलिक प्रक्रियाओं के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । यहां, हम lipophilic 4-64 डाई और विशेषता ध्रुवीय और septal फ्लोरोसेंट-डी-एमिनो एसिड के साथ लेबलिंग के सामांय घोड़े की नाल पैटर्न उदाहरण देकर स्पष्ट करना ए. tumefaciensमें । ए. tumefaciens में इन नमूनों की टिप्पणियों इस जीवाणु४४ के ध्रुवीय विकास के साथ संगत कर रहे है और यह संभावना है कि इसी तरह के अध्ययन अंय बैक्टीरिया में विकास के पैटर्न के बारे में जानकारी प्रकट हो सकता है । लग रहा है कि नारंगी जैसे cyanine रंजक समय के लिए उपयुक्त है चूक सूक्ष्म अध्ययन10 (चित्रा 3) wildtype और उत्परिवर्ती उपभेदों में सेल विकास के दौरान nucleoid आकृति विज्ञान के सावधान अध्ययन सक्षम हो जाएगा । इमेजिंग फ्लोरोसेंट लक्ष्य विशेष रंजक एक आवश्यक प्रोटीन की कमी के दौरान महत्वपूर्ण टिप्पणियों प्रदान करने के लिए प्रोटीन के समारोह का निर्धारण कर सकते हैं । अंत में, के बाद से इन रंगों के कई अलग वर्णक्रमीय गुणों के साथ उपलब्ध हैं, अध्ययन एकाधिक लेबल का उपयोग एक साथ सेल चक्र प्रगति के दौरान आवश्यक प्रक्रियाओं के समंवय में अंतर्दृष्टि सक्षम होना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम चित्रा 2 और चित्रा 4में इस्तेमाल FDAAs के उपहार के लिए माइकल VanNieuwenhze (इंडियाना विश्वविद्यालय) का शुक्र है । हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान प्रतिक्रिया के लिए ब्राउन लैब के सदस्यों को धंयवाद । ए. tumefaciens सेल वृद्धि और विभाजन पर ब्राउन लैब में अनुसंधान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOS1557806) द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58 ATCC 33970 Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH Fisher BioReagents BP359
KH2PO4 Fisher Chemical P288
20X AT Salts Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4 Fisher Chemical A701
MgSO4•7H2O Fisher BioReagents BP213
CaCl2•2H2O Fisher BioReagents BP510
MnSO4•H2O Fisher Chemical M114
Glucose Fisher Chemical D16 Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar Fisher BioReagents BP1423 Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name Company Catalog Number Comments
Optional Media Additives
Kanamycin GoldBio K-120 Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG GoldBio I2481C5 Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides Fisherbrand 12-550D 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-541-B 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner Home Depot 203261385 Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose Invitrogen 16500-100 Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS Fisher BioReagents BP399500 10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm Bemis PM-999 Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter SAAQIN SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly Target Corp. 06-17644
Paraffin Wax Crafty Candles 263012
Name Company Catalog Number Comments
Target-specific dyes
DMSO Fisher BioReagents BP231-1 Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA) FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S11368 Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64 Invitrogen T3166 Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dry bath Sheldon Manufacturing, Inc. 52120-200
Metallic thermal beads Lab Armor 42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.

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सूक्ष्म जीव विज्ञान १२९ अंक एग्रोबेक्टीरियम आवश्यकता समय चूक माइक्रोस्कोपी agarose पैड फ्लोरोसेंट डी अमीनो एसिड डीएनए धुंधला झिल्ली धुंधला epifluorescence माइक्रोस्कोपी
लाइव सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी माइक्रोबियल सेल विकास के दौरान आवश्यक प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए
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