Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

يعيش خلية Fluorescence مجهرية لمراقبة العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا الميكروبية

Published: November 24, 2017 doi: 10.3791/56497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

Summary

فهم وظيفة العمليات الأساسية في البكتيريا هو التحدي. مجهر الأسفار مع صبغات محددة الهدف يمكن أن توفر أفكاراً رئيسية في تطور النمو ودورة الخلية الخلية الجرثومية. هنا، tumefaciens المتبعة بكتيريا نموذجي لتسليط الضوء على أساليب لتصوير الخلايا الحية لوصف العمليات الأساسية.

Abstract

العمليات الخلوية الأساسية مثل تكرار الحمض النووي، والعزل وتخليق البروتين وتخليق جدار الخلية الحيوي وانقسام الخلية تعتمد على وظيفة البروتينات التي ضرورية لبقاء البكتيرية. يمكن استخدام مجموعة من الأصباغ محددة الهدف كما المسابير لتحسين فهم هذه العمليات. التلوين بالأصباغ محبتين يتيح مراقبة بنية الغشاء، والتصور من الدهون ميكرودومينس، والكشف عن غشاء بليبس. يمكن أن تشير إلى استخدام الأحماض الأمينية فلوري د (فداس) للتحقيق في مواقع التركيب الحيوي peptidoglycan العيوب المحتملة في نشوء حيوي جدار الخلية أو الخلايا النمو الزخرفة. وأخيراً، يمكن أن تشير إلى بقع الحمض النووي العيوب المحتملة في فصل النسخ المتماثل أو صبغي الحمض النووي. الحمض النووي سينين البقع تسمية الخلايا الحية، وهي مناسبة للوقت الفاصل بين الفحص المجهري تمكن الملاحظات في الوقت الحقيقي مورفولوجية نوكليويد أثناء نمو الخلايا. يمكن تطبيق البروتوكولات لوسم الخلية على طفرات نضوب البروتين لتحديد العيوب في هيكل غشاء أو جدار الخلية نشوء حيوي أو العزل الصبغي. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الوقت الفاصل بين الفحص المجهري لرصد التغييرات الشكلية بروتين ضروري إزالة، ويمكن أن توفر أفكاراً إضافية في وظيفة البروتين. على سبيل المثال، نتائج استنزاف البروتينات انقسام الخلية الأساسية في فيلامينتيشن أو المنطق التفريعي، بينما قد يؤدي استنفاد بروتينات الخلية نمو الخلايا لتصبح أقصر أو مستدير. هنا، يتم توفير بروتوكولات لنمو الخلايا، ووسم محددة الهدف، والوقت الفاصل بين الفحص المجهري لمسببات الأمراض النباتية البكتيرية tumefaciens المتبعة. معا، صبغات محددة الهدف والوقت الفاصل بين الفحص المجهري تمكن وصف العمليات الأساسية في tumefaciens أ. وأخيراً، يمكن سهولة تعديل البروتوكولات المقدمة للتحقيق في العمليات الأساسية في بكتيريا أخرى.

Introduction

ويتطلب التقدم خلال دورة الخلية البكتيرية تنسيق العديد من العمليات بما في ذلك تخليق جدار الخلية والغشاء الحيوي وتكرار الحمض النووي والعزل، وانقسام الخلايا. لنفهم تماما تعقيد بيولوجيا الخلايا البكتيرية، من الضروري دراسة هذه الأحداث الأساسية؛ ومع ذلك، هذا مهمة غير عادية منذ صلاحية خلية للخطر عندما يتم موتاجينيزيد المكونات الرئيسية لهذه المسارات. ابيفلوريسسينسي المجهري مقترنة بالأصباغ محددة الهدف نهج قوية للتحقيق في هذه العمليات الأساسية في wildtype والسلالات البكتيرية المسخ.

الأصباغ بيبتيدوجليكان محددة تشمل المضادات الحيوية الفلورسنت (فانكوميسين-فلوريدا، فلوريدا بوسيلين) والأحماض الأمينية فلوري د (على سبيل المثال، 7-هيدروكسيكومارين-3-كاربوكسيليك حمض-3-أمينو-د-ألانين، الهدا؛ 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-د-ألانين ، ندى؛ تيتراميثيلرهوداميني-3-أمينو-د-ألانين؛ الأنشطة الإرهابية والتخريبية). في بكتيريا إيجابية، تم استخدام التركيزات المقاسة من الفلورسنت النظير المضادات الحيوية للتحقيق في مواقع من peptidoglycan الحيوي استراتيجية فعالة للكشف عن أنماط peptidoglycan الإدراج1،2، 3،4. بينما وسم فانكومايسين الفلورية قد استخدمت لاكتساب نظرة ثاقبة peptidoglycan أنماط الإدراج في بكتيريا سلبية الغرام الثابتة5، الغشاء الخارجي يوفر عموما نفاذية حاجز الذي يمنع استخدام فلوري المضادات الحيوية مجس تخليق peptidoglycan الحيوي في الخلايا الحية. وفي المقابل، نبضات قصيرة من الأحماض الأمينية فلوري د أو الأحماض الأمينية د مع المجموعات الوظيفية بيورثوجونال تساهمي تسمية مناطق الإدراج peptidoglycan الأخيرة في مجموعة واسعة من الخلايا البكتيرية الحية6،7. وتشمل أنماط الإدراج peptidoglycan التي لوحظت مع الأحماض الأمينية د الاصطناعية الشروريه والحاجز (الإشريكيّة القولونية و نجحت Bacillus)، القطبية والحاجز (tumefaciens المتبعة و الليستريه المستوحدة)، الحاجز فقط (المكوّرات العنقودية الذهبية)، وقمي (فنزويلا متسلسلة)6،7. هذه الملاحظات تشير إلى أن البكتيريا معرض أنماط متنوعة من نشوء حيوي جدار الخلية وأن استخدام الأحماض الأمينية د الاصطناعية كمجسات لدراسة الزخرفة النمو قيمة استراتيجية في العديد من البكتيريا.

وتشمل الأصباغ التي تسمية الكروموسومات البكتيرية الموثق الاخدود ثانوية محددة الحمض الخلوي الصبغي (DNA) (4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي؛ DAPI) والأصباغ سينين تقارب عالية (الأخضر والبرتقالي؛ انظر قائمة المواد). DAPI تلطيخ الخلايا الثابتة ويساعد في تعداد البكتيريا من عينات بيئية8، بينما DAPI تلطيخ الخلايا الحية تستخدم للإشارة إلى بقاء البكتيرية9. وفي المقابل، سينين الأصباغ مثل البرتقالي والأخضر كثيرا ما يوصف بغشاء الخلية "ميتة" إيمبيرمينت البقع تعداد الخلايا غير قابل للحياة9. بشكل ملحوظ، عندما يتم استخدام هذه الكواشف للتحقيق مورفولوجية نوكليويد البكتيرية أثناء نمو الخلايا، DAPI والبرتقالي، والأخضر كانت كلها تبين أن غشاء بيرمينت وقادرة على تسمية الخلايا الحية10. تعيش خلايا كولاي , DAPI تلطيخ الحمض النووي يظهر منتشر بسبب السيارات-الأسفار من السيتوبلازم والتعرض المتكرر من الخلايا DAPI الملون للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) إزعاجا هيكل نوكليويد10. كولاي المصبوغة أو باء-نجحت مع أورانج يكشف أن هذه الصبغة غشاء بيرمينت ويوفر fluorescence طويلة الأمد عند ربط الحمض النووي في الخلايا الحية دون التأثير على نمو الخلايا أو تكرار الحمض النووي الصبغي العزل10 . هذه الملاحظات تشير إلى أنه يمكن استخدام الأصباغ سينين الحمض النووي لرصد مورفولوجية نوكليويدس أثناء نمو الخلية في العديد من البكتيريا.

فوسفوليبيدسبيسيفيك ستريل الأصباغ مثل N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) فينيل) هيكساترينيل) dibromide بيريدينيوم (4-64؛ انظر قائمة المواد) هي مركبات الأيوني والمنتسبين تفضيلي مع اتهم سلبا فوسفوليبيدات مثل كارديوليبين وفوسفاتيديلجليسيرول11. ولوحظت أنماط متميزة عندما يتم استخدام 4-64 لتسمية غشاء البكتيريا المختلفة. في الإشريكيّة القولونية، 4-64 المخصب في القطبين، في عصابات على طول الجدار الجانبي، وفي مواقع شعبة في وقت متأخر بريديفيسيونال الخلايا12. نجحت عصية، وسم 4-64 يمكن التصور من الدهن اللوالب13. في tumefaciens المتبعة، 4-64 تسميات الغشاء الخارجي، ومن الملاحظ في نمط مميز "حدوة" الذي القطب النمو خالية من العلامات14،15. هذه الملاحظات تشير إلى أن هذه البكتيريا يحمل توزيعات دهن غير متجانسة بسبب الوجود الدهون المجالات التي تسهم في عدم التناظر الخلوية. التغيرات في أنماط 4-64 وضع العلامات مثل وجود وسم منتشر، بليبس أو حويصلات أو إينفاجينيشنز أو انكماش الغشاء يمكن أن تكون مفيدة في وصف طفرات التي تؤثر على توزيع أو تخليق الحيوي من الدهون.

وراء تلطيخ الخلايا، من الضروري تحديد وظيفة البروتينات المشاركة في العمليات الأساسية. توصيف البروتينات الأساسية صعبة من الناحية الفنية لأنه ليس من الممكن حذف الجينات الأساسية ودراسة آثار المظهرية. وهكذا ظهرت النهج البديلة المستنفدة للبروتين. على سبيل المثال، يمكن وضع جينات أساسية الخاضعة لسيطرة مروج إيندوسيبلي بدلاً من المروج الأصلي لها. إيندوسيبلي المروجين استجابة لجزيئات صغيرة مثل؛ الزنك16، الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج)17،18،19،،من2021، أرابينوز22،23من فانيلاتي17،، و xylose23، وبالتالي يتوقف نسخ الجينات المستهدفة ونفاد بروتين الفائدة عند إزالة محفز. وتشمل النهج البديلة المستنفدة للبروتينات الأساسية التي تهم ريبوسويتشيس الاصطناعية24 التي تستخدم تفاعلات الجزيئات الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي لعرقلة نسخ جينات المستهدفة، كريسبر تدخل25،26 لمنع النسخ من الجينات المستهدفة، والبروتين إيندوسيبلي تدهور27،28 التي تستخدم علامات الببتيد للبروتينات المستهدفة للتدهور بحوزتي كلبكسب. توفير سلالات استنفاد سوى وقت قصير لتوصيف قبل الخلايا تفقد السلامة، ولذلك، التصوير المجهري للخلايا على مر الزمن من خلال استنزاف البروتين نهج قوية لتوصيف. في الواقع، والفحص المجهري للخلايا البكتيرية الحية مكن الباحثين اكتساب نظرة ثاقبة العمليات البيولوجية الأساسية، بما في ذلك الآليات للمحافظة على شكل الخلية وإفراز تجزئة29.

A. tumefaciens هو مسببات الأمراض النباتية البكتيرية30 و31،الهندسة الوراثية الطبيعية32. وهكذا، الآليات ذات الصلة بالقدرة الإمراضية، بما في ذلك المضيف الممرض التفاعلات33،،من3435وإفراز36المضيف تحويل30،31، 37 قد تم التحقيق على نطاق واسع. لتصميم استراتيجيات لمنع المرض A. tumefaciens بوساطة أو تعزيز التحول النبات، العمليات الأساسية لبقاء A. tumefaciens بحاجة إلى فهم أفضل. استخدام الأصباغ محددة الهدف وتطوير استراتيجية استنزاف البروتين A. tumefaciens18 الأخيرة توفر وسيلة للتحقيق في العمليات الأساسية.

هنا، يتم توفير بروتوكولات مفصلة للتحليل المجهري سلالات نضوب wildtype والمسخ والبروتين من توميفاسينس أ . البروتوكولين الأول والثاني وصف كيفية إعداد الخلايا وتسميتها بالأصباغ محددة الهدف. ويوفر البروتوكول الثالث توجيهات خطوة بخطوة لإعداد منصات [اغروس] (الشكل 1)، وتصوير الخلايا البكتيرية (الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4). قد تكون هذه البروتوكولات أيضا مناسبة للبكتيريا الأخرى مع إجراء تعديلات إضافية لمراعاة ظروف وسائل الإعلام المختلفة ومعدلات النمو ومتطلبات الأكسجين والهياكل الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-نمو سلالات A. tumefaciens

  1. استزراع سلالات A. tumefaciens
    1. استخدام تلميح عصا أو بيبيت خشبية عقيمة لتطعيم 1 مل وسائط النمو أتجن (انظر قائمة المواد للوصفة) مع مستعمرة واحدة من السلالة المرغوبة.
      ملاحظة: لسلالات استنفاد A. tumefaciens ، أتجن ينبغي أن تتضمن 1 مم إيبتج كمحفز الحفاظ على التركيب الحيوي للبروتين الضروري.
    2. زراعة سلالات A. tumefaciens بين عشية وضحاها في أتجن عند 28 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة.
    3. قياس الكثافة الضوئية للخلايا في 600 نانومتر (OD600) باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تمييع ثقافة الخلية إلى OD600 = ~0.2 وتستمر في النمو حتى OD600 = ~0.6 هو الذي تم التوصل إليه. لسلالات الاستنفاد، وتواصل نموها مع محفز حتى OD600 = ~0.6 هو الذي تم التوصل إليه.
    4. استخدام سلالات A. tumefaciens wildtype والمسخ OD600 = ~0.6 لتلطيخ محددة الهدف و/أو الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (انظر القسمين 2 و 3-1). لسلالات نضوب، تغسل محفز (انظر الفرع 1-2).
  2. إزالة محفز لتوصيف سلالات نضوب البروتين A. tumefaciens
    1. بيليه 1 مل ثقافة أسي (OD600 = ~0.4-0.6) باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في سطح مكتب للطرد مركزي في درجة حرارة الغرفة.
    2. ليغسل، إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في وسائط جديدة دون محفز وبيليه الخلايا كما هو موضح أعلاه (1.2.1). تغسل الخلايا إجمالي 3 مرات في وسائط الإعلام الجديدة.
    3. ريسوسبيند بيليه النهائي في وسائط جديدة وتركيز الخلايا ل التطوير التنظيمي600 = ~0.8 لتلطيخ الفوري مع صبغات محددة الهدف (القسم 2 و الشكل 4B-د) أو الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (القسم 3.2 و الشكل 4A) . بدلاً من ذلك، قبل استنزاف الخلايا لمقدار الوقت المطلوب بزراعة الخلايا في وسائل الإعلام دون محفز قبل التلوين والتصوير من الخلايا.

2-خاصة بهدف "تلطيخ" الخلايا A. tumefaciens

  1. وصف جدار الخلية الأحماض الأمينية د الفلورسنت
    ملاحظة: فداس هي غير سامة الأحماض الأمينية د الفلورسنت التي هي إدماج بسهولة في بيبتيدوجليكان توميفاسينس (أ) . يسبر هذا الإجراء وضع العلامات بسيطة النمو الزخرفة في الخلايا الحية6. بروتوكولات لتوليف فداس الأربعة هي المتاحة38.
    1. بيليه 500 ميليلتر للثقافة الأسية (OD600 = ~0.4-0.6) باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في الطرد سطح مكتب. ريسوسبيند بيليه الخلية في 100 ميليلتر من وسائط جديدة.
    2. إضافة 5 ميليلتر من 5 مم فدا لغسلها وتتركز الخلايا واحتضان لمدة 2 دقيقة في الظلام.
      ملاحظة: قصر فدا التعرض للضوء. وقت حضانة ستختلف تبعاً لمعدل النمو للسلالة. عادة، ينبغي أن تكون أوقات الاحتضان 5-10% من الوقت مضاعفة6.
    3. بيليه الخلايا بالطرد المركزي وتغسل الكريات الخلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثلاث مرات.
    4. ريسوسبيند بيليه في ~ 50 ميليلتر PBS.
      ملاحظة: قد تختلف استناداً إلى حجم بيليه حجم برنامج تلفزيوني المستخدمة لاستثارة.
    5. تطبيق 0.8-1 ميليلتر خلايا إلى لوح [اغروس] والصورة باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي فورا (انظر الفرعين 3.1 و 3.2).
      1. وبدلاً من ذلك، وقف المزيد من إدراج التسمية عن طريق تحديد الخلايا مع المثلج 70% إيثانول. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من المثلج 70% إيثانول واحتضان في الثلج لمدة 15 دقيقة.
      2. جمع الخلايا بالطرد المركزي وريسوسبيند في كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني للتصوير في وقت لاحق. تخزين تعليق خلية في 4 درجات مئوية والصورة في غضون 48 ساعة.
  2. الحمض النووي تلطيخ مع DAPI أو وصمة عار البرتقالي
    ملاحظة: لمراقبة الحمض النووي بنية، تتم تسمية الخلايا مع DAPI أو البرتقالي (خلية ميتة وصمة عار). على الرغم من أن الكلاسيكي توصف بأنها "وصمة عار الميت-خلية"، البرتقالي بيرمينت، فوتوستابل، ولا تؤثر على نمو الخلايا البكتيرية، تمكين خلية يعيش الحمض النووي التصوير10. في توميفاسينس أ، يعمل التوسيم البرتقال جيدا في الخلايا الحية وهي مناسبة للوقت الفاصل بين الفحص المجهري (الشكل 3). وفي المقابل، الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) التعرض للضوء اللازمة للتصوير الملون DAPI الخلايا سمي ضيائي (الشكل 3) وهكذا DAPI تلطيخ الأنسب لتلطيخ الخلايا الحية للتصوير الفوري أو تلطيخ الخلايا الثابتة.
    1. DAPI تلطيخ الخلايا
      1. بيليه 1 مل ثقافة أسي (OD600 = ~0.4-0.6) باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في الطرد سطح مكتب.
      2. بشكل اختياري، لإصلاح الخلايا قبل التلوين، ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل إيثانول المثلج 70%. تبني على الجليد لجمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي كما هو موضح في 2.2.1.1 كحد أدنى 10-15.
      3. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميليلتر من حل DAPI الأسهم (1 ملغ/مل؛ انظر الجدول المواد). المزيج بلطف بيبيتينج واحتضان لمدة 5 دقائق في الظلام.
      4. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الزائدة DAPI. تغسل الخلايا مرتين أخريين وريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني 50 ميليلتر أو وسائل الإعلام.
      5. تطبيق 0.8-1 ميليلتر خلايا إلى لوح [اغروس] والصورة باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي فورا. راجع المقاطع 3.1 و 3.2.
        ملاحظة: هذا البروتوكول ليس الأمثل للوقت الفاصل بين الفحص المجهري لمراقبة ديناميات كروموسوم (الشكل 3). النظر في استخدام تلطيخ البرتقال كبديل (انظر الفرع 2.2.2).
    2. تلوين البرتقالي للخلايا الحية
    3. بيليه 1 مل ثقافة أسي (OD600 = ~0.4-0.6) باستخدام الطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في الطرد سطح مكتب. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميليلتر من حل الأسهم البرتقالي (انظر قائمة المواد). المزيج بلطف بيبيتينج واحتضان لمدة 5 دقائق في الظلام.
    4. بيليه الخلايا بالطرد المركزي وريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة اللون البرتقالي الزائدة. تغسل الخلايا مرتين أخريين وريسوسبيند بيليه في 50 ميليلتر PBS.
    5. تطبيق 0.8-1 ميليلتر خلايا إلى لوح [اغروس] والصورة باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي فورا. راجع المقاطع 3.1 و 3.2.
      ملاحظة: هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد مع الخلايا الحية، وهو مناسبة للوقت الفاصل بين الفحص المجهري لمراقبة ديناميات كروموسوم (الشكل 3). إذا لم يكن ملائماً صورة مباشرة، يمكن إصلاح الخلايا في المثلج 70% إيثانول (انظر الفرع 2.2.1.2).
  3. وصف الغشاء
    ملاحظة: صبغة الفلورسنت ستيريل محبتين 4-64 وقد استخدمت على نطاق واسع لمراقبة غشاء الخلايا البكتيرية. خلافا للعديد من البكتيريا، 4-64 المسماة الخلايا توميفاسينس (أ) عدم تسمية موحدة، ولكن بدلاً من ذلك في كثير من الأحيان يحمل14،نمط "حدوة"15. اللافت للنظر القطب النمو تقريبا خاليا من وصمة عار حين مكثف يسمى القطب القديم. وهكذا تمكن 4-64 التصور خلية أنماط النمو وهيكل غشاء في توميفاسينس أ.
    1. أضف FM 4-64 إلى تركيز نهائي 8 ميكروغرام/مل في 1 مل من المرحلة الأسية خلية ثقافة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام.
    2. بيليه الخلايا المسماة بالطرد المركزي في 7,000 س ز لمدة 5 دقائق في سطح مكتب للطرد مركزي وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني. تغسل الخلايا ما مجموعة ثلاث مرات لإزالة الصبغة الزائدة.
    3. ريسوسبيند الخلايا في كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني وعلى الفور جهاز pad [اغروس] صورة مباشرة. (انظر الفرعين 3.1 و 3.2)
      تنبيه: الخلايا يجب تصويرها فورا مراقبة أنماط وضع العلامات المميزة.

3-تصوير الخلايا A. tumefaciens

  1. إعداد لوحة [اغروس]
    ملاحظة: يشتمل على الشكل 1 تسلسل الصور (لوحة أ) والتخطيطي (فريق ب) من منصة نموذجية [اغروس] أعدت للوقت الفاصل بين الفحص المجهري. وتعد منصات [اغروس] عادة حسب الحاجة.
    1. 3.1.1. استخدم ساترة كدليل وقص الفيلم 22 مم × 22 مم مربع مختبر (انظر قائمة المواد) عن طريق تشغيل مشرط حول الحواف.
    2. قطع مربع من وسط الفيلم المختبر ترك ~ 2-5 ملم في الحدود بمثابة طوقا اللوحة [اغروس]. تجاهل في الفصل مركز.
    3. وضع طوقا الفيلم إلى شريحة زجاج (75 مم × 25 مم) تنظيف مع الأمونيا ومنظف خال من الكحول (انظر قائمة المواد) وحرارة حتى ذاب الفيلم قليلاً على الزجاج (الصورة العلوية في الشكل 1A). تذوب الفيلم المختبر، استخدم حافة مجموعة كتلة الحرارة إلى 70 درجة مئوية أو تذوب خفيفا على لهب.
    4. إعداد الحل [اغروس] عن طريق خلط ~0.075 ز [اغروس] (انظر قائمة المواد) في 5 مل من وسائل الإعلام في قارورة صغيرة. الحرارة الحل في فرن ميكروويف مع دوامات الدوري للمزيج حتى يذوب في [اغروس] والحل واضح. يبقى الحل [اغروس] في 55-70 درجة مئوية، وتستخدم لبناء منصات [اغروس] متعددة في غضون 48 ساعة.
    5. ماصة الوسائط التي تحتوي على 1.2-1.5% [اغروس] إلى مركز طوقا.
      ملاحظة: حجم وسائل الإعلام هو عادة 50-60 ميليلتر ولكن سوف تختلف باختلاف حجم طوقا. إضافة الوسائط إلى شريحة باردة يمكن أن يسبب [اغروس] يصلب بسرعة كبيرة جداً، وبالتالي الشريحة يجب أن تبقى على سطح دافئة. تعيين حافة كتلة الحرارة إلى 70 درجة مئوية يعمل جيدا. ويمكن استخدام المياه [اغروس] أو حلول مخزنة بشكل مؤقت [اغروس] مثل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بدلاً من الوسائط التي تحتوي على [اغروس] لتطبيقات فيها نمو الخلايا استمرار غير مطلوب. يمكن للتصوير سلالات نضوب، محفز موجودة أو غائبة في وسائل الإعلام. وجود محفز يمكن استخدامها كعنصر تحكم بينما سوف تكشف عن عدم وجود محفز النمط الظاهري نضوب.
    6. ضع ساترة من فوق طوقا توزيعها بالتساوي [اغروس].
    7. ضع الشريحة على سطح بارد، والمستوى ترسيخ لدقيقة ~ 2 تجنب overdrying لوحة المفاتيح [اغروس] كهذا سيؤدي إلى سطح التجاعيد على لوحة المفاتيح [اغروس] وتجميع تعليق خلية عند تطبيقه على السطح.
    8. الشريحة بعناية ساترة قبالة لوحة المفاتيح [اغروس].
      تنبيه: لا تتعجل هذه الخطوة. يمكن بسهولة المسيل للدموع لوح [اغروس] وجهاز pad متفاوتة [اغروس] يمكن أن يجعل التصوير صعباً.
    9. تسمح لوحة المفاتيح [اغروس] إلى الهواء الجاف لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر سطح لوحة جافة. استخدام مشرط، إزالة شريط صغير من [اغروس] لخلق جيب هوائي (وسط الصورة، الشكل 1A)؛ جيب الجوي عادة ~ 2 مم × 7-10 مم والخلايا توميفاسينس (أ) تميل إلى أن تنمو أفضل قرب جيب الجوي (الشكل 1).
      ملاحظة: لتصوير الخلايا الثابتة أو بموجب الشروط التي لا يتم فيها رصد النمو، جيب هوائي غير ضروري.
    10. بقعة 0.8-1 ميليلتر خلايا على لوح [اغروس] وغطاء مع ساترة جديدة. مكان ساترة بلطف عبر الجزء العلوي من لوحة المفاتيح [اغروس] لتوزيع الخلايا عبر سطح اللوحة [اغروس].
    11. ختم حواف ساترة استخدام فالاب المذابة (انظر الجدول المواد لوصفه؛ الشكل 1A، أسفل الصورة). يمكن أن يؤدي الفشل في ختم على طول جميع حواف وزوايا ساترة تجفيف لوحة المفاتيح [اغروس]، مما يؤدي إلى الانجراف الخلايا أثناء التصوير. ملاحظة: وضع ختم ساترة فقط مطلوب لتصوير مرور الزمن الطويل الأجل.

Figure 1
رقم 1: إعداد لوحة [اغروس]- (أ) صورة تسلسل بروتوكول إعداد لوحة [اغروس]. الصورة 1 من شريحة مع طوقا الفيلم المختبر. في الصورة 2، وهي تصور لوح [اغروس] وجيب الجوي. وأخيراً، تظهر لوحة المفاتيح الكاملة [اغروس] مع الخلايا تحت كوفيرجلاس الصورة 3 ومختومة فالاب. (ب) التخطيطي لجهاز pad [اغروس] للفحص المجهري الوقت الفاصل بين يتم توفيرها. الملامح الرئيسية للوحة المفاتيح [اغروس] وصفت في التخطيطي. (ج) جيب الجوي تعزز نمو A. tumefaciens على منصات [اغروس]. تظهر الصور wildtype A. tumefaciens الخلايا المزروعة على منصة [اغروس] لمدة 20 ساعة. تم أخذ صور في مواقع بعيدة متزايدة من جيب الجوي. يتم إظهار المسافة من حافة الصورة الأقرب إلى جيب الجوي فوق كل صورة. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. تصوير
    ملاحظة: تدخل فرق التباين والتباين المرحلة وتصوير ابيفلوريسسينسي تتم مع مجهر مقلوب مجهزة autofocusing المستندة إلى الأجهزة، مرحلة الآلي، الفلاتر القياسية، مصدر ضوء LED، وغمر النفط X 60 الأهداف (1.4 نا) لمرحلة التباين أو التدخل التفاضلية التباين (DIC)، وكاميرا تهمة-يقترن-جهاز (امككد) ضرب إلكترون ك 1. وينبغي أن توضع المجهر في غرفة التحكم في درجة حرارة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدامها على المرحلة الأكثر دفئا أو الدائرة للحفاظ على درجات الحرارة متسقة أثناء التصوير.
    1. ابيفلوريسسينسي المجهري
      ملاحظة: لتصوير صف من الخلايا الحية، من الضروري للحد من عدد الحيازات الصورة وتحسين وقت التعرض للتقليل من فوتوبليتشينج والضيائيه. للتصوير من كل صبغة، من المستحسن للبحث عن وقت تعرض أمثل الذي يوفر الكشف عن الأسفار كافية ولكن لا يؤدي إلى فوتوبليتشينج أو الضيائية. وفي الأرقام 2-4، استخدمت أوقات التعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 200 لجميع الأسفار الصور. لتسلسل الزمن الفاصل هو موضح في الشكل 3، الصور تم الحصول عليها كل 10 دقيقة ح 3.
      1. ضع زيت الغمر على الهدف المنشود ومكان الشريحة مقلوب في حامل الشريحة على المسرح. استخدام المقابض التركيز لإحضار الخلايا إلى التركيز.
      2. الحصول على الصور في مرحلة (أو DIC) وعامل التصفية المطلوب الأسفار.
        ملاحظة: أطوال موجية الإثارة والانبعاثات القصوى للبقع المستخدمة في الشكل 2و الشكل 3و رقم 4 كما يلي: هادا (405/460)، وندي (450/555)، والأنشطة الإرهابية والتخريبية (555/570)، 4-64 (515/640)، DAPI (360/460)، والبرتقال (547/570).
    2. الوقت الفاصل بين الفحص المجهري
      ملاحظة: أثناء الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الميزات التالية هي الكمبيوتر التي تسيطر عليها: x و y و z الموقف، الستائر، والأسفار المرشحات. نظام تركيز تلقائي المستندة إلى الأجهزة الأمثل للحفاظ على التركيز خلال الوقت الفاصل بين التصوير. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام حلقة التركيز التلقائي المستندة إلى البرامج.
      1. ضع زيت الغمر على الهدف المنشود ومكان الشريحة مقلوب في حامل الشريحة على المسرح. استخدام المقابض التركيز لإحضار الخلايا إلى التركيز.
      2. بشكل اختياري: اكتساب متعددة (x, y) مناصب. حدد عشوائياً 10 حقول من الخلايا بالقرب من جيب الجوي منصات [اغروس].
      3. إعداد وقت اكتساب تسلسل للصورة في المرحلة أو DIC في الفاصل الزمني المطلوب.
        ملاحظة: للتسلسل الزمني الفاصل هو مبين في الشكل 4، تم اقتناء الصور DIC مع التعرض 30 مللي ثانية كل 10 دقيقة ح 14. عند استخدام التصوير الأسفار خلال الوقت الفاصل بين الفحص المجهري، ضبط الوقت الفاصل الزمني والتعرض لاقتناء للتقليل من فوتوبليتشينج والضيائيه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وسم من wildtype محددة الهدف A. tumefaciens الخلايا
بغية توضيح ذلك مورفولوجيا الخلايا لا تتأثر خطوات الغسيل أو المعاملة مع [دمس] 1% (والذي يستخدم لتخفيف الأصباغ الفلورية)، تم تصويرها الخلايا مباشرة من الثقافة (الشكل 2A، الفريق أقصى اليسار)، بعد غسل الخلايا التي الطرد المركزي كما هو موضح في 1.2 (الشكل 2A، ترك الفريق)، أو بعد حضانة الخلايا مع [دمس] 1% لمدة 10 دقائق وغسل الخلايا (الشكل 2A، اللوحة اليمنى). وتوضح هذه الصور أن مورفولوجيا لا تتأثر بالغسيل أو الوجود [دمس]. وباﻹضافة إلى ذلك، نمو الخلايا لا تتأثر بالغسيل أو [دمس] العلاج استناداً إلى تحليل منحنى النمو (البيانات لا تظهر). وبالإضافة إلى ذلك، تحديد A. tumefaciens مع الإيثانول المثلج لا تسبب التغيرات الإجمالية في مورفولوجيا (الشكل 2A، الفريق اليمين المتطرف).

وبعد ذلك، استخدمت صبغات محددة الهدف لمراقبة نشوء حيوي جدار الخلية والغشاء المجالات والحمض النووي داخل الخلايا A. tumefaciens wildtype. ولوحظت أنماط جديدة peptidoglycan الإدراج بعد وضع العلامات مع الأحماض الأمينية فلوري د ثلاثة: الهدا (الشكل 2B، غادر الفريق) وندي (الشكل 2B، مركز لوحة)، والأنشطة الإرهابية والتخريبية (الشكل 2، اللوحة اليمنى). في كل ثلاث تجارب التوسيم، اثريت وسم peptidoglycan جديدة في القطب النمو أو حاجز من الخلايا. ولوحظت أنماط النمو هذه دائماً مع جميع فداس الثلاثة، مشيراً إلى أنه يمكن تعديل التحديد فدا لتمكين العلامات المزدوجة مع غيرها من البقع أو خلايا معربا عن البروتينات المسماة فلوريسسينتلي. تفضيلي تسميات صبغ محبتين 4-64 منطقة القطب القديم A. tumefaciens الخلايا الناتجة في نمط حدوة مميزة (الشكل 2). أورانج (الشكل 2D، ترك الفريق) و DAPI (الشكل 2D، اللوحة اليمنى) تسمية الحمض النووي داخل العيش A. tumefaciens الخلايا. في الخلايا بريديفيسيونال الراحل، لوحظت اثنين نوكليويدس متميزة مع تلطيخ البرتقالي، بينما وسم الحمض النووي يبدو أكثر انتشارا مع DAPI تلطيخ (الشكل 2D) متسقة مع نتائج التجارب لاحظت في كولاي10.

مدى ملاءمة الأصباغ الحمض النووي للوقت الفاصل بين الفحص المجهري
من أجل تحديد ما إذا كانت DAPI أو البرتقالي مناسب لتصوير الوقت الفاصل بين مورفولوجيا نوكليويد أثناء نمو الخلايا، نسبة متساوية غير مسمى، والمسمى DAPI، وخلايا A. tumefaciens wildtype البرتقالي المسمى كانت مختلطة ورصدت على [اغروس] منصات. في الساعة 0، أخذت الصور الأولية باستخدام التباين المرحلة و DAPI تريتك عوامل التصفية لتحديد إذا كان المسمى كل خلية. ثم تم تصويرها الخلائط الخلية تحت ظروف مختلفة ثلاث: (1) الطوري فقط، (2) مرحلة مجهرية ابيفلوريسسينسي وعلى النقيض من استخدام تريتك (3) مرحلة التصفية وابيفلوريسسينسي وعلى النقيض من الفحص المجهري باستخدام عامل التصفية DAPI. الصور تم الحصول عليها كل 10 دقائق لمدة 3 ساعات. كافة الخلايا نمت جيدا بغض النظر عن وصمة عار الفلورسنت المستخدمة عند تصويرها مع المرحلة مجهرية على النقيض مما يشير إلى أن تلطيخ اللون البرتقالي أو DAPI لا تعوق نمو الخلايا (الشكل 3، أعلى اللوحة). كما ارتفعت كافة الخلايا جيدا عند تصويرها بمرحلة الفحص المجهري والفحص المجهري ابيفلوريسسينسي باستخدام عامل التصفية تريتك (الشكل 3، لوحة مركز). التسمية البرتقال يخضع فوتوبليتشينج ولكن يمكن ملاحظتها على الأقل 2 ح (التعرض الإجمالي 13 200 مللي ثانية)، مما يشير إلى مدى ملاءمة هذه الصبغة للمدى القصير الفحص المجهري للخلايا الحية. بغض النظر عن التسمية، تتوقف كافة الخلايا عن النمو في غضون ساعة عند تصويرها بمرحلة الفحص المجهري والفحص المجهري ابيفلوريسسينسي باستخدام عامل التصفية DAPI (الشكل 3، اللوحة السفلية). وهذه الملاحظة يوضح أن A. tumefaciens حساس للتعرض للأشعة فوق البنفسجية، ويشير إلى أنه ينبغي تجنب الأصباغ التي تتطلب عامل تصفية الأشعة فوق البنفسجية لتصوير للتجارب الوقت الفاصل بين الفحص المجهري.

الوقت الفاصل بين التصوير ووضع العلامات الخاصة بالهدف من A. tumefaciens سلالة استنفاد
كل تشبع ينقول الطفرات39 والفشل في بناء18،40 سلالة حذف تشير إلى أن البروتين المنظم الرئيسي، كترا، عنصرا أساسيا في توميفاسينس أ. لإظهار قيمة التحليل المجهري لسلالات نضوب، تعرضت وصفه سابقا كترا استنفاد سلالة18 لتوصيف بالفحص المجهري. في الشكل 4A، استخدمت الوقت الفاصل بين الفحص المجهري لمقارنة نمو كترا استنفاد الخلايا في التعبير التي كترا كان بفعل (أعلى) وأونيندوسيد (أسفل). حضور كترا، أثارت خلية واحدة ميكروكولوني ضمن ح 14. وفي المقابل، عندما تم استنفاد كترا، خلايا تفكيك أو فشل لتقسيم. الخلايا التي فشلت لتقسيم أظهرت التغيرات المورفولوجية الإجمالية بما في ذلك التقريب من منتصف الخلية وفي أقطاب الخلية. هذه الملاحظات تشير إلى أن كترا له وظيفة هامة في تنظيم انقسام الخلايا.

في الشكل 4 باء-دال، استخدمت الأصباغ الفلورية لتوصيف سلالة نضوب كترا بعد الاستقراء أو نضوب كترا 10 h. خلايا النبض المسمى بندي لمدة 2 دقيقة (الشكل 4 باء). عندما حضر كترا (اللوحة العلوية)، لوحظ الحيوي peptidoglycan القطبية. وفي المقابل، وسمها ندى واسعة حدثت في القطبين وتورمات منتصف الخلية كبيرة وقعت عندما كانت تستنفد كترا. وهذه الملاحظة يتسق مع توليف peptidoglycan المستمر على الرغم من عدم تقسيم الخلايا. واستخدمت صبغ الحمض النووي سينين البرتقالي لتميز توزيع الحمض النووي في سلالة نضوب كترا (الشكل 4). عندما حضر كترا، زراعة الخلايا كان توزيعاً حتى من الحمض النووي، والفصل بين نوكليويدس كان واضحا في خلية بريديفيسيونال متأخرة؛ وفي المقابل، عندما تم استنفاد كترا، الحمض النووي غير موزع بالتساوي في جميع أنحاء الخلايا. هذه الملاحظات تشير إلى أن يسهم كترا المناسب تكرار الحمض النووي أو العزل. وأخيراً، كانت المسمى كترا استنفاد الخلايا مع 4-64 (الشكل 4). حضور كترا، وصفت غشاء الخلية مع نمط حدوة مميزة التي كان القطب النمو خالية من وصمة عار. في الخلايا التي نفدت من كترا، يبدو 4-64 تسمية الغشاء كامل، على الرغم من أن كان أكثر كثافة ملطخة قطب واحد. وهذه الملاحظة تشير إلى أن الأغشية تظل سليمة على الرغم من أن المنظمة ميكرودومين الدهن قد تتعطل عندما يتم استنفاد كترا.

Figure 2
الشكل 2: صور الممثل wildtype tumefaciens المتبعة الخلايا المسماة بالأصباغ محددة الهدف- المرحلة (أ) التباين الصور A. tumefaciens الخلايا قبل وبعد البروتوكول الغسيل، عندما تعامل مع [دمس] 1%، أو بعد التثبيت مع الإيثانول المثلج. (ب) ويرد القطبية نمو الخلايا A. tumefaciens بوصفها مع الأحماض الأمينية د الفلورسنت الهدا وندي والأنشطة الإرهابية والتخريبية. (ج) Staining من A. tumefaciens بوصمة عار محبتين 4-64. (د) Staining خلايا A. tumefaciens بالأصباغ الخاصة بالحمض النووي والبرتقالي DAPI. وترد لألواح د ب، مرحلة التباين (أعلى) والصور ابيفلوريسسينسي (أسفل). يحدد الخلية ترد في الصور الفلورية للرجوع إليها. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مقارنة بين DAPI والبرتقال وسم الحمض النووي في العيش A. tumefaciens الخلايا. نسب متساوية من الخلايا A. tumefaciens wildtype غير مسمى، والمسمى DAPI، والمسمى البرتقالي كانت مختلطة ورصدت على منصات [اغروس]. في الساعة 0، أخذت الصور الأولية باستخدام التباين المرحلة وتريتك DAPI عوامل التصفية لتحديد إذا كانت تسمية الخلايا. (أ) الوقت الفاصل بين الخلايا غير مسمى، والمسمى DAPI، والمسمى أورانج تصويرها الطوري. (ب) الوقت الفاصل بين الخلايا غير مسمى، والمسمى DAPI، والمسمى أورانج تصويرها بمرحلة الفحص المجهري والفحص المجهري ابيفلوريسسينسي باستخدام عامل التصفية تريتك. (ج) الوقت الفاصل بين الخلايا غير مسمى، والمسمى DAPI، والمسمى أورانج تصويرها بمرحلة الفحص المجهري والفحص المجهري ابيفلوريسسينسي باستخدام عامل التصفية DAPI. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: صور الممثل من سلالة نضوب كترا في ظروف المستحث وأونيندوسيد- مجهرية الوقت الفاصل بين (A) من سلالة نضوب كترا في ظل الظروف التي كان فيها كترا المستحث (أعلى) أو المنضب (أسفل). الأرقام أعلاه كل لوحة تشير إلى الوقت بالساعات. (ب) المرحلة التباين (يسار) والصور (يمين) ابيفلوريسسينسي الخلايا المسماة بندي. (ج) المرحلة التباين (يسار) والصور الفلورية (يمين) من الخلايا المسماة باللون البرتقالي. (د) المرحلة التباين (يسار) والصور (يمين) الأسفار من الخلايا المسماة مع 4-64. وقدمت الخلية الخطوط العريضة في الصور الفلورية للرجوع إليها. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يحتوي هذا البروتوكول على سلسلة من الإجراءات لتحقيق سلالات A. tumefaciens wildtype والمسخ، ونضوب. تجدر الإشارة إلى أن جميع الإجراءات المدرجة في قسم البروتوكول يمكن أن يسهل تكييفها للسلالات البكتيرية الأخرى مع تعديلات إضافية لمراعاة وسائط النمو ودرجات الحرارة، ومعدلات النمو.

استخدام الأصباغ محددة الهدف أداة قيمة لتقديم وصف تفصيلي لإحداث دورة الخلية في الخلايا البكتيرية. هنا، ولوحظت أنماط peptidoglycan الإدراج باستخدام الأحماض الأمينية فلوري د وكانت تصور مجالات المادة الدهنية مع 4-64، وكان المسمى نوكليويدس مع DAPI أو البرتقالي. كل من البروتوكولات يمكن تكييفها للاستخدام في بكتيريا أخرى بعد الاستفادة المثلى من البروتوكول بالمياه والصرف الصحي وضمان أن المعاملة [دمس] لا يضعف النمو أو مورفولوجيا. وتشمل الاعتبارات الرئيسية اختيار مخزن مؤقت لخطوات الغسيل وأوقات الاحتضان لإدراج تسمية واختيار فلوروفوري المناسبة لتجنب السيارات-الأسفار أو تمكين متعدد دراسات وضع العلامات. على سبيل المثال، هو بديل لوصمة عار محبتين الأحمر نيون غشاء (4-64) وصمة عار غشاء أخضر نيون (1-43). وبالمثل، الأزرق والأخضر، والأحمر نيون-د-الأمينية الأحماض المتوفرة6،38 ويمكن مترافق الأحماض الأمينية د مع مقابض بيورثوجونال إلى فلوروفوريس مشترك من خلال نقرة الكيمياء6،7. أخيرا، بالإضافة إلى سينين البرتقالي الفلورسنت الحمض النووي صبغ، يعيش أخضر سينين نيون صبغ الحمض النووي هو متاح ويقوم بشكل جيد مع الخلايا البكتيرية10. يمكن الجمع بين التصور الهياكل الرئيسية الخلية المسماة بالأصباغ محددة الهدف مع ملاحظة البروتينات الفلورية اكتساب نظرة ثاقبة آليا إلى العمليات الأساسية في البكتيريا.

تتضمن هذه البروتوكولات الشروط اللازمة للمراقبة المجهرية للبقع استنفاد A. tumefaciens وأنه ينبغي أن يكون من الممكن تمديد هذه النهج لسلالات نضوب البروتين في البكتيريا الأخرى. ويمكن توصيف سلالات استنفاد يشكل تحديا كبيرا كما أن هناك فترة زمنية محدودة لإكمال التحقيقات قبل الخلايا تتوقف عن النمو أو ليس. من الأهمية بمكان لغسل على نحو كاف في الخلايا لإزالة جميع آثار الصبغة الزائدة خلال وضع العلامات؛ ومع ذلك، تحتوي بعض الخلايا المستنفد من البروتينات الأساسية العيوب في على أسطح الخلية الذي يمكن أن يسبب لها أن تكون حساسة لغسل الخطوات. زيادة حجم البداية الثقافات الخلية يمكن أن تساعد في التعويض عن فقدان الخلايا أثناء خطوات الغسيل. سلالات الاستنفاد الذي قد يثير الشبهة أغشية الخلية أو جدران الخلية قد تكون عرضه لخلية تفسخ عندما تزرع في ثقافة السائل دون محفز. إدراج أوسموبروتيكتانت (السكروز 5% تعمل بشكل جيد A. tumefaciens) تساعد على الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا وتحد من تحلل الخلية أثناء نضوب. من الضروري تحديد المقدار المناسب من الوقت قبل استنفاد الخلايا قبل صبغة بصبغة الفلورسنت تجريبيا. قد تكون الخلايا مع الأغشية بيرميبليزيد أو جدران الخلية عرضه لخلية تفسخ أو وضع العلامات غير انتقائية مع المواد الكاشفة الفلورسنت مما يجعل التصوير في وقت متأخر من نفاد الوقت النقاط الصعبة لا سيما.

وهو خطوة حاسمة للفحص المجهري الوقت الفاصل بين A. tumefaciens (أو غيرها من الخلايا البكتيرية) إعداد لوحة المفاتيح [اغروس]. اللوحة [اغروس] يجب أن يكون مستوى لضمان تركيز جيد طوال الوقت الفاصل بين الفحص المجهري التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن مختومة ساترة تماما لمنع لوحة المفاتيح [اغروس] من التجفيف وتغيير المستوى البؤري. A. tumefaciens، مطلوب الأكسجين لنمو الخلايا. التصوير بالقرب من جيب هوائي ضروري للحصول على نمو قوي من A. tumefaciens أثناء الفحص المجهري منذ فترة طويلة من الوقت الفاصل بين تجارب (الشكل 1). إذا فشل الخلايا النمو أو توقف النمو بعد ساعات قليلة فقط، من المستصوب إعداد جهاز pad [اغروس] مع أكبر جيب هواء وصورة قرب جيوب الهواء. حتى وسادة جيدة شيدت [اغروس] مع جيب الجوي سليم يمكن فقط دعم النمو A. tumefaciens ح ~ 24 كحد أقصى. إذا لم يعد الوقت الفاصل بين تسلسلات ضرورية، النهج البديلة مثل كما ينبغي النظر في الخلايا ميكروفلويديكس أو التدفق. إذا كانت الخلايا الانجراف من التركيز أثناء التصوير، تأكد من لوحة المفاتيح [اغروس] مختومة بشكل صحيح تحت ساترة ومستوى. لاحظ أن حتى مع [اغروس] الكمال قريب وسادة، فمن الممكن أن بعض الخلايا الانجراف من التركيز، وبالتالي التصوير حقول متعددة ومتكررة في إعادة تركيز ينصح. للبكتيريا الأخرى، يعتبر النهج البديلة لإعداد منصات [اغروس]41،،من4243 تلبي متطلبات النمو البكتيريا. [اغروس] منصات مفيدة أيضا لشل حركة الخلايا أثناء تصوير الخلايا المسماة أو ثابت عند مرور الزمن ليس ضروريا. وفي هذه الحالة، ختم ساترة ليس النهج اللازمة وبديلة لتشييد منصات [اغروس] الذي يمكن تخزينه حتى لاحقة قد تكون مناسبة43.

وعموما، يمكن أن توفر استخدام الأصباغ محددة الهدف والوقت الفاصل بين الفحص المجهري أفكاراً حول العمليات الأساسية في البكتيريا. هنا، نحن توضيح نمط حدوة المعتاد وضع العلامات مع صبغ محبتين 4-64 ومميزة القطبية والحاجز العلامات مع الأحماض الأمينية فلوري د في توميفاسينس أ. الملاحظات من هذه الأنماط في A. tumefaciens تتماشى مع نمو هذه البكتيريا44 القطبية، ومن المرجح أن دراسات مماثلة قد تكشف عن معلومات حول النمو الزخرفة في بكتيريا أخرى. الاستنتاج أن الأصباغ سينين مثل البرتقال مناسبة للفحص المجهري الوقت الفاصل بين دراسات10 (الشكل 3) سيمكن دراسات متأنية مورفولوجيا نوكليويد أثناء نمو الخلايا في سلالات wildtype والمسخ. التصوير الفلورسنت محددة الهدف الأصباغ خلال استنزاف البروتين الضروري يمكن تقديم الملاحظات الرئيسية لتحديد وظيفة البروتين. أخيرا، حيث تتوفر العديد من هذه الأصباغ مع الخصائص الطيفية المختلفة، ينبغي أن تمكن الدراسات استخدام تسميات متعددة في نفس الوقت رؤى في تنسيق العمليات الأساسية أثناء تقدم دورة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر مايكل فانيووينهزي (جامعة إنديانا) لهدية فداس المستخدمة في الشكل 2 و الشكل 4. ونشكر أعضاء المختبر براون للتغذية المرتدة أثناء إعداد هذه المخطوطة. البحث في مختبر براون على شعبة ونمو الخلايا A. tumefaciens معتمد من قبل "المؤسسة الوطنية للعلوم" (IOS1557806).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58 ATCC 33970 Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH Fisher BioReagents BP359
KH2PO4 Fisher Chemical P288
20X AT Salts Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4 Fisher Chemical A701
MgSO4•7H2O Fisher BioReagents BP213
CaCl2•2H2O Fisher BioReagents BP510
MnSO4•H2O Fisher Chemical M114
Glucose Fisher Chemical D16 Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar Fisher BioReagents BP1423 Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name Company Catalog Number Comments
Optional Media Additives
Kanamycin GoldBio K-120 Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG GoldBio I2481C5 Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides Fisherbrand 12-550D 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-541-B 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner Home Depot 203261385 Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose Invitrogen 16500-100 Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS Fisher BioReagents BP399500 10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm Bemis PM-999 Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter SAAQIN SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly Target Corp. 06-17644
Paraffin Wax Crafty Candles 263012
Name Company Catalog Number Comments
Target-specific dyes
DMSO Fisher BioReagents BP231-1 Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA) FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S11368 Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64 Invitrogen T3166 Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dry bath Sheldon Manufacturing, Inc. 52120-200
Metallic thermal beads Lab Armor 42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26 (2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496 (2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219 (2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137 (2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730 (2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488 (2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322 (2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519 (2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682 (2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363 (2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

Tags

علم الأحياء المجهرية، 129 قضية، المتبعة، أكفاء، الوقت الفاصل بين الفحص المجهري، منصات [اغروس]، الأحماض الأمينية د الفلورسنت، تلطيخ الحمض النووي، يلطخ الغشاء، مجهرية ابيفلوريسسينسي
يعيش خلية Fluorescence مجهرية لمراقبة العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا الميكروبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Howell, M., Daniel, J. J., Brown, P. … More

Howell, M., Daniel, J. J., Brown, P. J. B. Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth. J. Vis. Exp. (129), e56497, doi:10.3791/56497 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter