Summary
Svårt att förstå funktionen av viktiga processer i bakterier. Fluorescensmikroskopi med målet-specifika färgämnen kan ge viktiga insikter i mikrobiell cell tillväxt och cellcykeln progression. Här används Agrobacterium tumefaciens som en modell bakterie att lyfta fram metoder för levande cell avbildning för karaktärisering av väsentliga processer.
Abstract
Cellulära kärnprocesser såsom DNA-replikation och segregering, proteinsyntes, växtcellväggar och celldelning är beroende av funktionen av proteiner som är avgörande för bakteriell överlevnad. En rad mål-specifika färgämnen kan användas som sonder för att bättre förstå dessa processer. Färgning med lipofila färgämnen möjliggör observation av membranstruktur, visualisering av lipid microdomains, och upptäckt av membran blebs. Användning av lysrör-d-aminosyror (FDAAs) sond platserna för biosyntesen av peptidoglykan kan indikera potentiella defekter i cellväggen biogenes eller cell tillväxt mönster. Slutligen, nukleinsyra fläckar kan indikera eventuella defekter i DNA-replikering eller kromosom segregation. Cyanin DNA fläckar etikett levande celler och är lämpliga för time-lapse mikroskopi möjliggör realtid observationer av nucleoid morfologi under celltillväxt. Protokoll för cell märkning kan tillämpas på protein utarmning mutanter att identifiera defekter i membranstruktur, cellväggen biogenes eller kromosomsegregering. Time-lapse mikroskopi kan dessutom användas för att övervaka morfologiska förändringar som en viktig protein tas bort och kan ge ytterligare insikter om proteinfunktion. Till exempel resulterar utarmning av väsentliga celldelning proteiner i filamentation eller förgrening, medan utarmning av cell tillväxt proteiner kan orsaka celler att bli rundare eller kortare. Här finns protokoll för celltillväxt, target-specifik märkning och time-lapse mikroskopi för bakteriell växt patogen Agrobacterium tumefaciens. Tillsammans, target-specifika färgämnen och time-lapse mikroskopi aktivera karakterisering av viktiga processer i A. tumefaciens. Slutligen kan de protokoll som tillhandahålls lätt ändras sond väsentliga processer i andra bakterier.
Introduction
Progression genom bakteriell cellcykeln kräver samordning av många processer inklusive membran och cellväggen biosyntes, DNA-replikation och segregation och celldelning. För att fullt förstå komplexiteten av bakteriell cellbiologi, är det nödvändigt att studera dessa väsentliga händelser; dock är detta en icke-trivial uppgift eftersom cellernas viabilitet äventyras när viktiga komponenter i dessa vägar är mutagenized. Epifluorescence mikroskopi tillsammans med target-specifika färgämnen är en kraftfull metod att söka dessa viktiga processer i vildtyp och muterade bakteriestammar.
Peptidoglykan-specifika färgämnen inkluderar fluorescerande antibiotika (vancomycin-FL, bocillin-FL) och lysrör-d-aminosyror (till exempel 7-hydroxycoumarin-3-karboxylsyror syra-3-amino-d-alanin, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanin , NADA; tetrametylrodamin-3-amino-d-alanin; TADA). I grampositiva bakterier, har användandet av subletala koncentrationer av fluorescerande antibiotika analoger sond platser av peptidoglykan biosyntes varit en effektiv strategi att avslöja peptidoglykan införande mönster1,2, 3,4. Medan fluorescerande vankomycin märkning har använts för att få insikter i peptidoglykan införande mönster i fasta gramnegativa bakterier5, ger det yttre membranet i allmänhet en permeabilitet barriär som hindrar användning av fluorescerande antibiotika som en sond för peptidoglykan biosyntes i levande celler. Däremot etikett korta pulser av lysrör-d-aminosyror eller d-aminosyror med biorthogonal funktionella grupper kovalent regioner i senaste peptidoglykan införande i ett brett utbud av levande bakterieceller6,7. Mönster av peptidoglykan införande som har observerats med syntetisk d-aminosyror inkluderar punktuell och septal (Escherichia coli och Bacillus subtilis), polar och septal (Agrobacterium tumefaciens och Listeria monocytogenes), septal bara (Staphylococcus aureus), och apikala (Streptomyces venezuelae)6,7. Dessa observationer tyder på att bakterier uppvisar varierande mönster av cellväggen biogenes och att användningen av syntetiskt d-aminosyror som sonder för att pröva tillväxt mönster är en värdefull strategi i många bakterier.
Färgämnen som etikett bakteriell kromosomer inkluderar deoxiribonukleinsyra (DNA) specifika mindre groove bindemedlet (4,6-diamidin-2-fenylindol; DAPI) och hög affinitet cyanin färgämnen (grön och Orange; se material lista). DAPI färgning av fasta celler hjälper uppräkning av bakterier från miljöprover8, medan DAPI färgning av levande celler används för att indikera bakteriell livskraft9. Däremot färgämnen cyanin som Orange och grönt är ofta beskrivs som membran impermeant ”döda” cell fläckar att räkna upp icke-viabla celler9. Anmärkningsvärt, när reagenserna används sond av den bakteriella nucleoid morfologi under celltillväxt, DAPI, Orange och grön alla visade sig vara membran diffusionskoefficient och kapabla att märkning levande celler10. I levande E. coli celler, DAPI färgning av DNA visas diffusa på grund av auto-fluorescens från cytoplasman och upprepad exponering av DAPI-färgade celler för ultraviolett (UV) ljus perturbs nucleoid struktur10. Färgning E. coli eller B. subtilis med Orange avslöjar att detta färgämne är membran diffusionskoefficient och ger långvarig fluorescens vid bindning till DNA i levande celler utan att påverka celltillväxt, DNA-replikation eller kromosomsegregering10 . Dessa observationer tyder på att cyanin DNA färgämnen kan användas för att övervaka morfologi av nucleoids under celltillväxt i många bakterier.
Phospholipid-Specific stryl färgämnen såsom N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenyl) hexatrienyl) deoxypyri etylenedibromid (4-64; se material lista) är katjoniska föreningar och associera företrädesvis med negativt laddade fosfolipider såsom kardiolipin och phosphatidylglycerol11. Distinkta mönster observeras när 4-64 används för att märka membranet i olika bakterier. I Escherichia coli, 4-64 anrikas i polerna, i band längs laterala väggen, och i de division platserna sen pre-divisional celler12. I Bacillus subtilismöjliggör 4-64 märkning visualisering av lipid spiraler13. I Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiketter det yttre membranet och observeras i en karakteristisk ”hästskon” mönster där tillväxt masten saknar märkning14,15. Dessa observationer tyder på att dessa bakterier uppvisar heterogena lipid investeringsperiodens förekomsten av lipid domäner som bidrar till cellulära asymmetri. Förändringar i 4-64 märkning mönster som förekomsten av diffusa märkning, blebs eller blåsor, invaginations eller membran krympning kan vara informativ i kännetecknar mutanter som påverkar distribution eller biosyntesen av lipider.
Bortom färgning celler, är det nödvändigt att fastställa funktionen av proteiner deltar i viktiga processer. Karakterisering av viktiga proteiner är tekniskt utmanande eftersom det inte går att ta bort viktiga gener och studera de fenotypiska konsekvenserna. Således, alternativa metoder som bryter ned proteinet har dykt upp. Exempelvis kan en viktig gen sättas under kontroll av en inducerbara arrangören i stället för dess infödda tillskyndare. Inducerbara initiativtagare är lyhörda för små molekyler såsom; zink16, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinos22, vanillate17,23, och xylos23, därmed transkriptionen av målgenen upphör och proteinet av intresse är förbrukad när induceraren tas bort. Alternativa metoder för nedbrytande viktiga proteiner av intresse inkluderar syntetiska riboswitches24 som använder liten molekyl-RNA interaktioner hindrar transkription av målgener, CRISPR störningar25,26 till block transkription av målgener och inducerbara protein nedbrytning27,28 som använder peptid taggar till målprotein för nedbrytning av de ClpXP-proteashämmaren. Utarmning stammar ger endast en kort tid för karakterisering innan cellerna förlorar bärkraft, mikroskopbilder av celler med tiden under protein utarmning är därför en kraftfull metod för karakterisering. Mikroskopi av levande bakterieceller har faktiskt gjort det möjligt för forskare att få insikter i grundläggande biologiska processer, inklusive mekanismer för cell form underhåll, sekretion och uppdelning29.
A. tumefaciens är en bakteriell växt patogen30 och naturliga genetiska ingenjör31,32. Således, mekanismer relaterade till patogenicitet, inklusive värd-patogen interaktioner33,34,35, sekretion36och värd omvandling30,31, 37 har studerats i större omfattning. För att designa strategier som hindrar A. tumefaciens medierad sjukdom eller förbättra växt förvandling, måste processerna som är avgörande för A. tumefaciens överlevnad förstås bättre. Användningen av target-specifika färgämnen och den senaste utvecklingen av ett protein utarmning strategi för A. tumefaciens18 ger en möjlighet att undersöka väsentliga processer.
Här finns detaljerade protokoll för Mikroskopisk analys av vildtyp och mutant protein utarmning stammar av A. tumefaciens . De två första protokoll beskriva hur man förbereder celler och märka dem med målet-specifika färgämnen. Det tredje protokollet innehåller stegvisa anvisningar för att förbereda agaros pads (figur 1) och imaging bakteriecellerna (figur 2, figur 3, figur 4). Dessa protokoll kan också vara lämplig för andra bakterier med ytterligare anpassningar för olika medier villkor, tillväxttakt, krav på syrgasutrustning och cellstrukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillväxt av A. tumefaciens stammar
-
Odling A. tumefaciens stammar
- Använd en steril trä pinne eller Pipettera spets för att Inokulera 1 mL ATGN tillväxt medier (se lista över material för receptet) med en enda koloni av önskad stammen.
Obs: För A. tumefaciens utarmning stammar, ATGN bör innehålla 1 mM IPTG som en inducerare att upprätthålla biosyntes av proteinet viktigt. - Växa de A. tumefaciens stammarna övernattning i ATGN vid 28 ° C med skakningar vid 225 rpm.
- Mät den optiska densiteten av celler vid 600 nm (OD600) med en spektrofotometer. Späd cellkulturen till en OD600 = ~0.2 och fortsätter att växa tills OD600 = ~0.6 nås. För utarmning stammar, fortsätta att växa med inducerare tills OD600 = ~0.6 nås.
- Använda vildtyp och mutant stammar av A. tumefaciens på OD600 = ~0.6 för mål-specifik färgning eller time-lapse mikroskopi (se avsnitt 2 och 3.1). För utarmning stammar, tvätta ur induceraren (se avsnitt 1.2.)
- Använd en steril trä pinne eller Pipettera spets för att Inokulera 1 mL ATGN tillväxt medier (se lista över material för receptet) med en enda koloni av önskad stammen.
-
Borttagning av inducerare för karaktärisering av A. tumefaciens protein utarmning stammar
- Pellet 1 mL av exponentiell kultur (OD600 = ~0.4-0.6) genom centrifugering vid 7000 x g i 5 min i en stationär Centrifugera vid rumstemperatur.
- För att tvätta, ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i färska media utan inducerare och pellets cellerna som beskrivs ovan (1.2.1). Tvätta cellerna totalt 3 gånger i färska media.
- Återsuspendera slutliga pelleten i färska media och koncentrera sig celler till en OD600 = ~0.8 för omedelbar färgning med target specifika färgämnen (avsnitt 2 och figur 4B-D) eller time-lapse mikroskopi (avsnitt 3.2 och figur 4A) . Alternativt, pre bryter cellerna för önskad mängd tid genom att odla cellerna i media utan inducerare före färgning och avbildning av cellerna.
2. mål-specifik färgning av A. tumefaciens celler
-
Fluorescerande d-amino acid cellväggen märkning
Obs: FDAAs är ogiftig fluorescerande d-aminosyror som lätt inlemmas i den A. tumefaciens peptidoglykan. Proceduren för enkel märkning sonder tillväxt mönstring i levande celler6. Protokoll för syntes av fyra FDAAs är tillgängliga38.- Pellet 500 µL av exponentiell kultur (OD600 = ~0.4-0.6) genom centrifugering vid 7000 x g i 5 min i en stationär centrifug. Återsuspendera cellpelleten i 100 µL av färska media.
- Tillsätt 5 µL 5 mM FDAA att tvättas och koncentrerad celler och inkubera i 2 min i mörker.
Obs: Begränsa FDAA exponering för ljus. Tidpunkten för inkubation varierar beroende på ökningen av stammen. Vanligtvis bör inkubationstider vara 5-10% av den fördubbling tid6. - Pellet cellerna genom centrifugering och tvätta cell pellets med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tre gånger.
- Återsuspendera pelleten i ~ 50 µL PBS.
Obs: Volymen av PBS används för återsuspension kan variera beroende på pelleten storleken. - Tillämpa 0,8-1 µL av celler till en agaros pad och bilden med epifluorescence mikroskopi omedelbart (se avsnitt 3.1 och 3.2).
- Alternativt kan du stoppa ytterligare etikett införlivandet genom att fixera cellerna med iskall 70% etanol. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL iskallt 70% etanol och inkubera på is i 15 minuter.
- Samla celler genom centrifugering och återsuspendera i en liten volym av PBS för imaging vid ett senare tillfälle. Lagra cellsuspensioner vid 4 ° C och bild inom 48 timmar.
-
DNA färgning med DAPI eller Orange fläck
Obs: Att iaktta DNA struktur, celler är märkta med antingen DAPI eller Orange (döda cellen fläcken). Även om klassiskt beskrivs som en ”dead-cell fläcken”, Orange är diffusionskoefficient, fotostabilt, och påverkar inte tillväxten av bakterieceller, aktivera live-cell DNA imaging10. I A. tumefaciens, Orange märkning fungerar bra i levande celler och är lämplig för time-lapse mikroskopi (figur 3). Däremot den ultravioletta (UV) ljus exponeringen krävs för imaging DAPI-färgade celler är fototoxisk (figur 3) och därmed DAPI färgning är bäst lämpad för färgning levande celler för omedelbar imaging eller färgning fast celler.- DAPI färgning av celler
- Pellet 1 mL av exponentiell kultur (OD600 = ~0.4-0.6) genom centrifugering vid 7000 x g i 5 min i en stationär centrifug.
- Alternativt, för att fixa celler innan färgning, Återsuspendera cellpelleten i 1 mL 70% iskall etanol. Inkubera på is för 10-15 min. samla cellerna genom centrifugering som beskrivs i 2.2.1.1.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS med 1 µL av DAPI stamlösning (1 mg/mL; se Material tabell). Blanda försiktigt genom pipettering och inkubera i 5 minuter i mörkret.
- Pellet celler genom centrifugering vid 7000 x g i 5 min och resuspendera i 1 mL PBS ta bort överflödig DAPI. Tvätta cellerna två gånger och återsuspendera pelleten i 50 µL PBS eller media.
- Tillämpa 0,8-1 µL av celler till en agaros pad och bilden med epifluorescence mikroskopi omedelbart. Se avsnitt 3.1 och 3.2.
Obs: Detta protokoll inte är optimal för time-lapse mikroskopi att iaktta kromosom dynamics (figur 3). Överväg att använda Orange färgning som alternativ (se avsnitt 2.2.2).
- Orange färgning av levande celler
- Pellet 1 mL av exponentiell kultur (OD600 = ~0.4-0.6) genom centrifugering vid 7000 x g i 5 min i en stationär centrifug. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS med 1 µL av Orange stamlösning (se lista). Blanda försiktigt genom pipettering och inkubera i 5 min i mörker.
- Pellet celler genom centrifugering och resuspendera i 1 mL PBS ta bort överflödig Orange. Tvätta cellerna två gånger och återsuspendera pelleten i 50 µL PBS.
- Tillämpa 0,8-1 µL av celler till en agaros pad och bilden med epifluorescence mikroskopi omedelbart. Se avsnitt 3.1 och 3.2.
Obs: Detta protokoll fungerar bra med levande celler och är lämplig för time-lapse mikroskopi att iaktta kromosom dynamics (figur 3). Om det inte är bekvämt att bilden omedelbart, får cellerna fastställas i iskall 70% etanol (se avsnitt 2.2.1.2).
- DAPI färgning av celler
-
Membranet märkning
Obs: Den lipofila styryl fluorescerande färgämnen 4-64 har använts i stor utsträckning att iaktta membranet i bakterieceller. I motsats till många bakterier, 4-64 märkt A. tumefaciens celler märker inte jämnt, men ganska ofta uppvisar en ”hästskon” mönster14,15. Anmärkningsvärt, tillväxt masten saknar nästan fläcken medan den gamla Polen är intensivt märkt. Alltså möjliggör 4-64 visualisering av både cell tillväxtmönster och membranstruktur i A. tumefaciens.- Lägg till FM 4-64 till en slutlig koncentration på 8 µg/mL i 1 mL av exponentiell fas cellkultur och odla i rumstemperatur i 5 minuter i mörkret.
- Pellet märkta celler genom centrifugering vid 7000 x g i 5 minuter i en stationär centrifug och resuspendera cellpelleten i 1 mL PBS. Tvätta cellerna sammanlagt tre gånger för att ta bort överflödig färg.
- Att resuspendera cellerna i en liten volym av PBS och plats på en agaros pad att bilden omedelbart. (Se avsnitt 3.1 och 3.2)
FÖRSIKTIGHET: Celler måste avbildas omedelbart för att iaktta karakteristiska märkning mönster.
3. avbildning av A. tumefaciens celler
-
Agaros pad förberedelse
Obs: Figur 1 innehåller en bildsekvens (panel A) och (panel B) Schematisk bild av en typisk agaros pad förberedd för time-lapse mikroskopi. Agaros pads tillagas vanligtvis som behövs.- 3.1.1. Använd ett täckglas som guide och klippa en 22 x 22 mm fyrkantig laboratorium film (se lista) genom att köra en skalpell runt kanterna.
- Skär en kvadrat ur centrum av laboratoriet filmen lämnar en ~ 2-5 mm gränsen att fungera som en packning för agaros pad. Kassera center utskärningen.
- Placera filmen packningen på en glasskiva (75 x 25 mm) rengöras med ammoniak och alkoholfri renare (se lista över material) och Värm tills filmen är lite smält på glas (övre bilden i figur 1A). Smälta laboratorium film, använda kanten av en värme block set till 70 ° C eller smälta lätt över en eld.
- Förbered agaros lösning genom att blanda ~0.075 g agaros (se lista) i 5 mL av media i en liten kolv. Värm lösningen i mikrovågsugn med periodiska virvlande blanda tills Agarens är upplöst och lösningen är klar. Hålla agaros lösningen på 55-70 ° C och Använd för byggandet av flera agaros pads inom 48 timmar.
- Pipettera media som innehåller 1,2-1,5% agaros in i centrera av packningen.
Obs: Volymen av media är vanligtvis 50-60 µL men varierar beroende på packning storlek. Lägga till media till en kall bild kan orsaka Agarens stelna för fort, bör alltså bilden hållas på en varm yta. Kanten av ett värme block ställa till 70 ° C fungerar väl. Vatten agaros eller buffrat-agaros lösningar såsom fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kan användas i stället för media som innehåller agarosgelelektrofores för applikationer där fortsatt celltillväxt inte krävs. För imaging utarmning stammar, inducerare kan vara närvarande eller frånvarande i media. Förekomsten av inducerare kan användas som en kontroll medan avsaknad av inducerare kommer att avslöja den utarmning fenotypen. - Placera ett täckglas över packningen för att jämnt fördela Agarens.
- Placera bilden på en cool, jämn yta att stelna för ~ 2 min. Undvik overdrying av agaros pad eftersom detta kommer att resultera i en skrynklig yta på agaros pad och sammanslagning av cellsuspensionen när de appliceras på ytan.
- Försiktigt dra täckglaset av agaros pad.
Försiktighet: Stressa inte detta steg. Agaros pad kan enkelt Riva och en ojämn agaros pad kan försvåra imaging. - Låt agaros pad till luft torka för 1-2 min i rumstemperatur på tills ytan av pad visas torr. Med en skalpell, ta bort en liten remsa av agaros till skapa en luftficka (mellersta bild, figur 1A); luftficka är typiskt ~ 2 x 7-10 mm och A. tumefaciens celler tenderar att växa bästa nära air fickan (figur 1 c).
Obs: För avbildning av fasta celler eller under förhållanden där tillväxt inte övervakas, en luftficka är inte nödvändigt. - Plats 0,8-1 µL av celler på agaros pad och täck med ett nytt täckglas. Placera försiktigt täckglaset över toppen av agaros pad att distribuera cellerna över ytan av agaros pad.
- Försegla kanterna av den täckglas använder smält VALAP (se Material tabell för receptet. Figur 1A, nedre bilden). Underlåtenhet att täta längs alla kanter och hörn av täckglaset kan orsaka uttorkning av agaros pad, vilket leder till den drivande av celler under imaging. Obs: Tätning av täckglaset behövs endast för långsiktiga time-lapse avbildning.
Figur 1: agaros pad förberedelse. (A) bild sekvens av protokollet agaros pad förberedelse. Bild 1 är en bild med laboratorium film packningen. I bild 2 visualiseras agaros plattan och luftficka. Slutligen, bild 3 visar komplett agaros pad med celler under ett täckglas och förseglade med VALAP. (B) en schematisk bild av en agaros pad för time-lapse mikroskopi tillhandahålls. Nyckel dragen av agaros pad är märkt på schematiskt. (C) luftficka främjade tillväxten av A. tumefaciens på agaros trampdynor. Bilder av vildtyp A. tumefaciens celler odlas på en agaros pad för 20 timmar visas. Bilder togs på positioner alltmer avlägsen från luftficka. Avståndet från den närmaste kanten av bilden till luftficka visas ovanför varje bild. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
-
Imaging
Obs: Differential störningar kontrast, faskontrast och epifluorescence imaging utförs med ett inverterat Mikroskop utrustat med en automatisk etapp, en LED-ljuskälla, standardfilter, järnvaror-baserat autofokus, 60 X oljeimmersion mål (1,4 NA) för faskontrast eller differentiell störningar kontrast (DIC), och en 1K electron-multiplicera kostnad-tillsammans-enhet (elektrisk) kamera. Mikroskopet bör placeras i en kontrollerad temperatur rum. Alternativt, ett skede varmare eller kammare kan användas att hålla jämn temperatur under imaging.- Epifluorescence mikroskopi
Obs: För fluorescens imaging av levande celler, det är nödvändigt att begränsa antalet bild förvärv och optimera exponeringstiden att minimera fotoblekning och fototoxicitet. För imaging varje färgämne rekommenderas det att hitta en optimal exponeringstid som ger tillräcklig fluorescens upptäckt men leder inte till fotoblekning eller fototoxicitet. I figurerna 2-4användes exponeringstiderna 200 ms för alla fluorescens bilder. För time-lapse sekvenser visas i figur 3, förvärvades bilder varje 10 min för 3 h.- Placera nedsänkning olja på det eftersträvade målet och placera den inverterade bilden i bildhållaren på scenen. Använda fokus vreden att cellerna i fokus.
- Skaffa bilder i fas (eller DIC) och filtret önskad fluorescens.
Obs: De maximala excitation och utsläpp våglängderna för de fläckar som används i figur 2, figur 3och figur 4 är följande: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).
- Time-lapse mikroskopi
Obs: Under time-lapse mikroskopi följande funktioner är datorstyrda: x, y och z position, fönsterluckor och fluorescens filter. En maskinvarubaserad autofokus system är optimalt att behålla fokus under time-lapse imaging. Alternativt kan en mjukvaran-baserat autofokus loop användas.- Placera nedsänkning olja på det eftersträvade målet och placera den inverterade bilden i bildhållaren på scenen. Använda fokus vreden att cellerna i fokus.
- Valfritt: Förvärva flera (x, y) positioner. Välj slumpmässigt 10 fält av celler i närheten luftficka av agaros kuddar.
- Set-up tid sekvens förvärvet till bild i fas eller DIC på önskat tidsintervall.
Obs: För time-lapse sekvensen visas i figur 4, DIC bilder förvärvades med 30 ms exponering varje 10 min för 14 h. När du använder fluorescens imaging under time-lapse mikroskopi, justera förvärv intervall och exponering tid att minimera fotoblekning och fototoxicitet.
- Epifluorescence mikroskopi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Target-specifik märkning av vildtyp A. tumefaciens celler
För att illustrera att cellmorfologi påverkas inte av tvätta stegen eller behandling med 1% DMSO (som används för att späda ut de fluorescerande färgerna), celler var avbildas direkt från kultur (figur 2A, längst till vänster panel), efter tvättning cellerna av centrifugering som beskrivs i punkt 1.2 (figur 2A, vänstra panelen) eller efter inkubation cellerna med 1% DMSO i 10 min och tvätta cellerna (figur 2A, högra panelen). Dessa bilder illustrerar att morfologi inte påverkas av tvätt eller förekomsten av DMSO. Dessutom påverkas inte celltillväxt av tvätt eller DMSO behandling baserat på kurvan Tillväxtanalys (inga data anges). Dessutom orsakar infästning A. tumefaciens med iskall etanol inte brutto förändringar i morfologi (figur 2A, längst till höger panel).
Därefter användes target specifika färgämnen att iaktta cellväggen biogenes, membran domäner och DNA inom vildtyp A. tumefaciens celler. Mönster av nya peptidoglykan införande observerades efter märkning med tre lysrör-d-aminosyror: HADA (figur 2B, vänster panel), NADA (figur 2B, center panel) och TADA (figur 2 c, högra panelen). I alla tre märkning experiment berikas nya peptidoglykan märkning på tillväxt pole eller septum celler. Dessa växtmönster observerades konsekvent med alla tre FDAAs, som anger att FDAA markeringen kan ändras om du vill aktivera dubbel märkning med andra fläckar eller celler som uttrycker fluorescently märkta proteiner. Lipofila färgämnet 4-64 etiketter företrädesvis gamla pole regionen av A. tumefaciens celler vilket resulterar i en karakteristisk hästsko mönster (figur 2 c). Både Orange (figur 2D, vänstra panelen) och DAPI (figur 2D, högra panelen) etikett DNA inom live A. tumefaciens celler. I sena pre-divisional celler, två distinkta nucleoids observeras med Orange fläckar, DNA märkning förefaller mer diffus med DAPI färgning (figur 2D) överensstämmer med experiment resultat observerades i E. coli10.
Lämpligheten av DNA färgämnen för time-lapse mikroskopi
För att avgöra om antingen DAPI eller Orange är lämplig för time-lapse avbildning av nucleoid morfologi under celltillväxt, var en lika stor andel omärkt, DAPI-märkt, och Orange-märkt vildtyp A. tumefaciens celler blandade och fläckig på agaros pads. Vid tidpunkt 0, inledande bilder togs med faskontrast, DAPI och TRITC filter för att avgöra om varje cell var märkt. Cell blandningar var sedan avbildas under tre olika villkor: (1) fas kontrast mikroskopi bara, (2) fas kontrast och epifluorescence mikroskopi med TRITC filter och (3) fas kontrast och epifluorescence microscopyen med filtret DAPI. Bilder förvärvades var 10 minut i 3 timmar. Alla celler växte väl oavsett fluorescerande fläcken används när avbildas med fas kontrast mikroskopi som visar att varken Orange eller DAPI färgning försämra celltillväxt (figur 3, övre panelen). Alla celler ökade också väl när fotograferad av fas mikroskopi och epifluorescence mikroskopi med filtret TRITC (figur 3, center panel). Orange bandet omfattas av fotoblekning men kan observeras för minst 2 h (13 totala exponeringar av 200 ms), som indikerar lämpligheten av detta färgämne för kortfristiga mikroskopi av levande celler. Oavsett märkning, alla celler slutar växa inom en timme när fotograferad av fas mikroskopi och epifluorescence mikroskopi med filtret DAPI (figur 3, nedre panelen). Denna observation visar att A. tumefaciens är känsliga för UV-exponering och indikerar att färgämnen som kräver ett UV-filter för avbildning bör undvikas för time-lapse mikroskopi experiment.
Time-lapse imaging och target-specifik märkning av en A. tumefaciens utarmning stam
Både mättar transposon mutagenes39 och misslyckas med att konstruera en radering stam18,40 visar att proteinet mästare regulator, CtrA, är väsentliga i A. tumefaciens. För att påvisa värdet av mikroskopisk analys av utarmning stammar, utsattes en tidigare beskrivna ctrA utarmning stam18 för karakterisering av mikroskopi. I figur 4A, time-lapse mikroskopi användes att jämföra tillväxten av ctrA utarmning celler i vilka ctrA uttryck var inducerad (överst) och uninduced (nederst). I närvaro av CtrA gav en enda cell upphov till en microcolony inom 14 h. Däremot när CtrA var uttömda, celler antingen lyserat eller underlåtit att dela. Celler som misslyckades att splittra utställda brutto morfologiska förändringar inklusive avrundning från mitten av cellen och vid cell polerna. Dessa observationer tyder på att CtrA har en viktig funktion vid regleringen av celldelning.
I figur 4B-D, användes fluorescerande färger för att karakterisera ctrA utarmning stammen efter induktion eller utarmning av ctrA för 10 h. celler var puls märkt med NADA i 2 min (figur 4B). När CtrA var närvarande (övre panelen), polar peptidoglykan biosyntes observerades. Däremot omfattande NADA märkning inträffade i polerna och stora mitten av cellen svullnader inträffade när CtrA var slut. Denna observation stämmer med fortsatt peptidoglykansyntesen trots bristande cellerna att dela. Cyanin DNA färgen Orange användes att karakterisera DNA distribution i ctrA utarmning stam (figur 4 c). När CtrA var närvarande, växande celler hade en jämn fördelning av DNA och segregering av nucleoids var uppenbart i en sena pre-divisional cell; Däremot när CtrA var uttömda, var DNA ojämnt fördelade i hela cellerna. Dessa observationer tyder på att CtrA bidrar till korrekt DNA-replikation eller segregation. Slutligen, ctrA utarmning celler var märkt med 4-64 (figur 4 d). I närvaro av CtrA, var cellmembranet märkt med karakteristiska hästsko mönster där tillväxt pole saknade fläcken. I celler utarmat av CtrA, verkade 4-64 märka hela membranet, även om en pol var mer intensivt färgade. Denna observation tyder på att membran förblir intakt även om lipid microdomain organisationen kan störas när CtrA är förbrukad.
Figur 2: Representativa bilder av vildtyp Agrobacterium tumefaciens celler märkta med target specifika färgämnen. (A) fas kontrast bilder av A. tumefaciens celler före och efter tvätt protokollet, när de behandlades med 1% DMSO eller efter fixering med iskall etanol. (B) Polar tillväxt av A. tumefaciens celler visas av märkning med de fluorescerande d-aminosyror HADA, NADA och TADA. (C) färgningen av A. tumefaciens med lipofila 4-64 fläcken. (D) färgningen av A. tumefaciens celler med DNA-specifika färgerna Orange och DAPI. För paneler B-D visas faskontrast (överst) och epifluorescence (nederst) bilder. Cell konturerna finns i fluorescens bilder för referens. Skalstapeln = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av DAPI och Orange märkning av DNA i levande A. tumefaciens celler. Lika proportioner av omärkta, DAPI-märkt och Orange-märkt vildtyp A. tumefaciens celler var blandade och fläckig på agaros kuddar. Vid tidpunkt 0, inledande bilder togs med faskontrast, TRITC och DAPI filter som bestämmer om cellerna var märkt. (A) Time-lapse av omärkta, DAPI-märkt och Orange-märkt celler fotograferad av fas kontrast mikroskopi. (B) Time-lapse av omärkta, DAPI-märkt och Orange-märkt celler fotograferad av fas mikroskopi och epifluorescence mikroskopi med filtret TRITC. (C) Time-lapse av omärkta, DAPI-märkt och Orange-märkt celler fotograferad av fas mikroskopi och epifluorescence mikroskopi med filtret DAPI. Skalstapeln = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa bilder av ctrA utarmning stammen i inducerad och uninduced villkor. (A) Time-lapse mikroskopi ctrA utarmning stam under förhållanden där ctrA var inducerad (överst) eller utarmat (nederst). Siffrorna ovan varje panel anger tiden i timmar. (B) fas kontrast (vänster) och epifluorescence (höger) bilder av celler märkta med NADA. (C) fas kontrast (vänster) och fluorescens (höger) bilder av celler märkt med Orange. (D) fas kontrast (vänster) och fluorescens (höger) bilder av celler märkta med 4-64. Cell konturer tillhandahölls i fluorescens bilder för referens. Skalstapeln = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll innehåller en rad förfaranden för undersökning av A. tumefaciens vildtyp, mutant och utarmning stammar. Det är värt att notera att alla förfaranden i avsnittet protokoll kan lätt anpassas för andra bakteriestammar med ytterligare ändringar att redovisa tillväxt medier, temperaturer och tillväxttakt.
Användningen av target-specifika färgämnen är ett värdefullt verktyg för att tillhandahålla en detaljerad karakterisering av cellcykeln händelser i bakterieceller. Här peptidoglykan införande mönster observerades med lysrör-d-aminosyror, lipid domäner var visualiserat med 4-64, och nucleoids var märkt med antingen DAPI eller Orange. Samtliga protokoll kan anpassas för användning i andra bakterier efter optimera tvätta protokollet och att säkerställa att DMSO behandling inte försämra tillväxt eller morfologi. Viktiga överväganden omfattar valet av en buffert för tvätta stegen, inkubationstider för etikett iblandning och valet av en lämplig fluorophore undvika auto-fluorescens eller att aktivera multiplex märkning studier. Ett alternativ till lipofila röd fluorescerande membran fläcken (4-64) är exempelvis grön fluorescerande membran fläcken (1-43). Likaså, blå-, grön- och röd-fluorescerande-d-aminosyror är tillgänglig6,38 och d-aminosyror med biorthogonal handtag kan vara konjugerat till vanliga fluorophores genom klicka på kemi6,7. Slutligen, förutom den orange fluorescerande cyanin DNA färga, en grön fluorescerande cyanin DNA färgämne finns och utför väl med levande bakterieceller10. Visualisering av nyckelcellen strukturer märkt med målet-specifika färgämnen kan kombineras med observation av fluorescerande proteiner att få mekanistiska insikter i grundläggande processer i bakterier.
Dessa protokoll inkluderar de villkor som krävs för mikroskopisk observation av A. tumefaciens utarmning fläckar och det bör vara möjligt att förlänga dessa synsätt till protein utarmning stammar i andra bakterier. Karakterisering av utarmning stammar kan vara särskilt utmanande eftersom det finns en begränsad tidsram att slutföra utredningar innan cellerna slutar växa eller lyse. Det är viktigt att adekvat tvätta cellerna för att avlägsna alla spår av den överflödiga färgen under märkning; dock har vissa celler som utarmat av viktiga proteiner brister i sin cell ytor som kan få dem att vara känslig att tvätta stegen. Öka volymen start av cellkulturer kan hjälpa till att kompensera för förlusten av celler under tvätta stegen. Utarmning stammar som har komprometterat cellmembran eller cellväggar kan vara benägen till cell lysis när den odlas i flytande kultur utan inducerare. Införandet av en osmoprotectant (5% sackaros fungerar bra för A. tumefaciens) kan bidra till att upprätthålla cellmorfologi och begränsa cellys under utarmning. Det är nödvändigt att empiriskt fastställa lämplig mängd tid att före bryter cellerna före färgning med fluorescerande färg. Celler med permeablized membran eller cellväggar kan vara benägen till cell lysis eller icke-selektiv märkning med fluorescerande reagenser att göra imaging sen utarmning tidpunkter särskilt utmanande.
Ett kritiskt steg för time-lapse mikroskopi av A. tumefaciens (eller andra bakterieceller) är utarbetandet av agaros pad. Agaros dynan måste vara nivå för att säkerställa bra fokus i hela time-lapse mikroskopi experiment. Dessutom måste täckglaset förseglas helt för att förhindra agaros pad från att torka och ändra fokalplanet. För A. tumefacienskrävs syre för cellernas tillväxt. Imaging nära en luftficka är nödvändigt att få kraftiga ökningen av A. tumefaciens under långa tidsintervaller mikroskopi experiment (figur 1 c). Om cellerna inte växa eller slutar växa efter bara några timmar, är det lämpligt att förbereda en agaros pad med större luftficka och bild nära luftfickor. Även en väl konstruerat agaros pad med en ordentlig luftficka kan bara stödja A. tumefaciens tillväxt för maximalt ~ 24 h. Om det behövs längre time-lapse sekvenser, strategier alternativ såsom mikrofluidik eller flöde celler övervägas. Om cellerna glida ur fokus under imaging, säkerställa att agaros pad nivå och väl förseglade under täckglaset. Observera att även med en nära perfekt agaros pad, det är möjligt att vissa celler kommer att glida ur fokus, således imaging flera fält och täta omfokusering rekommenderas. För andra bakterier övervägas alternativa metoder för att förbereda agaros pads41,42,43 att bäst uppfylla tillväxt kraven för bakterien. Agaros pads är också användbart för att immobilisera celler under imaging märkas eller fasta celler när time-lapse inte är nödvändigt. I det här fallet tätning på täckglas är inte nödvändigt och alternativa metoder för att konstruera agaros kuddar som kan lagras tills senare kan vara lämpliga43.
Användningen av target-specifika färgämnen och time-lapse mikroskopi kan sammantaget ge insikter om grundläggande processer i bakterier. Här, illustrera vi de vanliga hästsko mönstret av märkning med lipofila 4-64 färgämnet och karakteristiska polar och septal märkning med lysrör-d-aminosyror i A. tumefaciens. Observationer av dessa mönster i A. tumefaciens överensstämmer med polar tillväxten av denna bakterie44 och det är troligt att liknande studier kan avslöja information om tillväxt mönstring i andra bakterier. Konstaterandet att cyanin färgämnen som Orange är lämpliga för time-lapse mikroskopi studerar10 (figur 3) möjliggör noggranna studier av nucleoid morfologi under celltillväxt i vildtyp och mutant stammar. Imaging fluorescerande mål-specifika färgämnen under utarmning av en viktig protein kan ge viktiga observationer för att avgöra funktionen av protein. Slutligen, eftersom många av dessa färgämnen finns tillgängliga med olika spektrala egenskaper, bör studier med flera etiketter samtidigt aktivera insikter i samordning av väsentliga processer under cellcykelns förlopp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Michael VanNieuwenhze (Indiana University) för gåvan av de FDAAs som används i figur 2 och figur 4. Vi tackar medlemmar i brun lab för feedback under utarbetandet av detta manuskript. Forskning i brun lab på A. tumefaciens celltillväxt och delning stöds av National Science Foundation (IOS1557806).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
References
- Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
- Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
- Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26 (2010).
- Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
- Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496 (2013).
- Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
- Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
- Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
- Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
- Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
- Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219 (2014).
- Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
- Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
- Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
- Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
- Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137 (2007).
- Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
- Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
- Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
- McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
- Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
- Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730 (2014).
- Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488 (2016).
- Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322 (2014).
- Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519 (2013).
- Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
- Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
- Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682 (2013).
- Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363 (2011).
- Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).
