Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Live celle Fluorescens mikroskopi for at observere væsentlige processer under mikrobielle cellevækst

Published: November 24, 2017 doi: 10.3791/56497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

Summary

Forstå funktionen af væsentlige processer i bakterier udfordrende. Fluorescens mikroskopi med target-specifikke farvestoffer kan give vigtig indsigt i mikrobiel celle vækst og celle cyklus progression. Her, bruges Agrobacterium tumefaciens som en model bakterie fremhæve metoder for levende celle imaging til karakterisering af væsentlige processer.

Abstract

Core cellulære processer såsom DNA-replikation og segregation, proteinsyntese, cellevæg biosyntese og celledeling stole på funktionen af proteiner, som er afgørende for bakteriel overlevelse. En række mål-specifikke farvestoffer kan bruges som sonder til bedre forstår disse processer. Farvning med lipofile farvestoffer giver mulighed for observation af membran struktur, visualisering af lipid microdomains og påvisning af membran blebs. Brug af fluorescerende-d-amino syre (FDAAs) at sonde lokaliteter af peptidoglycan biosyntesen kan oplyse potentielle defekter i cellevæggen Biogenese eller celle vækst mønster. Endelig kan nukleinsyre pletter indikere mulige fejl i DNA replikation eller kromosom adskillelse. Cyanine DNA pletter etiketten lever celler og er velegnet til time-lapse mikroskopi at aktivere realtids observationer af nucleoid morfologi under cellevækst. Protokoller for celle mærkning kan påføres protein nedbrydning mutanter til at identificere fejl i membran struktur, cellevæg Biogenese eller kromosom adskillelse. Time-lapse mikroskopi kan desuden bruges til at overvåge morfologiske ændringer som et vigtigt protein er fjernet og kan give yderligere indsigt i protein funktion. For eksempel, resulterer nedbrydningen af væsentlige celledeling proteiner i filamentation eller forgrening, der henviser til, at nedbrydningen af celle vækst proteiner kan forårsage celler bliver kortere eller rundere. Protokoller for cellevækst, target-specifik mærkning og time-lapse mikroskopi er her fastsat bakteriel plante-patogen Agrobacterium tumefaciens. Sammen, target-specifikke farvestoffer og time-lapse mikroskopi aktiverer karakterisering af væsentlige processer i A. tumefaciens. Endelig, de protokoller findes kan let modificeret til at probe væsentlige processer i andre bakterier.

Introduction

Progression gennem den bakterielle cellecyklus kræver koordinering af mange processer herunder membran og cellevæg biosyntesen, DNA-replikation og segregation og celledeling. Fuldt ud at forstå kompleksiteten af bakteriel cellebiologi, er det nødvendigt at studere disse væsentlige begivenheder; men dette er en ikke-trivielle opgave, da cellernes levedygtighed er kompromitteret, når centrale elementer i disse veje er mutagenized. Epifluorescensmikroskop mikroskopi kombineret med target-specifikke farvestoffer er en kraftfuld tilgang til sonde disse væsentlige processer i vildtype og mutant bakteriestammer.

Peptidoglycan-specifikke farvestoffer omfatter fluorescerende antibiotika (vancomycin-FL, bocillin-FL) og fluorescerende-d-amino syrer (for eksempel 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic syre-3-amino-d-alanin, Holm, 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanin , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanin; TADA). Gram-positive bakterier, har brugen af subletale koncentrationer af fluorescerende antibiotika analoger til sonde lokaliteter af peptidoglycan biosyntesen været en effektiv strategi til at afsløre peptidoglycan indsættelse mønstre1,2, 3,4. Mens fluorescerende vancomycin mærkning er blevet brugt til at få indsigt i peptidoglycan indsættelse mønstre i faste Gram-negative bakterier5, giver den ydre membran generelt en permeabilitet barriere, der forhindrer brug af fluorescerende antibiotika som en sonde til peptidoglycan biosyntese i levende celler. I kontrast, label korte pulser af fluorescerende-d-aminosyrer eller d-aminosyrer med biorthogonal funktionelle grupper kovalent regioner i de seneste peptidoglycan indsættelse i en bred vifte af levende bakterieceller6,7. Mønstre af peptidoglycan indsættelse, der er blevet observeret med syntetisk d-aminosyrer omfatte punktformet og septal (Escherichia coli og Bacillus subtilis), polære og septal (Agrobacterium tumefaciens og Listeria monocytogenes), septal eneste (Staphylococcus aureus) og apikale (Streptomyces venezuelae)6,7. Disse observationer viser at bakterier udviser forskellige mønstre af cellevæggen Biogenese og at brugen af syntetiske d-amino syrer som sonder til at undersøge vækst mønster er en værdifuld strategi i mange bakterier.

Farvestoffer, at mærke bakterielle kromosomer omfatter deoxyribonukleinsyre (DNA) specifikke mindre groove bindemiddel (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) og høj affinitet cyanine farvestoffer (grøn og Orange; Se materialer liste). DAPI farvning af faste celler hjælper med tælling af bakterier fra miljøprøver8, hvorimod DAPI farvning af levende celler bruges til at angive bakteriel levedygtighed9. Derimod farvestoffer cyanine som Orange og grøn er ofte beskrevet som membran impermeant "døde" celle pletter optælles ikke-levedygtige celler9. Bemærkelsesværdigt, når disse reagenser, der anvendes til at probe morfologi af den bakterielle nucleoid under cellevækst, DAPI, Orange og grøn blev alle vist sig at være membran permeant og i stand til at mærkning levende celler10. Lever E. coli celler, DAPI farvning af DNA vises diffus på grund af auto-fluorescens fra cytoplasmaet og gentagne engagementer DAPI-farvede celler med ultraviolet (UV) lys perturbs nucleoid struktur10. Farvning E. coli eller B. subtilis med Orange afslører at dette farvestof er membran permeant og giver langvarig fluorescens ved binding til DNA i levende celler uden at påvirke cellevækst, DNA-replikation, eller kromosom adskillelse10 . Disse observationer tyder på at cyanine DNA farvestoffer kan bruges til at overvåge morfologi af Xanthophyta under cellevækst i mange bakterier.

Phospholipid-specific stryl farvestoffer såsom N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; Se materialer liste) er kationiske stoffer og knytte fortrinsvis med negativt ladede fosfolipider som cardiolipin og phosphatidylglycerol11. Forskellige mønstre overholdes når 4-64 bruges til at mærke membranen af forskellige bakterier. I Escherichia coli, 4-64 er beriget med polakkerne i bands langs den laterale væg, og i de division websteder for sent pre-divisional celler12. I Bacillus subtilis, 4-64 mærkning giver mulighed for visualisering af lipid spiraler13. I Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiketter den ydre membran og er observeret i en karakteristisk "hestesko" mønster, hvor vækst pole er blottet for mærkning14,15. Disse observationer viser, at disse bakterier udviser heterogene lipid distributioner på grund af tilstedeværelsen af lipid domæner, som bidrager til cellulære asymmetri. Ændringer i 4-64 mærkning mønstre såsom tilstedeværelsen af diffuse mærkning, blebs eller blærer, invaginations eller membran svind kan være informative i kendetegner mutanter, der påvirker distribution eller biosyntesen af lipider.

Ud over farvning celler, er bestemmelse af funktionen af proteiner deltager i væsentlige processer nødvendige. Karakterisering af væsentlige proteiner er teknisk udfordrende, fordi det ikke er muligt at slette væsentlige gener og studere de fænotypiske konsekvenser. Således er alternative tilgange, der nedbryder proteinet opstået. For eksempel kan et vigtigt gen sættes under kontrol af en inducerbar promotor snarere end dens indfødte promotor. Inducerbar initiativtagere er lydhøre over for små molekyler såsom; zink16, isopropylalkohol β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, og xylose23, således transskription af target gen ophører og protein af interesse er forarmet når Induceren er fjernet. Alternative tilgange til nedbryder væsentlige proteiner af interesse omfatter syntetiske riboswitches24 som hjælp lille molekyle-RNA interaktioner for at hindre transkription af gener, target, CRISPR indblanding25,26 til blok transskription af target gener og inducerbar protein nedbrydning27,28 , som bruger peptid koder for proteiner, mål for nedbrydning af ClpXP protease. Udtynding stammer giver kun en kort tid for karakterisering før cellerne mister levedygtighed, derfor mikroskopisk billeddannelse af celler med tiden under protein nedbrydningen er en kraftfuld tilgang til karakterisering. Faktisk, mikroskopi af levende bakterieceller har aktiveret forskere at få indblik i grundlæggende biologiske processer, herunder mekanismerne af celle figur vedligeholdelse, sekretion og opdelingen29.

A. tumefaciens er en bakteriel plante patogen30 og naturlige genetiske ingeniør31,32. Således mekanismer relateret til patogenicitet, herunder vært-patogen interaktioner33,34,35, sekretion36og vært transformation30,31, 37 er blevet grundigt undersøgt. Udforme strategier, der forhindre A. tumefaciens medieret sygdom eller forbedre plante transformation ved de processer, der er afgørende for A. tumefaciens overlevelse har brug at blive bedre forstået. Brugen af mål-specifikke farvestoffer og den nylige udvikling af en protein nedbrydning strategi for A. tumefaciens18 giver mulighed for at undersøge væsentlige processer.

Her, leveres detaljerede protokoller til mikroskopisk analyse af vildtype, mutant og protein nedbrydning stammer fra A. tumefaciens . De to første protokoller beskrive hvordan du forbereder celler og mærke dem med target-specifikke farvestoffer. Den tredje protokol indeholder trinvise anvisninger for at forberede Agarosen pads (figur 1) og imaging bakterieceller (figur 2, figur 3, figur 4). Disse protokoller kan også være egnet til andre bakterier med yderligere tilpasninger for at tage højde for forskellige medier betingelser, vækstrater, ilt krav og cellestrukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. vækst af A. tumefaciens stammer

  1. Dyrkning A. tumefaciens stammer
    1. Bruge en steril træ stick eller pipette tip til podes 1 mL af ATGN vækst medier (Se materialer liste for opskriften) med en enkelt koloni af den ønskede stamme.
      Bemærk: For A. tumefaciens udtynding stammer, bør ATGN indeholder 1 mM IPTG som en inducer at opretholde biosyntesen af den essentielle protein.
    2. Vokse A. tumefaciens stammer overnatning i ATGN ved 28 ° C under omrystning ved 225 rpm.
    3. Måling af Ekstinktionen af celler på 600 nm (OD600) ved hjælp af et spektrofotometer. Fortynd cellekultur til en OD600 = ~0.2 og fortsætte med at vokse indtil OD600 = ~0.6 er nået. For udtynding stammer, fortsætte med at vokse med inducer indtil OD600 = ~0.6 er nået.
    4. Bruge vildtype og mutant stammer af A. tumefaciens på OD600 = ~0.6 for mål-specifik farvning og/eller time-lapse mikroskopi (Se afsnit 2 og 3.1). For udtynding stammer, udviske inducer (Se afsnit 1.2).
  2. Fjernelse af inducer til karakterisering af A. tumefaciens protein nedbrydning stammer
    1. Pellet 1 mL af eksponentielle kultur (OD600 = ~0.4-0.6) ved centrifugering ved 7000 x g i 5 min i en desktop centrifugeres ved stuetemperatur.
    2. For at vaske, Fjern supernatanten og resuspenderes i friske medier uden inducer og sammenpresse cellerne som beskrevet ovenfor (1.2.1). Cellerne vaskes ialt 3 gange i friske medier.
    3. Resuspenderes endelige i friske medier og koncentrere celler til en OD600 = ~0.8 for øjeblikkelig farvning med target særlige farvestoffer (afsnit 2 og figur 4B-D) eller time-lapse mikroskopi (punkt 3.2 og figur 4A) . Alternativt, pre nedbryder cellerne i det ønskede tidsrum af voksende celler i medierne uden inducer før farvning og imaging af celler.

2. mål-specifik farvning af A. tumefaciens celler

  1. Fluorescerende d-amino syre cellevæg mærkning
    Bemærk: FDAAs er ikke-giftige fluorescerende d-amino syrer, som er let indarbejdet i A. tumefaciens peptidoglycan. Denne enkle mærkning procedure sonder vækst mønster i levende celler6. Protokoller for syntese af fire FDAAs er tilgængelige38.
    1. Pellet 500 µL af eksponentielle kultur (OD600 = ~0.4-0.6) ved centrifugering ved 7000 x g i 5 min i en desktop centrifuge. Celle resuspenderes i 100 µL af friske medier.
    2. Tilsæt 5 µL af 5 mM FDAA til vasket og koncentreret celler og inkuberes i 2 min. i mørke.
      Bemærk: Begrænse FDAA udsættelse for lys. Af fordøjelsesprocessen vil variere afhængigt af væksten i belastningen. Typisk, inkuberingstider bør være 5-10% af den fordobling tid6.
    3. Sammenpresse cellerne ved centrifugering og vaske celle pellets med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) tre gange.
    4. Resuspend pellet i ~ 50 µL PBS.
      Bemærk: Lydstyrken på PBS anvendes til resuspension kan variere baseret på pellet størrelse.
    5. Anvende 0,8-1 µL af celler til en Agarosen pad og billedet ved hjælp af epifluorescensmikroskop mikroskopi straks (Se afsnit 3.1 og 3.2).
      1. Alternativt, standse yderligere etiket indarbejdelse af fastsættelse af celler med iskold 70% ethanol. Celle resuspenderes i 1 mL iskold 70% ethanol og Ruger på is i 15 minutter.
      2. Indsamle celler ved centrifugering og resuspend i en lille mængde af PBS for billedbehandling på et senere tidspunkt. Gemme celle suspensioner ved 4 ° C og billede inden for 48 timer.
  2. DNA farvning med DAPI eller Orange plet
    Bemærk: At observere DNA struktur, celler er mærket med enten DAPI eller Orange (død celle plet). Selv om klassisk beskrevet som en "dead-celle plet", Orange er permeant, photostable, og ikke påvirke væksten af bakterieceller, gør det muligt for live-celle DNA imaging10. I A. tumefaciens, Orange mærkning fungerer godt i levende celler og er velegnet til time-lapse mikroskopi (figur 3). I modsætning hertil den ultraviolette (UV) lys eksponering nødvendige for billedbehandling DAPI-farvede celler er fototoksisk (figur 3) og dermed DAPI farvning er bedst egnet til farvning levende celler for øjeblikkelig imaging eller farvning fast celler.
    1. DAPI farvning af celler
      1. Pellet 1 mL af eksponentielle kultur (OD600 = ~0.4-0.6) ved centrifugering ved 7000 x g i 5 min i en desktop centrifuge.
      2. Eventuelt for at fastsætte celler før farvning, resuspenderes celle i 1 mL af 70% iskold ethanol. Der inkuberes i isbad i 10-15 min. indsamle celler ved centrifugering som beskrevet i 2.2.1.1.
      3. Celle resuspenderes i 1 mL PBS, som indeholder 1 µL af DAPI stamopløsning (1 mg/mL; Se Materialer tabel). Bland forsigtigt af pipettering og Inkuber i 5 minutter i mørke.
      4. Pellet celler ved centrifugering ved 7000 x g i 5 min og resuspend i 1 mL PBS til at fjerne overskydende DAPI. Cellerne vaskes to gange mere og resuspenderes i 50 µL PBS eller medier.
      5. Anvende 0,8-1 µL af celler til en Agarosen pad og billed benytter epifluorescensmikroskop mikroskopi straks. Se afsnit 3.1 og 3.2.
        Bemærk: Denne protokol er ikke optimale for time-lapse mikroskopi til at observere kromosom dynamics (figur 3). Overvej at bruge Orange farvning som alternativ (Se afsnit 2.2.2).
    2. Orange farvning af levende celler
    3. Pellet 1 mL af eksponentielle kultur (OD600 = ~0.4-0.6) ved centrifugering ved 7000 x g i 5 min i en desktop centrifuge. Resuspend celle pellet i 1 mL PBS, som indeholder 1 µL af Orange stamopløsning (Se materialer liste). Bland forsigtigt af pipettering og Inkuber i 5 min. i mørke.
    4. Pellet celler ved centrifugering og resuspend i 1 mL PBS til at fjerne overskydende Orange. Cellerne vaskes to gange mere og resuspenderes i 50 µL PBS.
    5. Anvende 0,8-1 µL af celler til en Agarosen pad og billed benytter epifluorescensmikroskop mikroskopi straks. Se afsnit 3.1 og 3.2.
      Bemærk: Denne protokol fungerer godt med levende celler og er velegnet til time-lapse mikroskopi til at observere kromosom dynamics (figur 3). Hvis det ikke er praktisk at billede umiddelbart, kan celler fastsættes i iskold 70% ethanol (se punkt 2.2.1.2).
  3. Membran mærkning
    Bemærk: Lipofile styryl fluorescerende farvestof 4-64 er blevet brugt flittigt til at observere membranen af bakterieceller. I modsætning til mange bakterier, 4-64 mærket A. tumefaciens celler mærke ikke ensartet, men temmelig ofte udviser en "hestesko" mønster14,15. Bemærkelsesværdigt, vækst pole er næsten mangler pletter paa den gamle pole hedder intenst. Således 4-64 giver mulighed for visualisering af både celle vækstmønstre og membran struktur i A. tumefaciens.
    1. Tilføje FM 4-64 til en endelig koncentration på 8 µg/mL i 1 mL af eksponentielle fase cellekultur og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter i mørke.
    2. Pellet mærket celler ved centrifugering ved 7000 x g i 5 minutter i en desktop centrifuge og resuspend celle pellet i 1 mL PBS. Cellerne vaskes tre gange for at fjerne overskydende farvestof i alt.
    3. Resuspend celler i en lille mængde af PBS og spot på en Agarosen pad til billede umiddelbart. (Se afsnit 3.1 og 3.2)
      Forsigtig: Celler skal være afbildet straks for at observere karakteristiske mærkning mønstre.

3. billeddannelse af A. tumefaciens celler

  1. Agarosen pad forberedelse
    Bemærk: Figur 1 indeholder en billedsekvens (panel A) og skematisk (panel B) af en typisk Agarosen pad forberedt for time-lapse mikroskopi. Agarosen pads er typisk udarbejdet efter behov.
    1. 3.1.1. Brug en coverslip som en guide og skæres en 22 mm x 22 mm kvadrat af laboratoriet film (Se materialer liste) ved at køre en skalpel omkring kanterne.
    2. Klip en firkant ud af centrum for laboratorieundersøgelser filmen forlader en ~ 2-5 mm kant til at tjene som en pakning til Agarosen pad. Kassér center udskæring.
    3. Placer film pakning på et glas dias (75 mm x 25 mm) rengøres med ammoniak og alkohol-fri renere (Se materialer liste) og varme, indtil filmen er lidt smeltet på glas (øverste billede i figur 1A). Smelte laboratorium film, bruge kanten af en varme blok sæt til 70 ° C eller smelte let over en flamme.
    4. Forberede Agarosen løsning ved at blande ~0.075 g Agarosen (Se materialer liste) i 5 mL af medierne i en lille kolbe. Varme løsning i en mikrobølgeovn med periodiske hvirvlende blanding indtil Agarosen er opløst og løsningen er klar. Holde Agarosen løsning på 55-70 ° C og brug for opførelsen af flere Agarosen puder inden for 48 timer.
    5. Tilsæt medier indeholdende 1,2-1,5% Agarosen ind i midten af pakningen.
      Bemærk: Mængden af medier er typisk 50-60 µL men vil variere baseret på pakning størrelse. Føje medier til et koldt dias kan forårsage Agarosen størkne for hurtigt, bør således at slide holdes på en varm overflade. Kanten af en varme blok sat til 70 ° C virker godt. Vand Agarosen eller buffered Agarosen løsninger såsom fosfatbufferet saltopløsning (PBS) kan bruges i stedet for medier indeholdende Agarosen til applikationer, hvor fortsatte cellevækst ikke er påkrævet. For imaging udtynding stammer, inducer kan være til stede eller fraværende i medierne. Tilstedeværelsen af inducer kan anvendes som en kontrol, mens fraværet af inducer vil afsløre udtynding fænotype.
    6. Placer en coverslip over pakning til jævnt distribuere agarosegelelektroforese.
    7. Placer slide på en cool, plan overflade til at størkne til ~ 2 min. undgå overtørring Agarosen pad, da dette vil resultere i en rynket overflade på Agarosen pad og pooling af cellesuspension når de påføres overfladen.
    8. Skub forsigtigt coverslip off Agarosen pad.
      Forsigtig: Ikke haste dette trin. Agarosen pad kan nemt rive og en ujævn Agarosen pad kan vanskeliggøre billeddannelse.
    9. Tillade Agarosen pad til luft tørre for 1-2 min. ved stuetemperatur indtil overfladen af puden vises tørre. Ved hjælp af en skalpel, fjerne en lille strimmel af Agarosen til at oprette en luft lomme (midterste billede, figur 1A); luft lomme er typisk ~ 2 mm x 7-10 mm og A. tumefaciens celler tendens til at vokse bedste nær luft lomme (figur 1 c).
      Bemærk: For billeddannelse af faste celler eller under forhold, hvor vækst ikke er overvåges, en luft lomme er ikke nødvendigt.
    10. Stedet 0,8-1 µL af celler på Agarosen pad og dække med en ny coverslip. Anbring forsigtigt coverslip over toppen af Agarosen pad at fordele cellerne på overfladen af Agarosen pad.
    11. Forsegle kanterne af coverslip ved hjælp af smeltet VALAP (Se Materialer tabel for opskrift; Figur 1A, nederste billede). Manglende evne til at forsegle langs alle kanter og hjørner af coverslip kan forårsage tørring af Agarosen pad, som vil føre til drifting celler under imaging. Bemærk: Forsegling af coverslip er kun behov for langsigtede time-lapse billeddannelse.

Figure 1
Figur 1: Agarosen pad forberedelse. (A) billede sekvens af Agarosen pad forberedelse protokol. Billede 1 er et dias med laboratoriet film pakning. I billede 2 visualiseret Agarosen pad og luft lomme. Endelig, billede 3 viser komplet Agarosen puden med celler under et daekglas og forseglet med VALAP. (B) en skematisk af en Agarosen pad for time-lapse mikroskopi er fastsat. Nøglen egenskaber i Agarosen puden er mærket på skematiske. (C) luft lomme fremmet vækst af A. tumefaciens på Agarosen puder. Billeder af vildtype A. tumefaciens celler dyrkes på en Agarosen pad for 20 timer er vist. Billeder blev taget på holdninger stadig fjernere fra luft lomme. Afstanden fra den nærmeste kant af billedet til den luft lommen er vist ovenfor hvert billede. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Billedbehandling
    Bemærk: Differential interferens kontrast, fasekontrast og epifluorescensmikroskop imaging er udført med en inverteret mikroskop udstyret med hardware-baserede autofokus, en automatiseret fase, standard filtre, en LED lys kilde, 60 X immersionsolie mål (1,4 NA) for fasekontrast eller differential interferens kontrast (DIC), og en 1K elektron-multiplikation charge-kombineret-enhed (EMCCD) kamera. Mikroskopet bør placeres i en temperatur kontrolleret rum. Alternativt, en fase varmere eller kammer kan bruges til at opretholde konsekvent temperaturer under imaging.
    1. Epifluorescensmikroskop mikroskopi
      Bemærk: For fluorescens billeddannelse af levende celler er det nødvendigt at begrænse antallet af billede erhvervelser og optimere eksponeringstid at minimere photobleaching og fototoksicitet. For billeddannelse af enkelte farvestof anbefales det at finde en optimal eksponeringstid, der giver tilstrækkelig fluorescens registrering men fører ikke til photobleaching eller fototoksicitet. I tallene 2-4, blev eksponering gange 200 MS brugt til alle fluorescens billeder. For time-lapse sekvenser som vist i figur 3, blev billeder erhvervet hver 10 min til 3 h.
      1. Placer immersionsolie på det ønskede mål og placere det inverterede dias i lysbilledholderen på scenen. Bruge de fokusering drejeknapper til at bringe cellerne i fokus.
      2. Erhverve billeder i fase (eller DIC) og den ønskede fluorescens filter.
        Bemærk: Maksimal excitations- og bølgelængder for pletter bruges i figur 2, figur 3og figur 4 er som følger: Holm (405/460), Nielsen (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).
    2. Time-lapse mikroskopi
      Bemærk: Under time-lapse mikroskopi følgende funktioner er computerstyret: x, y og z position, skodder og fluorescens filtre. En hardware-baseret auto-fokus system er optimal til at fastholde fokus under time-lapse billeddannelse. Alternativt, en software-baseret auto-fokus løkke kan bruges.
      1. Placer immersionsolie på det ønskede mål og placere det inverterede dias i lysbilledholderen på scenen. Bruge de fokusering drejeknapper til at bringe cellerne i fokus.
      2. Valgfrit: Erhverve flere (x, y) positioner. Tilfældigt vælge 10 felter af celler i tæt nærhed til luft lomme af Agarosen puder.
      3. Set-up tid sekvens erhvervelse til billedet i fase eller DIC på det ønskede tidsinterval.
        Bemærk: For time-lapse sekvensen vist i figur 4, DIC billeder blev erhvervet med 30 ms eksponering hver 10 min for 14 h. Når du bruger fluorescens imaging under time-lapse mikroskopi, justere erhvervelse interval og eksponering tid til at minimere photobleaching og fototoksicitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Target-specifik mærkning af vildtype A. tumefaciens celler
For at illustrere at celle morfologi er ikke påvirket af wash skridt eller behandling med 1% DMSO (som bruges til at fortynde de fluorescerende farvestoffer), celler blev afbildet direkte fra kulturen (figur 2A, længst til venstre panel), efter vask celler ved centrifugering som beskrevet i punkt 1.2 (figur 2A, venstre panel), eller efter inkubere celler med 1% DMSO i 10 min og vask celler (figur 2A, højre panel). Disse billeder illustrerer, at morfologi ikke er påvirket af vask eller tilstedeværelsen af DMSO. Derudover er cellevækst ikke påvirket af vask eller DMSO behandling baseret på vækst kurve analyse (data ikke vist). Derudover forårsager fastsættelse A. tumefaciens med iskold ethanol ikke brutto ændringer i morfologi (figur 2A, langt højre panel).

Næste, target specifikke farvestoffer blev brugt til at observere cellevæg Biogenese, membran domæner og DNA i vildtype A. tumefaciens celler. Mønstre af nye peptidoglycan indsættelse blev observeret efter mærkning med tre lysstofrør-d-amino syrer: Holm (figur 2B, venstre panel), Nielsen (figur 2B, center panel) og TADA (figur 2 c, højre panel). I alle tre mærkning eksperimenter, blev nye peptidoglycan mærkning beriget på vækst pole eller septum af celler. Disse vækstmønstre var konsekvent observeret med alle tre FDAAs, der angiver, at FDAA Udvalget kan ændres for at aktivere dobbelt mærkning med andre pletter eller celler, der udtrykker fluorescently mærket proteiner. Den lipofile farvestof 4-64 etiketter fortrinsvis gamle pole regionen A. tumefaciens celler, hvilket resulterer i en karakteristisk horseshoe mønster (figur 2 c). Både Orange (figur 2D, venstre panel) og DAPI (figur 2D, højre panel) label DNA i live A. tumefaciens celler. I sene pre-divisional celler, to særskilte Xanthophyta er observeret med Orange farvning, DNA mærkning forekommer mere diffus med DAPI farvning (figur 2D) overensstemmelse med eksperimenter resultater observerede i E. coli10.

Egnetheden af DNA farvestoffer for time-lapse mikroskopi
For at afgøre, om enten DAPI eller Orange er egnet for time-lapse billeddannelse af nucleoid morfologi under cellevækst, blev en lige andel af umærkede, DAPI-mærket, og Orange-mærket vildtype A. tumefaciens celler blandet og spottet på Agarosen puder. På tidspunkt 0, oprindelige billeder blev taget med fasekontrast, DAPI og TRITC filtre til at bestemme, hvis hver celle var mærket. Celle blandinger blev derefter afbildet på tre forskellige betingelser: (1) fase kontrast mikroskopi kun, (2) fase kontrast og epifluorescensmikroskop mikroskopi ved hjælp af de TRITC filter og (3) fase kontrast og epifluorescensmikroskop mikroskopi bruger filteret DAPI. Billeder blev erhvervet hver 10 minutter i 3 timer. Alle celler voksede godt uanset fluorescerende pletten bruges når afbildet med fase kontrast mikroskopi viser, at hverken Orange eller DAPI farvning forringe cellevækst (figur 3, toppanelet). Alle celler voksede også godt når afbildet af fase mikroskopi og epifluorescensmikroskop mikroskopi bruger filteret TRITC (figur 3, center panel). Den Orange etiket er underlagt photobleaching men kan observeres for mindst 2 h (13 samlede engagementer af 200 ms), med angivelse af egnetheden af dette farvestof til kortsigtede mikroskopi af levende celler. Uanset mærkning, stoppe alle celler vokser inden for en time når afbildet af fase mikroskopi og epifluorescensmikroskop mikroskopi bruger filteret DAPI (figur 3, nederste panel). Denne observation viser, at A. tumefaciens er følsomme over for UV-eksponering og angiver, at farvestoffer der kræver et UV-filter for billeddannelse bør undgås for time-lapse mikroskopi eksperimenter.

Time-lapse imaging og target-specifik mærkning af en A. tumefaciens udtynding stamme
Både mætte transposon mutagenese39 og undlade at konstruere en sletning stamme18,40 angive, at master regulator protein, CtrA, er vigtige i A. tumefaciens. For at demonstrere værdien af mikroskopisk analyse af nedbrydningen stammer, blev en tidligere beskrevet ctrA udtynding stamme18 udsat for karakterisering af mikroskopi. I figur 4A, time-lapse mikroskopi blev brugt til at sammenligne væksten i ctrA udtynding celler i som ctrA udtryk blev induceret (øverst) og uninduced (nederst). I nærværelse af CtrA gav en enkelt celle anledning til en microcolony inden for 14 h. Derimod når CtrA var opbrugt, celler enten mængden eller undladt at opdele. Celler, der mislykkedes at opdele udstillet brutto morfologiske ændringer herunder afrunding fra midten celle og ved celle polerne. Disse observationer tyder på at CtrA har en vigtig funktion i reguleringen af celledeling.

I figur 4B-D, blev fluorescerende farvestoffer brugt til at karakterisere ctrA udtynding stamme efter induktion eller udtynding af ctrA for 10 h. celler var puls mærket med NADA for 2 min (figur 4B). Hvornår CtrA var til stede (øverste panel), polar peptidoglycan biosyntesen blev observeret. Derimod omfattende NADA mærkning opstod i polakkerne og store midten celle hævelser opstod CtrA var udtømte. Denne observation er i overensstemmelse med fortsatte peptidoglycan syntese trods et manglende cellerne til at opdele. Cyanine DNA farvestof Orange blev brugt til at karakterisere DNA distribution i ctrA udtynding stamme (figur 4 c). Når CtrA var til stede, voksende celler havde en jævn fordeling af DNA og adskillelse af Xanthophyta var tilsyneladende i en sen pre-divisional celle; derimod når CtrA var opbrugt, var DNA ujævnt fordelt overalt i cellerne. Disse observationer tyder på at CtrA bidrager til ordentlig DNA-replikation eller adskillelse. Endelig var ctrA udtynding celler mærket med 4-64 (figur 4D). I nærværelse af CtrA, var cellemembranen mærket med en karakteristisk horseshoe mønster, hvor vækst pole var blottet for pletten. I celler forarmet af CtrA, syntes 4-64 at mærke hele membranen, selvom en polak var mere intenst farves. Denne konstatering foreslår at membraner forblive intakt, selv om lipid microdomain organisation kan blive forstyrret, når CtrA er opbrugt.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder af vildtype Agrobacterium tumefaciens celler mærket med target specifikke farvestoffer. (A) fase kontrast billeder af A. tumefaciens celler før og efter vask-protokollen, når behandlet med 1% DMSO eller fiksering med iskold ethanol. (B) Polar vækst af A. tumefaciens celler er vist ved mærkning med fluorescerende d-amino syrer Hjorth, NADA, og TADA. (C) farvning af A. tumefaciens med lipofile 4-64 pletten. (D) farvning af A. tumefaciens celler med DNA-specifikke farvestoffer Orange og DAPI. For paneler B-D, er fasekontrast (øverst) og epifluorescensmikroskop (bunden) billederne vist. Celle konturer leveres i fluorescens billeder for reference. Skalalinjen = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af DAPI og Orange mærkning af DNA i live A. tumefaciens celler. Lige andele af umærkede, DAPI-mærket og Orange-mærket vildtype A. tumefaciens celler blev blandet og spottet på Agarosen puder. På tidspunkt 0, oprindelige billeder blev taget med fasekontrast, TRITC og DAPI filtre til at bestemme, hvis cellerne var mærket. (A) Time-lapse af umærkede, DAPI-mærket og Orange-mærket celler afbildet af fase kontrast mikroskopi. (B) Time-lapse af umærkede, DAPI-mærket og Orange-mærket celler afbildet af fase mikroskopi og epifluorescensmikroskop mikroskopi bruger filteret TRITC. (C) Time-lapse af umærkede, DAPI-mærket og Orange-mærket celler afbildet af fase mikroskopi og epifluorescensmikroskop mikroskopi bruger filteret DAPI. Skalalinjen = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative billeder af ctrA udtynding stamme i induceret og uninduced. (A) Time-lapse mikroskopi af ctrA udtynding stamme under forhold hvor ctrA blev induceret (øverst) eller forarmet (nederst). Tal over hvert panel viser tiden i timer. (B) fase kontrast (venstre) og epifluorescensmikroskop (højre) billeder af celler mærket med NADA. (C) fase kontrast (venstre) og fluorescens (højre) billeder af celler mærket med Orange. (D) fase kontrast (venstre) og fluorescens (højre) billeder af celler mærket med 4-64. Celle konturer blev leveret i fluorescens billeder for reference. Skalalinjen = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol indeholder en række procedurer for undersøgelse af A. tumefaciens vildtype, mutant og udtynding stammer. Det er værd at bemærke, at alle de procedurer, der er anført i afsnittet protokol kan let tilpasses til andre bakterielle stammer med yderligere ændringer for at tage højde for vækst medier, temperaturer og vækstrater.

Brugen af mål-specifikke farvestoffer er et værdifuldt redskab til at give en detaljeret karakterisering af cellecyklus begivenheder i bakterieceller. Her, peptidoglycan indsættelse mønstre blev observeret ved hjælp af fluorescerende-d-aminosyrer, lipid domæner blev visualiseret med 4-64, og Xanthophyta var mærket med enten DAPI eller Orange. Hver af protokollerne, der kan tilpasses til brug i andre bakterier efter optimering vask-protokollen og sikre at DMSO behandling ikke forringe vækst eller morfologi. Vigtige overvejelser omfatter udvælgelsen af en buffer til vask trin, inkuberingstider etiket blandes og udvælgelsen af en passende fluorophore til at undgå auto-fluorescens eller aktivere multiplex mærkning undersøgelser. For eksempel, er et alternativ til lipofile rødt-fluorescerende membran pletten (4-64) grønt-fluorescerende membran pletten (1-43). På samme måde, blå - grøn- og rødt-fluorescerende-d-amino syrer er tilgængelige6,38 og d-aminosyrer med biorthogonal håndtag kan være konjugeret med fælles fluorophores gennem Klik kemi6,7. Endelig, ud over orange-fluorescerende cyanine DNA farvning, en grøn fluorescerende cyanine DNA farvestof er tilgængelig og fungerer godt med live bakterieceller10. Visualisering af nøglecellen strukturer mærket med target-specifikke farvestoffer kan kombineres med observation af fluorescerende proteiner at få mekanistiske indblik i vigtige processer i bakterier.

Disse protokoller omfatter betingelser, der er nødvendige for mikroskopiske observation af A. tumefaciens udtynding pletter og det bør være muligt at udvide disse tilgange til protein nedbrydning stammer i andre bakterier. Karakterisering af udtynding stammer kan være særligt udfordrende, da der er en begrænset tidsramme at fuldføre undersøgelserne før cellerne stoppe voksende eller lyse. Det er afgørende at tilstrækkeligt vaske cellerne for at fjerne alle spor af den overskydende farve under mærkning; nogle celler forarmet af væsentlige proteiner har dog defekter i deres celle overflader, som kan få dem til at være følsom til at vaske trin. Øge start mængden af cellekulturer kan hjælpe med at kompensere for tab af celler i wash skridt. Udtynding stammer, der har kompromitteret cellemembraner eller cellevægge kan være tilbøjelig til celle lysis når der dyrkes i flydende kultur uden inducer. Medtagelsen af en osmoprotectant (5% saccharose virker godt for A. tumefaciens) kan bidrage til at opretholde celle morfologi og begrænse celle lysis under nedbrydning. Det er nødvendigt at empirisk bestemme den passende mængde af tid til at pre nedbryder cellerne inden farvning med fluorescerende farvestof. Celler med permeablized membraner eller cellevægge kan være tilbøjelig til celle lysis eller ikke-selektiv mærkning med fluorescerende reagenser gør imaging sent udtynding tidspunkter særligt udfordrende.

Et kritisk trin for time-lapse mikroskopi af A. tumefaciens (eller andre bakterieceller) er forberedelsen af Agarosen pad. Agarosen puden skal være plan for at sikre god fokus hele time-lapse mikroskopi eksperimenter. Derudover skal coverslip forsegles helt for at forhindre Agarosen pad fra tørring og ændre brændplanet. For A. tumefacienser ilt nødvendig for cellevækst. Imaging nær en luft lomme er nødvendige for at få robuste vækst i A. tumefaciens under lange time-lapse mikroskopi eksperimenter (figur 1 c). Hvis celler ikke vokse eller stoppe voksende efter blot et par timer, er det tilrådeligt at udarbejde en Agarosen pad med en større luft lomme og billede nær luft lommer. Selv velopbygget Agarosen pad med en ordentlig luft lomme kan kun støtte A. tumefaciens vækst for maksimalt ~ 24 h. Hvis længere time-lapse sekvenser er nødvendige, metoder alternative såsom mikrofluidik eller flow celler bør overvejes. Hvis cellerne glider ud af fokus under imaging, sikre at Agarosen pad er jævn og ordentligt forseglet under coverslip. Bemærk, at selv med en i nærheden af perfekt Agarosen pad, det er muligt, at nogle celler vil glide ud af fokus, således imaging flere felter og hyppige refokusering er stærkt anbefales. For andre bakterier, bør alternative tilgange til at forberede Agarosen puder overvejes41,42,43 til bedst opfylder vækst for bakterien. Agarosen pads er også nyttige for immobilisere celler under billeddannelse af mærket eller faste celler når time-lapse ikke er nødvendigt. I dette tilfælde lukning af coverslip er ikke nødvendige og alternative tilgange til at konstruere Agarosen puder, som kan opbevares indtil senere kan være passende43.

Samlet set kan brugen af mål-specifikke farvestoffer og time-lapse mikroskopi give indsigt i grundlæggende processer i bakterier. Her viser vi det sædvanlige horseshoe mønster for mærkning med lipofile 4-64 farvestof og den karakteristiske polar og septal mærkning med fluorescerende-d-amino syrer i A. tumefaciens. Observationer af disse mønstre i A. tumefaciens er i overensstemmelse med denne bakterie44 polar vækst og det er sandsynligt, at lignende undersøgelser kan afsløre oplysninger om vækst mønster i andre bakterier. Konstateringen, cyanine farvestoffer såsom Orange er egnet for time-lapse mikroskopi undersøgelser10 (figur 3) vil aktivere omhyggelige undersøgelser af nucleoid morfologi under cellevækst i vildtype og mutant stammer. Imaging fluorescerende target-specifikke farvestoffer under nedbrydningen af en vigtig protein kan give vigtige observationer for at bestemme funktionen af proteinet. Endelig, da mange af disse farvestoffer er tilgængelige med forskellige spektrale egenskaber, undersøgelser bruger flere etiketter samtidig bør give indsigt i koordineringen af væsentlige processer under cellecyklus progression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Michael VanNieuwenhze (Indiana University) for gaven af FDAAs bruges i figur 2 og figur 4. Vi takke medlemmerne af de brune lab for feedback under forberedelsen af dette manuskript. Forskning i brun lab på A. tumefaciens cellevækst og division er støttet af National Science Foundation (IOS1557806).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58 ATCC 33970 Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH Fisher BioReagents BP359
KH2PO4 Fisher Chemical P288
20X AT Salts Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4 Fisher Chemical A701
MgSO4•7H2O Fisher BioReagents BP213
CaCl2•2H2O Fisher BioReagents BP510
MnSO4•H2O Fisher Chemical M114
Glucose Fisher Chemical D16 Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar Fisher BioReagents BP1423 Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name Company Catalog Number Comments
Optional Media Additives
Kanamycin GoldBio K-120 Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG GoldBio I2481C5 Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides Fisherbrand 12-550D 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-541-B 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner Home Depot 203261385 Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose Invitrogen 16500-100 Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS Fisher BioReagents BP399500 10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm Bemis PM-999 Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter SAAQIN SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly Target Corp. 06-17644
Paraffin Wax Crafty Candles 263012
Name Company Catalog Number Comments
Target-specific dyes
DMSO Fisher BioReagents BP231-1 Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA) FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S11368 Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64 Invitrogen T3166 Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dry bath Sheldon Manufacturing, Inc. 52120-200
Metallic thermal beads Lab Armor 42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26 (2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496 (2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219 (2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137 (2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730 (2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488 (2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322 (2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519 (2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682 (2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363 (2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

Tags

Mikrobiologi sag 129 Agrobacterium væsentlighed time-lapse mikroskopi Agarosen puder fluorescerende d-aminosyrer DNA farvning membran farvning epifluorescensmikroskop mikroskopi
Live celle Fluorescens mikroskopi for at observere væsentlige processer under mikrobielle cellevækst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Howell, M., Daniel, J. J., Brown, P. … More

Howell, M., Daniel, J. J., Brown, P. J. B. Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth. J. Vis. Exp. (129), e56497, doi:10.3791/56497 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter