Summary
細菌の本質的なプロセスの機能を理解することは困難です。ターゲット固有の染料を蛍光顕微鏡は、微生物細胞の成長そして細胞周期の進行に重要な洞察を提供できます。ここでは、アグロバクテリウムは不可欠なプロセスの特性評価のための生きているセルイメージ投射のための方法を強調するモデル菌として使用されます。
Abstract
DNA 複製と分離、タンパク質合成、細胞壁の生合成と細胞分裂などのコア細胞プロセスは、細菌の生存に不可欠なタンパク質の機能に依存します。ターゲット固有の染料のシリーズよりプローブがこれらのプロセスを理解するように使用できます。膜構造の観察、脂質マイクロ ドメインの可視化および膜鉱物の検出を有効脂溶性染料で染色します。蛍光 d-アミノ酸酸ペプチドグリカン生合成のサイトを調査する (FDAAs) の使用は、細胞壁や細胞成長パターンの作成の潜在的な欠陥を示すことができます。最後に、核酸の汚れは、DNA の複製または染色体の分離の可能な欠陥を指定できます。シアニン DNA は、細胞ラベルの汚れ、微速度顕微鏡観察細胞増殖時核様体の形態のリアルタイム観測を有効にするために適しています。セルの分類のためのプロトコルは、膜構造、細胞壁の生合成、または染色体の欠陥を識別するために蛋白質の枯渇変異に適用できます。さらに、微速度顕微鏡観察は重要な蛋白質が削除され、タンパク質の機能に追加の洞察力を提供することができる形態学的変化の監視に使用できます。たとえば、重要な細胞分裂蛋白質の枯渇結果を細線または分岐、細胞成長タンパク質の枯渇が短いまたは円形になる細胞を引き起こす可能性があります一方。ここでは、細胞の成長、ターゲット固有のラベリングおよび微速度顕微鏡観察のためのプロトコルは、細菌植物病原菌アグロバクテリウムを提供しています。一緒に、ターゲット固有の染料と微速度顕微鏡観察に不可欠なプロセスの特性を有効にA. 根頭がんしゅ病菌。最後に、他の細菌に不可欠なプロセスを調査する提供するプロトコルを容易に変更できます。
Introduction
細菌の細胞周期の進行には、膜と細胞壁の生合成、DNA 複製と分離、細胞分裂など多くのプロセスの調整が必要です。細菌の細胞生物学の複雑さを完全に理解するには、これらの重要なイベントを研究する必要があります。しかし、これはこれらの経路の主要なコンポーネントは、突然変異誘発時にセル実行可能性が侵害されたので以外の些細なタスクであります。ターゲット固有の染料と相まって落射蛍光顕微鏡は、野生型と変異細菌株のこれらの重要なプロセスを調査する強力なアプローチです。
ペプチドグリカン固有染料など蛍光抗生物質 (バンコマイシン フロリダ州、bocillin FL) 蛍光 d アミノの酸 (たとえば、7-hydroxycoumarin-3-カルボン酸-3-アミノ-d-アラニン、波田; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-アラニン、灘。tetramethylrhodamine-3-アミノ-d-アラニン;多田)。グラム陽性菌のペプチドグリカン生合成のサイトを調査する抗生物質類縁体蛍光の致死濃度の使用はペプチドグリカン挿入パターン1,2を明らかにするための効果的な戦略をされています。 3,4。外膜は一般的に蛍光を使用できないように関門を提供します蛍光バンコマイシンのラベリングは、固定のグラム陰性細菌5の挿入パターン、ペプチドグリカンに洞察力を得るために使用されています、一方生細胞におけるペプチドグリカン生合成用プローブとしての抗生物質。対照的に、蛍光 d アミノの酸または双直交官能と d-アミノ酸の短いパルスは共有生活細菌細胞6、7の広い範囲で最近のペプチドグリカンの挿入の領域をラベルします。合成 d-アミノ酸と観察されているペプチドグリカン挿入のパターンは、点状、中隔 (大腸菌と枯草) 極と中隔 (アグロバクテリウムとリステリア菌)、中隔のみ (黄色ブドウ球菌)、および根尖 (放線菌 venezuelae)6,7。これらの観察は、細菌が細胞壁の生合成の多様なパターンを示すことと成長パターンを検査するためのプローブとして合成 d-アミノ酸の利用は多くの細菌で貴重な戦略を示します。
細菌の染色体にラベルを付ける染料は、デオキシリボ核酸 (DNA) 特定のマイナーな溝バインダー (4, 6-diamidino-2-phenylindole;DAPI) と親和性の高いシアニン色素 (緑とオレンジ; 材料のリストを参照してください)。生きているセルの DAPI 染色、細菌生存率9を示すために使用されます環境試料8から細菌の列挙に役立ちます DAPI 染色固定セルの。対照的に、シアニン色素膜非透過性の「死んだ」細胞の非実行可能なセル9を列挙する汚れとオレンジと緑が頻繁に記述されているようです。驚くことに、これらの試薬はセル成長の間に細菌の核様体の形態を調査する際、DAPI、オレンジと緑すべてあることを示した膜側の透過物、生きているセル10のラベル付けが可能。住んでいる大腸菌の細胞、細胞質から自動蛍光によるびまん性表示され DAPI は DNA の染色、紫外線 (UV) の DAPI 染色性細胞の反復暴露は核構造10を摂動します。染色の大腸菌や枯草オレンジと明らかにこの色素が膜側の透過物です、染色体分配10 や DNA の複製、細胞の増殖に影響を与えることがなく生きている細胞内の DNA に結合する長期的な蛍光を提供します.これらの観察は、DNA のシアニン色素を多くの細菌の細胞の成長中に核様体の形態を監視する使用ことができることをお勧めします。
Phospholipid-specific stryl N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) フェニルなど染料) hexatrienyl) ピリジニウム臭化 (4-64; 材料リストを参照) は陽イオン性化合物、負荷電に優先的に関連付けるリン脂質カルジオリピンおよびホスファチジルグリセロール11など。4 64 を使用して別の細菌の膜をラベルするときは、明確なパターンが観察されます。大腸菌4-64 極、外側壁に沿ってバンドの濃縮し、後半の pre-divisional の部門サイト細胞12。枯草菌、4-64 の分類、脂質スパイラル13の可視化が可能です。アグロバクテリウムで 4 64 外膜をラベルし、成長ポールが14,15をラベリングを欠いている、特徴的な「馬蹄形」パターンで観察する.これらの観察は、これらの細菌が細胞の非対称性に寄与する脂質ドメインの存在による異種の脂質分布を示すことを示します。びまん性ラベリングの存在など 4 64 ラベリング パターンの変化、鉱物または小胞、陥入、または膜収縮が有益であろう分布または脂質の生合成に影響を与える突然変異体を特徴付けること。
細胞を染色、を超えて、不可欠なプロセスに参加しているタンパク質の機能を決定することは必要です。削除必須遺伝子と表現型の結果を研究することが可能ではないために、重要なタンパク質の解析は技術的に挑戦的です。したがって、タンパク質を破壊する方法が浮上しています。たとえば、そのネイティブのプロモーターではなく誘導性プロモーターの制御下に必須な遺伝子を置くことができます。誘導性プロモーターなどの小さな分子に敏感であります。16イソプロピル β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, アラビノース22、バニリン酸17,23, 亜鉛します。キシロース23、従ってターゲット遺伝子のトランスクリプションを停止するためにおよび興味の蛋白質がなくなると、誘導が削除されたとき。興味の本質的な蛋白質を破壊のための代替アプローチは、CRISPR 干渉25,26 標的遺伝子の転写を阻害する低分子と RNA の相互作用を用いる合成 riboswitches24を含んでいます。ブロックの転写標的遺伝子と化学肥料プロテアーゼによる分解の標的タンパク質をペプチド タグを使用する誘導タンパク分解27,28に。したがって、タンパク質枯渇中に時間の経過とともに細胞の顕微鏡像は、特性評価のための強力なアプローチ、枯渇系統は、細胞生存率を失う前に特性の短時間だけを提供します。確かに、生きている細菌の細胞の顕微鏡観察は、区画29分泌、細胞形状維持のメカニズムを含む基本的な生物学的プロセスへの洞察を得るために研究者を可能にしました。
A. 根頭がんしゅ病菌細菌植物病原体30は、自然遺伝エンジニア31,32。したがって、機構、病原性に関連する宿主-病原体相互作用33,34,35など分泌36、ホスト変換30,31, 37広く検討されています。A. 根頭がんしゅ病菌による病気を防ぐため、植物形質転換を高める戦略を設計するには、 A. 根頭がんしゅ病菌の生存に不可欠なプロセスをよりよく理解する必要があります。ターゲット固有の染料を使用し、最近A. 根頭がんしゅ病菌18タンパク質枯渇戦略の不可欠なプロセスを調査するための手段を提供します。
ここでは、 A. 根頭がんしゅ病菌の野生型、変異体、および蛋白質の枯渇系統の顕微解析のための詳しいプロトコルが提供されます。最初の 2 つのプロトコルはセルを準備し、ターゲット固有の染料でそれらにラベルを付ける方法を説明します。第 3 のプロトコルでは、細菌の細胞 (図 2, , 図 3図 4) をイメージングとアガロース パッド (図 1) を準備するためのステップバイ ステップの指示を提供します。これらのプロトコルは、別のメディア条件、成長率、酸素の要件、および細胞構造を考慮して追加適応を持つ他の細菌に適した可能性があります。
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Protocol
1. A. 根頭がんしゅ病菌系統の成長
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A. 根頭がんしゅ病菌菌株を培養
- 滅菌木製スティックまたはピペットの先端を使用すると、必要なひずみの単一コロニー ATGN 成長媒体 (レシピの材料リスト参照) の 1 mL を接種します。
注: A. 根頭がんしゅ病菌の枯渇株、ATGN に 1 mM IPTG 重要な蛋白質の生合成を維持するために誘導因子としてします。 - 225 rpm で振とうしながら 28 ° c ATGN で一晩A. 根頭がんしゅ病菌系統を成長します。
- 600 セルの光学密度を測定 nm (外径600) 分光光度計を使用しています。外径600に細胞培養を希釈 = ~0.2、外径 φ600まで成長し続ける = ~0.6 に達する。枯渇の緊張のため外径 φ600まで誘導成長し続ける = ~0.6 に達する。
- 外径600 A. 根頭がんしゅ病菌の野生型と変異体の系統を使用してターゲット固有の染色や微速度顕微鏡観察 (セクション 2 および 3.1 参照) の ~0.6 を =。枯渇株をウォッシュ アウト インデューサ (セクション 1.2 を参照)。
- 滅菌木製スティックまたはピペットの先端を使用すると、必要なひずみの単一コロニー ATGN 成長媒体 (レシピの材料リスト参照) の 1 mL を接種します。
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A. 根頭がんしゅ病菌タンパク質枯渇系統の特性評価用インデューサの除去
- 指数文化の 1 mL にペレット (外径600 = ~0.4-0.6) 室温でデスクトップ、遠心分離機で 5 分 7,000 × g で遠心分離によって。
- 洗浄し、上清を除去し新鮮なメディアの誘導なしでペレットを再懸濁し、(1.2.1) 上記のようにセルをペレットします。新鮮なメディアで 3 回の合計セルを洗浄してください。
- 新鮮なメディアで最終的なペレットを再懸濁します、外径600細胞を集中 = ターゲット特定の染料 (セクション 2 および図 4 bD) または (セクション 3.2 と図 4 a) 微速度顕微鏡観察と即時の汚損のための ~0.8.また、成長しているメディアの染色と細胞のイメージングの前に誘導なし細胞でに時間の必要な量のセルを使い果たす前。
2. ターゲット固有A. 根頭がんしゅ病菌の細胞の染色
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蛍光の d-アミノ酸酸細胞壁のラベリング
注: FDAAs は、 A. 根頭がんしゅ病菌ペプチドグリカンに容易に組み込まれている、非毒性の蛍光の d-アミノ酸酸です。この単純なラベリング手順は生きているセル6のパターニング成長をプローブします。4 FDAAs の合成のためのプロトコルは、使用可能な38です。- 指数文化を 500 μ l 添加ペレット (外径600 = ~0.4-0.6) デスクトップ、遠心分離機で 5 分 7,000 × g で遠心分離によって。新鮮なメディアの 100 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。
- 5 mM に FDAA 洗浄し細胞を集中して、暗闇の中で 2 分間インキュベートの 5 μ L を追加します。
注意: 制限 FDAA ライトへの露出。潜伏の時は、株の成長率によって異なります。通常、インキュベーション時間は 2 倍時間6の 5-10% をする必要があります。 - 遠心分離によって細胞をペレットし、3 回リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 細胞ペレットを洗浄します。
- 〜 50 μ L の PBS でペレットを再懸濁します。
注: 再懸濁用 PBS のボリュームは、ペレット サイズに基づいて異なる場合があります。 - 0.8-1 適用 agarose パッドと落射蛍光顕微鏡すぐに (を参照してくださいセクション 3.1 と 3.2) を使用してイメージするセルの μ L。
- 冷たい 70% エタノールとセルを固定することによってさらにラベル定款または、停止します。冷たい 70% エタノール 1 mL の細胞ペレットを再懸濁し、氷で 15 分間インキュベートします。
- 遠心分離によって細胞を収集し、後でイメージングのため PBS の小さなボリュームで再懸濁します。48 時間以内に 4 ° C およびイメージで細胞を懸濁液を格納します。
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DNA 染色 DAPI やオレンジ色の汚れ
注: DNA を観察する構造、細胞は DAPI またはオレンジ (死んだ細胞染色) が付いています。オレンジは側の透過物、古典的な「死んだ細胞染色」として記述されているがあると生きている細胞の DNA10をイメージングを有効にする、細菌の細胞の成長には影響しません。A. 根頭がんしゅ病菌のオレンジ ラベル作品は生きている細胞でよく、微速度顕微鏡観察 (図 3) に適しています。対照的に、DAPI 染色性細胞イメージングに必要な紫外線の (紫外線) 光の露出は光毒性 (図 3)、したがって DAPI 染色即時イメージングまたは固定セルを汚すのための生きた細胞を染色に最も適しています。- DAPI は細胞の染色
- 指数文化の 1 mL にペレット (外径600 = ~0.4-0.6) デスクトップ、遠心分離機で 5 分 7,000 × g で遠心分離によって。
- 必要に応じて前の染色にセルを修正する 70% 冷たいエタノール 1 mL に再細胞ペレット懸を濁します。10-15 分 2.2.1.1 記載として遠心分離によって細胞収集のため氷の上を孵化させなさい。
- DAPI 原液 (1 mg/mL; 参照材料表) の 1 μ L を含む PBS の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。ピペットで穏やかに混合し、暗闇の中で 5 分間インキュベートします。
- 5 分間 7,000 × g で遠心分離によって細胞をペレットし、過剰な DAPI を削除する PBS の 1 mL で再懸濁します。セルを洗浄してさらに 2 回、50 μ L の PBS またはメディアにペレットを再懸濁します。
- 0.8-1 適用 agarose パッドとすぐに落射蛍光顕微鏡を用いた画像のセルの μ L。3.1 と 3.2 のセクションを参照してください。
注: このプロトコルは染色体のダイナミクス (図 3) を観察する微速度顕微鏡観察に最適ではありません。オレンジ染色 (2.2.2 を参照) の代替として使用してください。
- 生きているセルのオレンジ色染色
- 指数文化の 1 mL にペレット (外径600 = ~0.4-0.6) デスクトップ、遠心分離機で 5 分 7,000 × g で遠心分離によって。1 mL のオレンジ原液 1 μ L を含む PBS で細胞ペレットを再懸濁します (マテリアル リストを参照してください)。ピペットで穏やかに混合し、暗闇の中で 5 分間インキュベートします。
- 遠心分離によって細胞をペレットし、過剰なオレンジを削除する PBS の 1 mL で再懸濁します。セルを洗浄してさらに 2 回、50 μ L の PBS でペレットを再懸濁します。
- 0.8-1 適用 agarose パッドとすぐに落射蛍光顕微鏡を用いた画像のセルの μ L。3.1 と 3.2 のセクションを参照してください。
注: このプロトコルは生きているセルでうまく動作し、染色体のダイナミクス (図 3) を観察する微速度顕微鏡観察に適しています。すぐに画像に便利ではない、冷たい 70% エタノール (セクション 2.2.1.2 参照) でセルを修正可能性があります。
- DAPI は細胞の染色
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膜のラベリング
注: 親脂性の styryl の蛍光染料 4 64 使用されています広範囲の細菌の細胞膜を観察します。多くの細菌とは対照的 4 64 標識A. 根頭がんしゅ病菌の細胞は均一に、ラベル付けはしないが頻繁ではなく「馬蹄形」のパターン14,15を展示。驚くことに、古いポールのラベルは強烈なに対し、成長極はほぼ汚れを欠いているです。したがって、4 64 はセル成長パターンとA. 根頭がんしゅ病菌における膜構造物の可視化を実現。 にします。- 指数段階の細胞培養の 1 mL 中 8 μ g/mL の最終的な集中に FM 4-64 を追加し、暗闇の中で 5 分間室温でインキュベートします。
- 7,000 x g でのデスクトップ、遠心分離機で 5 分間遠心分離による標識細胞のペレットし、1 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。セルを洗浄して余分な染料を削除する 3 回の合計。
- PBS の小さいボリュームをすぐにイメージする agarose パッド上のスポットで細胞を再懸濁します。(セクション 3.1 と 3.2 参照)
注意: セルをすぐにでイメージして特徴的なラベリング パターンを観察する必要があります。
3. A. 根頭がんしゅ病菌の細胞のイメージング
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アガロース パッド準備
注:図 1には、動画像 (パネル) と微速度顕微鏡観察のために準備する典型的な agarose パッドの模式図 (パネル B) が含まれています。必要に応じて通常 Agarose パッドで用意します。- 3.1.1 ガイドとカット、22 mm × 22 mm 角研究室のフィルム エッジの周りのメスを実行して (材料のリストを参照してください) として観察を使用してください。
- 2 ~ 5 を残して研究所フィルムの中心の正方形をカット mm 罫線 agarose パッド用ガスケットとして使用します。中央の切り欠きを破棄します。
- ガラス スライド (75 mm × 25 mm) (材料のリストを参照)、アンモニア、アルコール フリーのクリーナーできれいにフィルムのガスケットを配置熱ガラス (図 1 aの上部のイメージ) にフィルムが溶けて少しまでとします。検査フィルムを溶かす、70 ° c の熱ブロック セットの端を使用して、または炎の上を軽く溶かします。
- ~0.075 g アガロースを混合することによってアガロース溶液を準備 (材料のリストを参照) を 5 mL の小さなフラスコ内のメディア。熱ソリューション ミックス agarose を溶解するまで、ソリューションを定期的な旋回と電子レンジでは明らかです。55-70 ° C でアガロース溶液を維持し、48 時間以内複数 agarose パッドの建設のため使用します。
- ガスケットの中心に 1.2 〜 1.5% の agarose を含むピペット メディア。
注: メディアのボリュームは 50-60 μ L ですがガスケットのサイズによって異なります。冷たいスライドにメディアがあまりにも速く固まるアガロースを引き起こす可能性が追加すると、このようにスライドに保管されるべき暖かい表面。ヒート ブロックのエッジを設定する 70 ° C の作品も。水アガロースまたはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) などのバッファーに格納された agarose のソリューションは、継続的な細胞増殖が必要ではないアプリケーションのアガロースを含むメディアの代わりに使用できます。インデューサ枯渇系統をイメージングすることができます提示またはメディアには存在しません。インデューサの不在は枯渇の表現型を明らかにするのに対し、インデューサの存在をコントロールとして使用できます。 - 場所ガスケット上 coverslip agarose を均等に分散します。
- アガロース パッドや細胞懸濁液の表面に適用されたときのプールでしわだらけの表面になるので、回避がオーバードライ agarose パッドの ~ 2 分を固めるにクールなレベルの表面にスライドを配置します。
- アガロース パッド coverslip を慎重にスライドさせます。
注意: この手順を急いでしないでください。アガロース パッドは簡単に引き裂くことができるし、不均一な agarose パッド イメージングを困難にすることができます。 - 許可空気に agarose パッドに 1-2 分乾燥室温でパッドの表面の乾燥を待ちます。メスを使用すると、空気のポケット (中央の画像、図 1 a); を作成する agarose の小さなストリップを削除します。空気のポケットは、〜 2 × 7-10 mm とA. 根頭がんしゅ病菌細胞エアポケット (図 1) に近い最高の成長する傾向があります。
注: 固定セルのまたは成長の監視されていない条件下ではイメージング、空気のポケットの必要はありません。 - スポット 0.8 1 アガロース パッドと新しい coverslip カバー上のセルの μ L。Coverslip をアガロース タッチパッドの表面細胞に分散する agarose のパッドの上にそっと置きます。
- 溶かされた VALAP を使用してカバーガラスのエッジをシール (レシピの材料表を参照してください。図 1 a下の画像)。すべてのエッジや、カバーガラスのコーナーに沿ってシール可能性イメージ投射の間の細胞の漂流につながる agarose のパッドの乾燥します。注: coverslip のシーリングは、長期のタイムラプス イメージング用のみ必要です。
図 1: Agarose パッド準備します。(A) agarose パッドの準備のプロトコルのシーケンスをイメージします。画像 1 は、実験映画のガスケットでスライドです。画像 2 でアガロース パッドと空気のポケットを視覚化します。最後に、画像 3 は、coverglass の下のセルに完全な agarose パッドを示し、VALAP で密封します。微速度顕微鏡観察用アガロース パッドの (B) の回路図を提供しています。アガロース パッドの特長は、回路図にラベル付けされます。(C) 空気のポケットは、アガロース パッドにA. 根頭がんしゅ病菌の生育を推進しました。20 時間 agarose パッド上に成長した野生型A. 根頭がんしゅ病菌細胞の画像が表示されます。画像は、空気のポケットからはますます遠い位置で撮影されました。上の各画像のイメージの最も近い端から空気のポケットまでの距離が表示されます。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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イメージング
注: 微分干渉コントラスト、位相コントラストや落射蛍光イメージング ハードウェア ベースのオート フォーカス、自動ステージ、標準フィルター、LED 光源、60 X オイルの液浸を搭載した倒立顕微鏡を実行です。位相コントラストまたは差動干渉の対照 (DIC) の目的 (1.4 NA) と 1 K 電子乗算電荷結合素子 (EMCCD) カメラです。顕微鏡は、恒温室内に置くべき。また、暖かいステージまたは商工会議所は、イメージング中に一貫した温度を維持するために使用できます。- 落射蛍光顕微鏡
注: 生細胞の蛍光イメージングのため必要があるイメージの買収の数を制限し、退色、光毒性を最小限に抑えるための露出時間を最適化するには各色素のイメージングは、十分な蛍光検出を提供していますが、退色または光毒性につながるしない最適な露出時間を見つけることをお勧めします。図 2-4、200 ms の露光時間はすべての蛍光画像に使用されていました。時間経過のシーケンスは、図 3に示すように、画像は 3 時間 10 分毎に買収されました。- 目的目標にイマージョン オイルを置き、スライド ホルダーに逆スライドをステージに配置します。フォーカシングのノブを使用すると、セルにフォーカスをもたらします。
- 段階 (または DIC) 画像と必要な蛍光フィルターを取得します。
注:図 2図 3、および図 4で使用される汚れの最大励起と放射の波長は次のとおり: 羽田 (405/460)、灘 (450/555)、多田 (555/570) 4-64 (515/640)、DAPI (360/460)、オレンジ (547/570)。
- 微速度顕微鏡観察
注: 微速度顕微鏡観察時に次の機能がコンピューター制御: x、y、および z の位置、シャッター、および蛍光フィルター。ハードウェア ベースのオート フォーカス システムは、タイムラプス イメージング中にフォーカスを維持するために最適です。また、ソフトウェアによるオート フォーカス ループを使用できます。- 目的目標にイマージョン オイルを置き、スライド ホルダーに逆スライドをステージに配置します。フォーカシングのノブを使用すると、セルにフォーカスをもたらします。
- 必要に応じて: 取得複数の (x, y) 位置。ランダムに agarose パッドの空気のポケット近くに細胞の 10 個のフィールドを選択します。
- 適切な時間間隔で位相または DIC のイメージに時間のシーケンス取得を設置しました。
注:図 4に示す時間経過のシーケンス、DIC 画像は 30 ms 露出 14 時間 10 分毎に買収されました。微速度顕微鏡観察における蛍光イメージングを使用している場合は、退色と光毒性を最小限に取得間隔と露出時間を調整します。
- 落射蛍光顕微鏡
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Representative Results
ターゲット固有の野生型のラベル付けA. 根頭がんしゅ病菌の細胞
その細胞の形態を説明するためには、洗浄の手順または (蛍光塗料を希釈するもの) 1 %dmso による治療によっては影響されません、セルでセルを洗浄後文化 (図 2 a、一番左のパネル) から直接イメージしました1.2 (図 2 a、左のパネル)、または 10 分間 1 %dmso と細胞の培養と細胞 (図 2 a、右側のパネル) を洗浄後に遠心分離。これらのイメージは、形態は洗濯や DMSO の存在によって影響を受けないことを示しています。さらに、細胞の成長は洗濯や成長曲線解析 (データは示されていない) に基づく dmso によって影響されません。さらに、冷たいエタノールA. 根頭がんしゅ病菌を修正しても、形態 (図 2 a、右端のパネル) では総変更が発生しません。
次に、ターゲット特定の染料は、野生型a. 根頭がんしゅ病菌の細胞内細胞壁、膜ドメイン、および DNA を観察する使用されました。新しいペプチドグリカン挿入のパターンは次の 3 つの蛍光 d-アミノ酸酸とラベリングみ: 羽田 (図 2 b、左右パネル)、灘 (図 2 b、センター パネル)、多田 (図 2、右のパネル)。すべての 3 つの標識実験の成長や細胞の隔壁で豊かになりました新しいペプチドグリカン ラベリングします。これらの成長パターンは、他の汚れと細胞の蛍光に分類された蛋白質を表現するデュアル ラベルを有効にする、FDAA の選択を変更できることを示すすべての 3 FDAAs と一貫して観察されました。脂溶性染料 4 64 は優先的にA. 根頭がんしゅ病菌の細胞特性蹄鉄パターン (図 2) の結果の古い極領域をラベル付けします。A. 根頭がんしゅ病菌の細胞で、オレンジ (図 2 D、左パネル)、DAPI (2次元の図、右側のパネル) ラベル DNA 内で生活します。後半の pre-divisional 細胞におけるオレンジ染色で観察される 2 つの異なるユーグレナグラシリス、DAPI で拡散表示される DNA の分類に対し (図 2 D) を染色実験結果と一致して観察大腸菌10。
微速度顕微鏡観察のための DNA の染料の適合性
DAPI やオレンジはセル成長の間の核形態のタイムラプス観察に適したかどうかを決定するためにラベル、DAPI ラベルの等しい割合と野生型のオレンジ ラベルA. 根頭がんしゅ病菌の細胞だった混合し、発見アガロース パッド。0 時に、初期の画像が撮影された段階の対照、DAPI、および TRITC を使用して各セルのラベルが付けられたかどうかを決定するフィルター。細胞の混合物を 3 つの異なる条件の下でイメージしました: (1) 位相差顕微鏡のみ、DAPI フィルターを用いた TRITC フィルターと位相 (3) コントラストと落射蛍光顕微鏡を用いた (2) 位相コントラストと落射蛍光顕微鏡。画像は、3 時間 10 分ごとに買収されました。すべてのセルは、位相コントラスト顕微鏡そのどちらもオレンジまたは DAPI 染色を示す損なう細胞増殖 (図 3、上部パネル) のイメージを作成するときに使用される蛍光染色に関係なくよく成長しました。すべてのセルには、位相顕微鏡落射蛍光顕微鏡 TRITC フィルター (図 3、センター パネル) を使用してイメージを作成するときにもまた育った。オレンジ色のラベルは退色を受けますが少なくとも 2 時間 (13 の総エクスポー ジャー 200 ms) 観察することができますこの染料の生きているセルの短期的な顕微鏡検査のための適合性を示します。ラベル付けに関係なくすべてのセルは、1 時間以内に成長を停止位相顕微鏡落射蛍光顕微鏡 DAPI フィルター (図 3底板) を使用してイメージを作成するとき。この観測は、 A. 根頭がんしゅ病菌が紫外線露出に敏感であるし、微速度顕微鏡観察実験のため染料用 UV フィルターを必要とする避けるべきであることを示しますを示します。
タイムラプス イメージングとターゲット固有のラベル、A. 根頭がんしゅ病菌の枯渇ひずみ
飽和トランスポゾン変異39削除ずみ18,40を構築に失敗して両方示すA. 根頭がんしゅ病菌の CtrA、マスターの調整装置蛋白質が欠かせません。枯渇系統の顕微解析の値を示すためには、前述ctrA枯渇ひずみ18は顕微鏡による評価を実施しました。CtrA式ctrA枯渇細胞の成長を比較に使用した微速度顕微鏡観察図 4 aのは誘導 (上) と (下) 未誘導。CtrA の存在下で単一のセルは 14 h 内のコロニーに上昇を与えた。対照的に、CtrA がなくなると、細胞分離または分割に失敗しました。分割に失敗した細胞は、中間細胞から、細胞の極の丸めを含む総体の形態学的変化を出展しました。CtrA が細胞分裂の調節で重要な機能を持っていることが示唆されました。
図 4 b・ D、蛍光染料は誘導やctrA 10 h. 細胞の枯渇が付いた灘 2 分 (図 4 b) パルス後ctrA枯渇ひずみの特性評価に使用されていました。CtrA があった (上部パネル)、極ペプチドグリカン生合成が観察されました。対照的に、極で発生した大規模な灘のラベリングと大規模な中間細胞腫脹 CtrA が枯渇したときが発生しました。この観察は分割するセルの失敗にもかかわらず継続的なペプチドグリカン合成と一貫性のあります。CtrA枯渇ひずみ (図 4) DNA 分布を特徴付けるシアニン DNA 染色オレンジを使いました。CtrA 存在していた、DNA が均等に分布していた成長している細胞、核様体の偏析は後半 pre-divisional セルで明白だった。対照的に、CtrA がなくなると、DNA が均等に細胞の中。これらの観察は、CtrA が適切な DNA の複製または分離に貢献することをお勧めします。最後に、 ctrA枯渇細胞は 4-64 (図 4) で標識しました。CtrA の存在下で細胞膜は、成長棒は汚れを欠いていた特徴的な馬蹄形パターンが付いていた。1 つの極はない染まったもっと激しく細胞 CtrA の枯渇、4 64 全体の膜のラベルに登場。この観測では、CtrA がなくなると、脂質の創製組織を中断可能性がありますが、膜がそのまま残ることを示唆しています。
図 2: ターゲット特定の染料が付いた野生型癌腫細胞の代表的なイメージです。(A) 位相コントラストA. 根頭がんしゅ病菌の細胞の画像前と洗濯プロトコルときに、1 %dmso 処理後または冷たいエタノール固定後。(B) A. 根頭がんしゅ病菌の細胞の極成長が蛍光の d-アミノ酸酸肌, 灘, 多田とラベル表示されます。(C) A. 根頭がんしゅ病菌脂溶性 4 64 染色での染色。A. 根頭がんしゅ病菌細胞 DNA 特定染料オレンジおよび DAPI 染色 (D)。パネル B D、位相 (上) と (下) 落射蛍光画像が表示されます。セル アウトラインは、参考のため蛍光画像で提供されます。スケール バー = 2 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ライブA. 根頭がんしゅ病菌の DNA の DAPI とオレンジ ラベルの比較セル。A. 根頭がんしゅ病菌の DAPI ラベルし、オレンジ ラベルのラベルなしの野生型細胞の等しい比率混合、アガロース パッドの上で発見します。0 時に、最初の画像は、位相コントラスト、TRITC、および DAPI を使用して撮影された細胞を標識したかどうかを決定するフィルター。(A) 位相差顕微鏡によるイメージング DAPI ラベルし、オレンジ ラベルのラベルのセルの時間経過。(B) DAPI ラベルし、オレンジ ラベルのラベルのない細胞の位相顕微鏡落射蛍光顕微鏡 TRITC フィルターを使用してイメージのコマ撮り。(C) 位相顕微鏡および DAPI フィルターを用いた落射蛍光顕微鏡によるイメージング DAPI ラベルし、オレンジ ラベルのラベルのセルの時間経過。スケール バー = 2 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的な画像誘導と未誘導条件ctrA枯渇ひずみ。CtrA枯渇ひずみctrAがされた条件下での (A) 微速度顕微鏡観察による (上) (下) の枯渇か。各パネルの上の数字は、時間の時間を示します。(B) 位相コントラスト (左) と灘の付いたセルの落射蛍光 (右) 画像。(C) 位相コントラスト (左) と蛍光オレンジ色の付いたセルの像 (右)。(D) 位相コントラスト (左) と 4-64 の分類されるセルの蛍光 (右) 画像。セル アウトラインは、参考のため蛍光画像で提供されていました。スケール バー = 2 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルには、一連a. 根頭がんしゅ病菌野生型、変異体、および枯渇系統の調査のためのプロシージャにはが含まれています。それはすべてのプロトコル セクションに記載されている手順が成長媒体、温度、および成長率を考慮して追加の変更とその他の細菌の緊張のために容易に適応することができますは注目に値するです。
ターゲット固有の染料の使用は、細菌細胞の細胞周期イベントの詳細な評価を提供するための貴重なツールです。ここでは、蛍光 d アミノの酸を用いたペプチドグリカン挿入パターンが観察された脂質ドメインは 4-64 で視覚化した、ユーグレナグラシリス DAPI またはオレンジでラベル付けされました。各プロトコルは、洗浄のプロトコルの最適化と成長や形態、DMSO 処理が損なわれないことを確認後使用の他の細菌に合わせることができます。重要な考慮事項には、多重ラベリング研究を有効にするまたは自動蛍光を避けるために適切な fluorophore の選択、ラベルの混入のためのインキュベーション時間洗浄ステップのバッファーの選択が含まれます。たとえば、脂溶性の赤色蛍光膜汚れ (4-64) する代わりに、緑色蛍光膜染色 (1-43)。同様に、青・緑・赤蛍光 d アミノの酸が利用可能な6,38と双直交ハンドルと d-アミノ酸はクリック化学6,7を介して一般的な fluorophores に共役することができます。オレンジ蛍光シアニン DNA に加えて最後に、染料、DNA の蛍光シアニン色素利用可能ですとよく実行グリーン ライブ細菌細胞10。ターゲット固有の染料が付いたキーのセル構造の可視化は、細菌に必要なプロセスに力学的洞察を得るために蛍光タンパク質の観察と組み合わせることができます。
これらのプロトコルには、 A. 根頭がんしゅ病菌の枯渇汚れの顕微鏡観察のために必要な条件、それは他の細菌の蛋白質枯渇系統のこれらの手法を拡張することが可能にする必要がありますがあります。枯渇系統の特性はセル成長を停止または溶解する前に調査を完了する期間の制限があるので特に挑戦的なことができます。分類; 中に余分な染料のすべてのトレースを削除するセルを十分に洗浄することが重要です。ただし、いくつかの細胞の重要な蛋白質の枯渇は、洗浄ステップを重視するそれらを引き起こすことができる細胞表面の欠陥を持っています。細胞培養の開始量の増加洗浄手順の間に細胞の損失を補うことができます。細胞膜または細胞壁が侵害枯渇系統は、セル換散インデューサなし液体文化で育つときになりやすい可能性があります。細胞の形態を維持し、枯渇時のセル換散の制限、osmoprotectant ( A. 根頭がんしゅ病菌の 5% ショ糖作品) を含めることができます。経験的あらかじめ蛍光色素を染色する前に細胞を破壊する時間の適切な量を決定する必要があります。Permeablized 膜または細胞壁と細胞は、セル換散または枯渇時点で特に挑戦的なイメージングの後半を作る蛍光試薬を用いる非選択的ラベリングになりやすい可能性があります。
A. 根頭がんしゅ病菌(または他の細菌細胞) の微速度顕微鏡観察のための重要なステップは、アガロース パッドの準備です。アガロース パッドは微速度顕微鏡観察実験を通して良いフォーカスを確保するレベルにする必要があります。さらに、coverslip は完全に乾燥し、焦点面を変更するからアガロース パッドを防ぐために密封されなければなりません。A. 根頭がんしゅ病菌酸素が細胞の成長のために必要です。空気のポケットの近くの画像は長い微速度顕微鏡観察実験 (図 1) A. 根頭がんしゅ病菌の堅調な成長を得ることが必要です。細胞が成長またはほんの数時間後の成長を停止する場合は、大きな空気のポケットと空気のポケットに近いイメージでアガロース パッドを準備することをお勧めします。適切な空気のポケットもよく構築された agarose のパッドだけ ~ 24 h 最大A. 根頭がんしゅ病菌の生育をサポートできます。長い時間経過シーケンスが必要な場合の代替アプローチなどマイクロ フロー セルを考慮すべき。セルはイメージ投射の間ピントずれた場合、は、アガロース パッドが水平で、coverslip の下で正しく密封いるを確認します。近い完璧な agarose パッド、それはいくつかの細胞が、ピントが合ってドリフトが可能な複数のフィールドおよび頻繁に移すためイメージング高を推奨します注意してください。他の細菌 agarose パッドを準備する方法は細菌の成長要件に合わせて41,42,43を考慮されなければなりません。アガロース パッド、また時間経過が必要ない場合、ラベル付きまたは固定細胞のイメージング中に細胞を固定化に役立ちます。この場合、シール、coverslip は agarose パッドまで格納することができますを構築するための必要かつ代替アプローチ後適切な43があります。
全体的にみて、ターゲット固有の染料とタイムラプス顕微鏡の使用は、細菌で根本的なプロセスについての洞察を提供できます。ここでは、4-64 の脂溶性色素との分類と特徴的な極と中隔ラベリングA. 根頭がんしゅ病菌の蛍光 d アミノの酸との通常の蹄鉄パターンを示します。A. 根頭がんしゅ病菌のこれらのパターンの観測はこの菌の44の極地の成長と一致している、同様の研究が他の細菌のパターニング成長に関する情報を明らかにするかもしれない可能性が高い。発見野生型と変異株の細胞の成長の間に核様体の形態の入念な調査は、微速度顕微鏡観察研究10 (図 3)、オレンジなどシアニン色素が適しています。重要な蛋白質の枯渇時にターゲット固有の蛍光染料をイメージングは蛋白質の機能を決定するための重要な観測を提供できます。最後に、同時に複数のラベルを使用して研究はこれらの染料の多くは異なる分光特性を持つ利用可能なが、細胞周期の進行中に不可欠なプロセスの調整に洞察力を有効にする必要があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
図 2と図 4で FDAAs の贈り物ありがとうマイケル ・ VanNieuwenhze (インディアナ大学)。この原稿の準備の間のフィードバックのためのブラウンの実験室のメンバーに感謝いたします。A. 根頭がんしゅ病菌の細胞増殖と分裂にブラウンの実験室の研究は、国立科学財団 (IOS1557806) によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
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