Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Published: November 24, 2017 doi: 10.3791/56497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

Summary

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Abstract

Temel hücresel süreçleri DNA ikileşmesi ve segregasyon, protein sentezi, hücre duvarı sentezi ve hücre bölünmesi gibi bakteriyel hayatta kalmak için gerekli proteinlerin işlevi güveniyor. Bu işlemler probları daha iyi anlamak gibi bir dizi hedef özel boyalar kullanılabilir. Lipofilik boyalar ile boyama membran yapısı gözlenmesi, lipid microdomains görselleştirme ve membran blebs olarak algılanmasını sağlar. Floresan-d-amino asitler (FDAAs) peptidoglikan biyosentezi sitelerin soruşturma için kullanımı hücre duvarı Dipnotlar veya hücre büyüme desenlendirme potansiyel kusurları işaret ediyor olabilir. Son olarak, nükleik asit lekeleri DNA çoğaltma veya Kromozom segregasyon olası hataları işaret ediyor olabilir. Siyanür DNA hücre yaşayan etiket lekeleri ve hızlandırılmış mikroskobu çevrili Morfoloji gerçek zamanlı gözlemleri sırasında hücre büyümesini etkinleştirme için uygundur. Hücre etiketleme için protokol protein tükenmesi mutantlar membran yapısı, hücre duvarı Biyogenez ya da kromozom segregasyon tanımlamak için uygulanabilir. Ayrıca, hızlandırılmış mikroskobu gibi gerekli bir protein kaldırılır ve ek protein işlevi kazandırabileceğini morfolojik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir. Örneğin, hücre büyüme proteinler tükenmesi hücre daha kısa veya yuvarlak haline neden olabilir, ancak temel hücre bölünmesi proteinler tükenmesi filamentation veya dallanma, sonuçları. Burada, hücre büyümesi, hedef özel etiketleme ve hızlandırılmış mikroskobu protokollerde bakteriyel bitki patojeni Agrobacterium tumefacienssağlanır. Birlikte, hedef özel boyalar ve hızlandırılmış mikroskobu temel süreçleri karakterizasyonu etkinleştirmek A. tumefaciens. Son olarak, sağlanan iletişim kuralları diğer bakterilerde temel işlemleri soruşturma için kolayca değiştirilebilir.

Introduction

Bakteriyel hücre döngüsü boyunca ilerleme membran ve hücre duvarı sentezi, DNA ikileşmesi ve segregasyon ve hücre bölünmesi gibi birçok işlemi koordinasyon gerektirir. Tamamen bakteriyel hücre biyolojisi karmaşıklığını anlamak için bu temel olayları incelemek gereklidir; Başlıca bileşenleri bu yollar, mutagenized zaman hücre canlılığı tehlikeye beri Ancak, bu önemsiz bir görevdir. Hedef özel boyalar ile birleştiğinde Epifluorescence mikroskopi wildtype ve mutant bakteri suşları temel bu işlemlerde soruşturma için güçlü bir yaklaşımdır.

Peptidoglikan özel boyalar floresan antibiyotik (Vankomisin-FL, bocillin-FL) ve floresan d amino asitler (örneğin, 7-Hidroksikumarin-3-karboksilik asit-3-amino-d-alanin, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanin içerir , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanin; TADA). Gram-pozitif bakterilerde peptidoglikan biyosentezi sitelerin soruşturma için floresan antibiyotik analogları sublethal konsantrasyonları kullanımı peptidoglikan ekleme desenleri1,2ortaya çıkarmak için etkili bir strateji olmuştur, 3,4. Floresan Vankomisin etiketleme ekleme desenleri sabit Ayagin Gram-negatif bakteri5peptidoglikan anlayışlar kazanmak için kullanılmıştır, dış membran genellikle floresan kullanımını engelleyen bir geçirgenliği bariyer sağlar antibiyotik olarak bir sonda peptidoglikan canlı hücreleri içinde biyosentezi için. Buna ek olarak, floresan-d-amino asit veya biorthogonal fonksiyonel gruplar ile d-amino asitler ve kısa darbeleri kovalent bölgelerinde yaşayan bakteri hücreleri6,7geniş bir alanda son peptidoglikan ekleme etiketleyin. Sentetik d amino asitler ile gözlenen desenleri peptidoglikan ekleme punctate ve septal içerir (Escherichia coli ve Bacillus subtilis), kutup ve septal (Agrobacterium tumefaciens ve Listeria Monositogenez), septal tek (Staphylococcus aureus) ve apikal (Streptomyces venezuelae)6,7. Bu gözlemler bakteri hücre duvarı dipnotlar farklı desenler sergi ve sentetik d amino asitler olarak büyüme desenlendirme incelenmesi için sonda kullanımı birçok bakteri içinde değerli bir stratejidir gösterir.

Bakteriyel kromozomlar etiket boya dahil deoksiribonükleik asit (DNA) belirli küçük groove cilt (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) ve yüksek afinite siyanür boyalar (yeşil ve turuncu malzeme listesini görmek;). Canlı hücrelerin DAPI boyama bakteriyel canlılığı9belirtmek için kullanılır, ancak sabit hücrelerin DAPI boyama numaralandırma çevre örnekleri8, bakterilerin yardımcı olur. Buna ek olarak, Sigara-hücrelerin9numaralandırmak için membran impermeant "ölü" hücre lekeleri gibi turuncu ve yeşil sık açıklandığı gibi siyanür boyuyor. Bu reaktifler hücre büyümesi sırasında bakteriyel çevrili morfolojisi soruşturma için kullanıldığında, dikkat çekici, DAPI, turuncu ve yeşil tüm membran permeant ve canlı hücreleri10etiketleme kabil olmak gösterilmiştir. E. coli hücreleri canlı, DAPI DNA'sı boyama sitoplazma auto-floresan nedeniyle yaygın görünür ve ultraviyole (UV) ışık için hücre DAPI lekeli tekrarlanan Etkilenmeler perturbs çevrili yapısı10. Bu boya membran permeant olup uzun süreli Floresans bağlama üzerine canlı hücrelerdeki DNA hücre büyümesi, DNA ikileşmesi veya Kromozom ayrımı10 etkilemeden sağlar boyama E. coli ya da B. subtilis ile portakal ortaya çıkarır . Bu gözlemler siyanür DNA boyalar nucleoids Morfoloji çoğu bakterinin hücre büyüme sırasında izlemek için kullanılabilir öneririz.

Phospholipid-Specific stryl boya N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil gibi) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; bkz: malzeme listesi) Katyonik bileşiklerdir ve tercihen olumsuz ücret ilişkilendirmek fosfolipitler gibi cardiolipin ve phosphatidylglycerol11. 4-64 farklı bakteri membran etiketlemek için kullanıldığında farklı desenler gözlenir. Escherichia coli, 4-64 yan duvar boyunca bantlarında Polonyalılar zenginleştirilmiş ve bölünme siteler geç pre-divisional12hücreleri. Bacillus subtilisiçinde 4-64 etiketleme lipid spiraller13görselleştirme sağlar. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 dış membran etiketleri ve karakteristik "nal" desen büyüme Kutbu14,15etiketleme yoksun olduğu görülmektedir. Bu gözlemler Bu bakterilerin varlığı nedeniyle heterojen lipid dağıtımları için hücresel asimetri katkıda lipid etki alanlarının sergi gösteriyor. Diffüz etiketleme varlığını gibi 4-64 etiketleme şekillerindeki değişiklikleri, blebs veya veziküller, invaginations veya membran büzülme dağıtım veya lipidler biyosentezi etkisi mutantlar karakterize bilgilendirici olabilir.

Hücre boyama ötesinde, proteinlerin temel süreçlerine katılan işlevi belirlenmesi gereklidir. Gerekli genler silmek ve fenotipik sonuçları çalışma mümkün değildir çünkü temel proteinler karakterizasyonu teknik olarak zordur. Böylece, protein tüketen alternatif yaklaşımlar ortaya çıkmıştır. Örneğin, temel bir gen bir indüklenebilir organizatörü tercihan--dan onun yerel organizatörü kontrolü altında konabilir. İndüklenebilir rehberleri gibi küçük moleküllere duyarlı vardır; 16, izopropil β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinoz22, vanillate17,23çinko, ve ksiloz23, böylece hedef gen transkripsiyonu sona erer ve uyarıcı kaldırıldığında faiz protein tükenmiştir. Küçük molekül RNA etkileşimleri hedef genlerin transkripsiyon CRISPR girişim25,26 engellemek için kullanılan sentetik riboswitches24 ilgi temel protein tüketen Alternatif yaklaşımları içerir hedef genlerin ve tarafından ClpXP proteaz bozulmayı peptid Etiketler hedef proteinler için kullandığı indüklenebilir protein yıkımı27,28 blok transkripsiyon için. Hücrelerin canlılık kaybetmeden tükenmesi suşları karakterizasyonu için sadece kısa bir süre sağlarsanız, bu nedenle, hücrelerin mikroskobik görüntüleme protein tüketimi sırasında zamanla karakterizasyonu için güçlü bir yaklaşım. Nitekim, mikroskobu canlı bakteri hücre hücre şekil bakım, salgı ve Bölünebilme29mekanizmaları da dahil olmak üzere temel biyolojik süreçlerin anlayışlar kazanmak araştırmacılar sağladı.

A. tumefaciens bir bakteriyel bitki patojeni30 ve doğal genetik mühendisi31,32olduğunu. Böylece, mekanizmalar patojen için ilgili ana bilgisayar-patojen etkileşimleri33,34,35, salgı36ve ana bilgisayar dönüşüm30,31, gibi 37 kapsamlı bir şekilde araştırıldı. A. tumefaciens aracılı hastalığı önlemek ya da bitki dönüşüm geliştirmek stratejiler tasarlamak için A. tumefaciens hayatta kalmak için gerekli işlemleri daha iyi anlaşılması gerekir. Hedef özel boya kullanımı ve son gelişmeler A. tumefaciens18 için bir protein tükenmesi stratejinin temel süreçleri araştırmak için bir yol sağlar.

Burada, A. tumefaciens wildtype, mutant ve protein tükenmesi suşları mikroskobik analizi için detaylı protokoller sağlanır. İlk iki protokol, hücreleri hazırlamak ve onları hedef özel boyalar ile etiket açıklanmıştır. Üçüncü protokol için özel yastıkları (şekil 1) hazırlama ve bakteri hücreleri (Şekil 2, şekil 3, şekil 4) görüntüleme hakkında adım adım yönergeler sağlar. Bu protokoller de farklı ortam koşulları, büyüme oranları, oksijen gereksinimleri ve hücre yapıları için hesabınıza ek uyarlamalar ile diğer bakteriler için uygun olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. A. tumefaciens suşlarının büyüme

  1. A. tumefaciens suşları kültür
    1. Bir koloni istediğiniz baskı ile ATGN büyüme ortamının (tarifi için malzemeler listeye bakın) 1 mL aşılamak için steril bir tahta sopa ya da damlalıklı ipucu kullanın.
      Not: A. tumefaciens tükenmesi suşları için ATGN 1 mM IPTG temel protein biyosentezi korumak için bir uyarıcı içermelidir.
    2. A. tumefaciens suşları gecede ATGN 225 rpm'de sallayarak ile 28 ° C'de içinde büyümek.
    3. Hücreleri 600 optik yoğunluğunu ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm (OD600). Hücre kültürü bir OD600 seyreltik ~0.2 = ve OD600 kadar büyümeye devam = ~0.6 ulaşıldığında. Tükenmesi suşları için OD600 kadar uyarıcı ile büyümeye devam = ~0.6 ulaşıldığında.
    4. A. tumefaciens wildtype ve mutant suşları OD600 kullanın = ~0.6 hedef özel boyama ve/veya hızlandırılmış mikroskobu (bkz: Bölüm 2 ve 3.1). Tükenmesi suşları için uyarıcı (bakınız Bölüm 1.2.) yıkamak
  2. A. tumefaciens protein tükenmesi suşları karakterizasyonu için uyarıcı kaldırılması
    1. Üstel kültürünün 1 mL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde oda sıcaklığında masaüstü santrifüj için de.
    2. Yıkamak için süpernatant kaldırın ve uyarıcı olmadan taze medya Pelet resuspend ve hücreleri (1.2.1) açıklandığı gibi cips. Hücreleri toplam taze medya 3 kez yıkayın.
    3. Son Pelet taze medyada resuspend ve konsantre bir OD600 hücrelere hemen hedef özel boyalar (Bölüm 2 ve şekil 4B-D) veya hızlandırılmış mikroskobu (Bölüm 3.2 ve şekil 4A) ile boyama için ~0.8 = . Alternatif olarak, hücreleri istediğiniz süreyi için medya olmadan önce boyama ve hücreleri Imaging uyarıcı hücrelerde büyüyen tarafından önceden tüketmek.

2. hedef özel boyama A. tumefaciens hücre

  1. Floresan d-amino asit hücre duvarı etiketleme
    Not: FDAAs kolayca A. tumefaciens peptidoglikan dahil edilmiştir toksik olmayan floresan d amino asitleri vardır. Bu basit etiketleme yordamı büyüme canlı hücreleri6' desenlendirme sondalar. Dört FDAAs sentezi için kullanılabilir38iletişim kurallarıdır.
    1. Üstel kültürünün 500 µL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için de. Hücre Pelet taze medya 100 µL içinde resuspend.
    2. 5 FDAA için yıkanmış ve hücrelerin konsantre ve karanlıkta 2 min için kuluçkaya mm 5 µL ekleyin.
      Not: Sınırlamak FDAA ışığa maruz kalma. Kuluçka süresi zorlanma büyüme hızının bağlı olarak değişir. Genellikle, kuluçka kez katlama zaman%65-10 olmalıdır.
    3. Hücreleri tarafından Santrifüjü cips ve hücre topakları fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkayın.
    4. Pelet ~ 50 µL PBS içinde resuspend.
      Not: PBS resuspension için kullanılan birim Pelet boyutuna göre değişebilir.
    5. 0,8-1 uygulamak µL hücre bir özel defteri ve hemen epifluorescence mikroskobu (bkz: bölümler 3.1 ve 3.2) kullanarak görüntü için.
      1. Alternatif olarak, daha fazla etiket birleşme buz gibi % 70 etanol ile hücreleri düzelterek durdurmak. Hücre Pelet 1 mL buz gibi % 70 etanol resuspend ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya.
      2. Santrifüjü tarafından hücreleri toplamak ve daha sonra görüntüleme için PBS küçük bir hacim içinde resuspend. Hücre süspansiyonlar 4 ° C ve görüntü 48 saat içinde saklayın.
  2. DNA DAPI veya turuncu leke ile boyama
    Not: DNA gözlemlemek için yapısı, hücre DAPI ya da portakal (ölü hücre leke) ile etiketlenir. Her ne kadar klasik bir "ölü hücre leke" açıklanan, turuncu permeant, photostable ve canlı hücre DNA10Imaging etkinleştirme bakteri hücrelerinin büyümesini etkilemez. A. tumefaciens, turuncu etiketleme işleri canlı hücreler içinde iyi ve hızlandırılmış mikroskobu (şekil 3) için uygundur. Buna ek olarak, ultraviyole (UV) ışık pozlama görüntüleme DAPI lekeli hücreler için gerekli Fototoksik (şekil 3) ve böylece DAPI boyama için anlık görüntüleme veya sabit hücreleri boyama canlı hücreleri boyama için en uygun olan.
    1. DAPI hücreleri boyama
      1. Üstel kültürünün 1 mL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için de.
      2. İsteğe bağlı olarak, hücre boyama önce düzeltmek için hücre Pelet 1 mL % 70 buz gibi etanol resuspend. 10-15 dk. içinde 2.2.1.1 hücreler Santrifüjü tarafından açıklanan toplamak için buz üzerinde kuluçkaya.
      3. Hücre Pelet 1 mL 1 µL DAPI hisse senedi çözüm (1 mg/mL; bkz: Malzemeler tablo) içeren PBS resuspend. Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve 5 dakika içinde belgili tanımlık karanlık kuluçkaya.
      4. Hücreleri tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 min için de cips ve 1 mL aşırı DAPI kaldırmak için PBS resuspend. Hücreleri iki kez daha yıkama ve Pelet 50 µL PBS veya medya resuspend.
      5. 0,8-1 uygulamak µL hücre bir özel defteri ve hemen epifluorescence mikroskobu kullanarak görüntü için. 3.1 ve 3.2 bölümlerine bakın.
        Not: Bu protokol kromozom dynamics (şekil 3) gözlemlemek hızlandırılmış mikroskopi için en uygun değildir. Turuncu boyama (bakınız Bölüm 2.2.2) alternatif olarak kullanmayı düşünün.
    2. Turuncu canlı hücreleri boyama
    3. Üstel kültürünün 1 mL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için de. Hücre Pelet 1 mL 1 µL turuncu hisse senedi çözüm içeren PBS resuspend (malzeme listeye bakın). Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve karanlıkta 5 min için kuluçkaya.
    4. Hücreleri tarafından Santrifüjü cips ve 1 mL aşırı turuncu kaldırmak için PBS resuspend. Hücreleri iki kez daha yıkama ve Pelet 50 µL PBS resuspend.
    5. 0,8-1 uygulamak µL hücre bir özel defteri ve hemen epifluorescence mikroskobu kullanarak görüntü için. 3.1 ve 3.2 bölümlerine bakın.
      Not: Bu protokol de canlı hücreleri ile çalışır ve hızlandırılmış mikroskobu kromozom dynamics (şekil 3) gözlemlemek uygundur. Hemen görüntüye uygun değilse, hücreler buz gibi % 70 etanol (bakınız Bölüm 2.2.1.2) sabit olabilir.
  3. Membran etiketleme
    Not: Lipofilik styryl floresan boya 4-64 yaygın bakteriyel hücre membran gözlemlemek için kullanılmıştır. Birçok bakteri, aksine 4-64 A. tumefaciens hücreleri etiketli düzgün etiket değil, ama oldukça sık sergi "nal" desen14,15. Dikkat çekici, büyüme Kutbu yaklaşık leke yoksun ise eski pole yoğun bir şekilde etiketlenmiştir. Böylece, 4-64 hücre büyüme desen ve A. tumefaciensmembran yapısı görselleştirme sağlar.
    1. 8 µg/mL üssel faz hücre kültürü 1 ml nihai bir konsantrasyon FM 4-64 ekleyin ve 5 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
    2. 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için 7000 x g de Santrifüjü tarafından etiketli hücreleri cips ve hücre Pelet PBS 1 mL resuspend. Hücreleri aşırı boya kaldırmak için üç kez toplam yıkayın.
    3. PBS ve hemen görüntü için bir özel defteri yerinde küçük bir cilt hücrelerinde resuspend. (3.1 ve 3.2 bölümlerine bakın)
      Dikkat: Hücreleri hemen karakteristik etiketleme desen gözlemlemek için yansıması gerekir.

3. A. tumefaciens hücreleri görüntüleme

  1. Özel yüzey hazırlama
    Not: Resim 1 resim silsilesi (Masası'nda) ve şematik (Masası B) hızlandırılmış mikroskopi için hazırlanan bir tipik özel ped içerir. Özel yastıkları genellikle gerektiği gibi hazırlanır.
    1. 3.1.1. bir coverslip bir 22 x 22 mm laboratuvar kare film (malzeme listesini görmek) kenarlarda neşterden çalıştırarak bir rehber ve kesim olarak kullanın.
    2. ~ 2-5 bırakarak laboratuvar film Merkez dışında bir kare şeklinde bir kesik mm kenarlık için özel yastık bir conta olarak hizmet için. Merkezi kesme atmak.
    3. Bir amonyak ve alkol içermeyen temizleyici ile (bkz: malzeme listesi) temiz bir cam slayt (75 mm x 25 mm) üzerine film conta yeri ve film biraz cam ( şekil1a en iyi görüntü) üzerine erimiş kadar ısı. Laboratuvar film eritmek için 70 ° C ısı blok kümesine kenarına kullanın veya hafifçe bir ateşte eritin.
    4. Özel çözüm ~0.075 g özel karıştırarak hazırlayın (malzeme listesini görmek) küçük bir şişeye medyada 5 ml. Isı ile periyodik özel eriyene kadar karıştırın ve çözüm için dönen bir mikrodalga çözümde açıktır. Özel çözüm 55-70 ° C de tutabilir ve 48 saat içinde birden çok özel yastıkları inşaat için kullanabilirsiniz.
    5. 1.2-%1.5 özel conta ortasına içeren medya pipet.
      Not: Medya hacmi genellikle 50-60 µL olmakla birlikte conta boyutuna göre değişir. Soğuk bir slayt için medya çok hızlı bir şekilde kuvvetlendirmek özel neden olabilir eklemek, böylece slayt sıcak bir yüzey üzerinde tutulmalıdır. Bir ısı blok kenarına ayarlayın 70 ° C çalışır iyi. Su özel veya fosfat tamponlu tuz (PBS) gibi arabelleğe alınan özel çözümler içeren özel uygulamalar sürekli hücre büyümesini gerekli değildir için medya yerine kullanılabilir. Tükenmesi suşları görüntüleme için uyarıcı olabilir sunmak da yok medyada. Uyarıcı yokluğu-ecek açığa vurmak tükenmesi fenotip ise uyarıcı varlığı bir denetim olarak kullanılabilir.
    6. Bir coverslip özel olarak dağıtabilmenizi conta yerleştirin.
    7. Slayt bu buruşuk yüzeyinde özel defteri ve yüzeye uygulanan hücre süspansiyon havuzu da yol açar gibi ~ 2 dk. kaçının özel yastık •kızılötesi için kuvvetlendirmek için serin, düz bir yüzey üzerine yerleştirin.
    8. Dikkatle coverslip özel yastık kapalı kaydırın.
      Dikkat: Bu adımı acele etmeyelim. Özel yastık kolayca gözyaşı ve düzensiz özel yastık görüntüleme zorlaştırabilir.
    9. Ped yüzeyi kuru görünene kadar hava için özel defteri oda sıcaklığında 1-2 min için Kuru izin. Bir neşter kullanarak, özel hava boşluğuna (orta görüntü, şekil 1A); oluşturmak için a küçük soymak kaldırmak hava boşluğu genellikle ~ 2 x 7-10 mm ve A. tumefaciens hücreleri hava boşluğu (şekil 1 c) en iyi büyümeye eğilimindedir.
      Not: Sabit hücre veya büyüme nerede izlenmiyor koşullar altında görüntüleme için hava boşluğuna gerekli değildir.
    10. Nokta 0,8-1 µL özel defteri ve yeni bir coverslip ile kapak sayfasında bulunan bir hücreler. Yavaşça coverslip hücreleri özel ped yüzeyi boyunca dağıtmak için özel yastık tepesinden yerleştirin.
    11. Erimiş VALAP kullanarak coverslip kenarlarını kapatın (bkz: Malzemeler tablo için tarifi; Şekil 1A, alt resim). Tüm kenarları ve köşeleri coverslip mühür hücreleri görüntüleme sırasında sürüklenen götürecek özel ped kurutma neden olabilir. Not: Mühürleme coverslip sadece uzun vadeli zaman hata görüntüleme için gereklidir.

Figure 1
Şekil 1: özel yastık hazırlık. (A)görüntü özel yastık hazırlık protokolü sırasını. Resim 1 laboratuvar film conta ile bir slayttır. Resim 2, özel defteri ve hava boşluğu görüntülenir. Son olarak, Resim 3 tam özel yastık altında bir coverglass hücreleri ile gösterir ve VALAP ile mühürlenmiş. (B) A şematik bir özel ped hızlandırılmış mikroskopi için sağlanır. Anahtar şekil-in belgili tanımlık özel yastık şematik etiketlenir. (C) hava boşluğu A. tumefaciens büyüme özel yastıkları üzerinde terfi. Görüntüleri bir özel yastık üzerinde 20 saat boyunca yetiştirilen wildtype A. tumefaciens hücre gösterilir. Görüntüleri mevzilerine hava cebinden giderek uzak alındı. Görüntünün en yakın kenara uzaklığı hava boşluğu için yukarıdaki her görüntü gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Görüntüleme
    Not: Fark girişim kontrast, faz kontrast ve epifluorescence görüntüleme yapılır donanım tabanlı autofocusing, otomatik bir sahne, standart filtrelere, bir LED ışık kaynağı, 60 X yağı daldırma ile donatılmış bir ters mikroskobu ile Hedefler (1.4 NA) faz kontrast veya fark girişim kontrast (DIC) ve 1K elektron teksir makinesi şarj-birleştiğinde-cihaz (EMCCD) kamera. Mikroskop bir sıcaklık kontrollü odada yer almalıdır. Alternatif olarak, bir sahne daha sıcak veya odası tutarlı sıcaklık görüntüleme sırasında korumak için kullanılabilir.
    1. Epifluorescence mikroskobu
      Not: floresan görüntüleme için canlı hücre, resim satın alma sayısını sınırlamak ve pozlama süresi photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek için en iyi duruma getirmek için gerekli. Her boya görüntüleme için bu yeterli Floresans algılama sağlar ancak photobleaching veya fototoksisite yol değil bir en uygun çekim hızı bulmak için tavsiye edilir. Şekil 2-4' te, pozlama süreleri 200 MS tüm Floresans resimler için kullanılmıştır. Şekil 3' te gösterilen hızlandırılmış dizileri için her 10 min 3 h için görüntüleri elde.
      1. Daldırma yağ istenen hedefte yerleştirin ve ters Slayt Slayt tutucusuna sahne alanı üzerine yerleştirin. Odaklama topuzlar hücreleri odak haline getirmek için kullanın.
      2. Aşama (ya da DIC) Albümdeki ve istenen floresan filtre edinme.
        Not: Maksimal uyarma ve emisyon dalga boylarında Şekil 2, şekil 3ve şekil 4 kullanılan lekeler için aşağıdaki gibidir: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).
    2. Hızlandırılmış mikroskobu
      Not: bilgisayar kontrollü hızlandırılmış mikroskobu sırasında aşağıdaki özellikleri şunlardır: x, y ve z konum, panjurlar ve floresan filtreler. Bir donanım tabanlı otomatik odaklama sistemi odak zaman hata görüntüleme sırasında korumak için en iyi yöntemdir. Alternatif olarak, bir yazılım tabanlı otomatik odaklama döngü kullanılabilir.
      1. Daldırma yağ istenen hedefte yerleştirin ve ters Slayt Slayt tutucusuna sahne alanı üzerine yerleştirin. Odaklama topuzlar hücreleri odak haline getirmek için kullanın.
      2. İsteğe bağlı olarak: Elde birden fazla (x, y) pozisyonlar. Rastgele 10 alan hücre yakın özel yastıkları hava boşluğu seçin.
      3. Sistem saat sıra satın görüntü için faz veya DIC istenilen zaman aralığında.
        Not: şekil 4' te gösterilen hızlandırılmış sırası için 30 ms maruz her 10 min 14 h ile DIC görüntüleri elde. Floresans görüntüleme sırasında hızlandırılmış mikroskobu kullanırken, photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek için satın alma aralığı ve pozlama zamanını ayarlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hedef özgü wildtype etiketleme A. tumefaciens hücreleri
Bu hücre morfolojisi göstermek için yıkama adımları veya (hangi floresan boyalar sulandırmak için kullanılır) % 1 DMSO ile tedavi etkilenmez, hücreleri doğrudan kültür (şekil 2A, sol paneli), hücreler tarafından yıkadıktan sonra yansıma 1.2 (şekil 2A, sol panelde) veya % 1 DMSO 10 min için hücrelerle kuluçka ve hücreleri (şekil 2A, doğru kapı aynası) yıkama sonra tanımlandığı şekliyle Santrifüjü. Bu görüntüleri Morfoloji yıkama veya DMSO varlığı tarafından etkilenmez göstermektedir. Buna ek olarak, hücre büyümesini yıkama veya büyüme eğrisi analizi (veri gösterilmez) dayalı DMSO tedavisi etkilenmez. Buna ek olarak, A. tumefaciens buz gibi etanol ile sabitleme brüt değişiklikleri Morfoloji (şekil 2A, sağ paneli) neden olmaz.

Ardından, hedef özel boyalar hücre duvarı dipnotlar, membran etki ve DNA wildtype A. tumefaciens hücreleri içinde gözlemlemek için kullanılmıştır. Yeni peptidoglikan ekleme şekillerinin üç floresan-d-amino asit ile etiketleme takip gözlenmiştir: vardı (şekil 2Bpaneli yaptı,), NADA (şekil 2B, Merkezi paneli) ve TADA (şekil 2C, doğru kapı aynası). Tüm üç etiketleme deneylerde yeni peptidoglikan etiketleme büyüme Kutbu veya septum hücrelerin zenginleştirilmiş. Bu büyüme kalıpları sürekli olarak FDAA seçim diğer lekeleri veya fluorescently etiketli proteinler ifade hücreleri ile çift etiketleme etkinleştirmek için değiştirilebilir gösteren tüm üç FDAAs ile tespit edildi. Lipofilik boya 4-64 tercihen eski kutup bölgesi A. tumefaciens hücre karakteristik at nalı desen (şekil 2C) kaynaklanan Etiketler. Portakal (2D rakam, sol panelde) ve DAPI (2D rakam, doğru kapı aynası) etiket DNA içinde A. tumefaciens hücreleri canlı. Geç pre-divisional hücrelerde iki ayrı nucleoids turuncu boyama ile gözlenir, DNA etiketleme ile DAPI kapatıyor görünür ise (şekil 2B) Boyama deneylerin sonuçları ile tutarlı E. coli10dakika sonra gözlenen.

Hızlandırılmış mikroskobu boyaları DNA uygunluğu
DAPI ya da portakal çevrili Morfoloji hızlandırılmış görüntüleme sırasında hücre büyümesi için uygun olup olmadığını belirlemek için bir eşit oranda etiketsiz, DAPI etiketli, turuncu etiketli wildtype A. tumefaciens hücreleri karışık ve tespit Özel yastıkları. 0 zamanında faz kontrast, DAPI ve TRITC kullanarak ilk görüntüleri alındı her hücre etiketli belirlemek için filtreler. Hücre karışımları sonra üç farklı koşullar altında görüntüsü: (1) faz kontrast mikroskobu sadece, DAPI filtresini kullanarak TRITC filtre ve (3) faz kontrast ve epifluorescence mikroskobu kullanarak (2) faz kontrast ve epifluorescence mikroskobu. Görüntüleri 10 dakikada 3 saat elde. Tüm hücreleri de floresan leke faz kontrast mikroskobu turuncu veya DAPI boyama gösteren hücre büyümesini (şekil 3, üst panel) zarar yansıma kullanılan bağımsız olarak büyüdü. Tüm hücreleri de aşama mikroskobu ve TRITC filtre (şekil 3, Merkezi panel) kullanarak epifluorescence mikroskobu görüntüsü ne zaman büyüdü. Turuncu etiket photobleaching tabi olmakla beraber en az 2 h (200 MS 13 toplam Etkilenmeler), gözlenen bu boya kısa vadeli mikroskobu canlı hücre için uygunluğu gösteren. Etiketleme ne olursa olsun, tüm hücreleri durdurmak bir saat içinde büyüyen zaman faz mikroskobu ve DAPI filtre (şekil 3, alt paneli) kullanarak epifluorescence mikroskobu görüntüsü. Bu gözlem A. tumefaciens UV Işınlarına maruz kalma duyarlıdır ve görüntüleme için bir UV filtre gerektiren boyalar hızlandırılmış mikroskobu deneyler için kaçınılması gerektiğini gösterir gösterir.

Hızlandırılmış görüntüleme ve hedef özel etiketlerine göre bir A. tumefaciens tükenmesi zorlanma
Hem transposon mutagenesis39 doyurarak ve silme zorlanma18,40 oluşturmak başarısız ana regülatör protein, CtrA, A. tumefaciensiçinde gerekli olduğunu gösterir. Mikroskobik analizlerin yapıldığı tükenmesi suşlarının değerini göstermek için yukarıda açıklanan ctrA tükenmesi zorlanma18 mikroskobu tarafından karakterizasyonu için maruz bırakıldı. Şekil 4A, hızlandırılmış mikroskobu hangi ctrA ifade ctrA tükenmesi hücrelerinin büyümesini karşılaştırmak için kullanılan yapıldı (üst) indüklenen ve (alt) uninduced. CtrA varlığında, tek bir hücre 14 h içinde bir microcolony neden oldu. Buna ek olarak, CtrA boşaldığında, hücreleri ya lysed ya da bölmek başarısız oldu. Hücreleri bölmek için başarısız Orta hücre ve hücre kutuplarda yuvarlama dahil olmak üzere brüt morfolojik değişiklikleri sergiledi. Bu gözlemler CtrA hücre bölünmesi yönetmelikte önemli bir işlevi vardır öneririz.

Şekil 4B-Dfloresan boyalar sonra indüksiyon veya ctrA tükenmesi 10 h. hücreler için nabız NADA ile 2 dk (şekil 4B) etiketli ctrA tükenmesi zorlanma karakterize etmek için kullanılmıştır. Ne zaman CtrA mevcut (üst panel), kutup peptidoglikan biyosentezi görülmektedir. Buna ek olarak, geniş NADA etiketleme Polonyalılar oluştu ve CtrA boşaldığında büyük Orta hücre siskinlikler oluştu. Bu gözlem hücreleri bölmek için bir başarısızlık rağmen devam eden peptidoglikan sentezi ile tutarlıdır. Siyanür DNA boya turuncu ctrA tükenmesi zorlanma (şekil 4 c) DNA dağılımı nitelemek için kullanıldı. CtrA mevcuttu, büyüyen hücreleri DNA eşit dağılımı vardı ve nucleoids ayrılığı geç pre-divisional hücrede görünür; Buna ek olarak, DNA düzensiz CtrA boşaldığında, hücreler dağıtımı yapıldı. Bu gözlemler CtrA uygun DNA ikileşmesi ya da ayrımcılık yaptığı katkının öneririz. Son olarak, ctrA tükenmesi hücreleri ile 4-64 (şekil 4 d) etiketli. CtrA varlığında, hücre zarının büyüme Kutbu leke yoksun olduğu karakteristik at nalı desen ile etiketli oldu. Her ne kadar bir kutup daha yoğun lekeli CtrA tükenmiş hücrelerde, 4-64 tüm membran etiketlemek için ortaya çıktı. Bu gözlem CtrA boşaldığında lipid microdomain organizasyon kesilebilir rağmen membranlar korunacak öneriyor.

Figure 2
Resim 2: Wildtype Agrobacterium tumefaciens hücreleri hedef özel boyalar ile etiketli temsilcisi görüntülerini. (A)faz kontrast görüntüler A. tumefaciens hücre önce ve sonra % 1 DMSO ile tedavi ederken çamaşır Protokolü veya fiksasyon buz gibi etanol ile sonra. (B) A. tumefaciens hücrelerinin büyümesini kutup floresan d amino asitler ile vardı, NADA ve TADA etiketleme tarafından gösterilir. A. tumefaciens lipofilik 4-64 leke ile (C) Staining. (D) Staining A. tumefaciens hücre DNA'sı özel boyalar portakal ve DAPI ile. B-D panelleri için faz kontrast (üst) ve epifluorescence (alt) görüntü gösterilir. Hücre özetliyor Floresans Albümdeki başvuru için sağlanır. Ölçek çubuğu 2 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: canlı A. tumefaciens DNA'da DAPI ve turuncu etiketlerine göre karşılaştırma hücreleri. Etiketlenmemiş, DAPI etiketli ve turuncu etiketli wildtype A. tumefaciens hücrelerin eşit oranlarda karışık ve özel yastıkları gördüm. 0 zamanında faz kontrast, TRITC ve DAPI kullanarak ilk görüntüleri alındı hücreleri etiketli belirlemek için filtreler. (A)tarafından faz kontrast mikroskobu görüntüsü etiketsiz, DAPI etiketli ve turuncu etiketli hücre hızlandırılmış. (B) faz mikroskobu ve TRITC filtresini kullanarak epifluorescence mikroskobu görüntüsü etiketsiz, DAPI etiketli ve turuncu etiketli hücre hızlandırılmış. (C) faz mikroskobu ve DAPI filtresini kullanarak epifluorescence mikroskobu görüntüsü etiketsiz, DAPI etiketli ve turuncu etiketli hücre hızlandırılmış. Ölçek çubuğu 2 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: CtrA tükenmesi zorlanma indüklenen ve uninduced koşullarda temsilcisi görüntülerini. (A)hızlandırılmış mikroskobu ctrA tükenmesi baskı ctrA neredeydi koşullar altında (üst) indüklenen (alt) aküsü tükenmek üzereyken. Her panel Yukarıdaki sayıların saat zamanında gösterir. (B) faz kontrast (solda) ve epifluorescence (sağda) görüntüleri ile NADA etiketli hücre. (C) faz kontrast (solda) ve portakallı etiketli hücreleri floresan (sağda) görüntüler. (D) faz kontrast (solda) ve 4-64 ile etiketli hücreleri floresan (sağda) görüntüler. Hücre özetliyor Floresans Albümdeki başvuru için verilmiştir. Ölçek çubuğu 2 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol A. tumefaciens tükenmesi wildtype ve mutant suşları incelenmesi için işlemler bir dizi içerir. Bu protokol bölümünde listelenen tüm yordamları büyüme medya, sıcaklık ve büyüme oranları için hesabınıza ek değişiklikler ile diğer bakteri suşları için kolayca adapte edilebilir dikkati çekiyor.

Hedef özel boyalar bakteri hücreleri hücre döngüsü olayları detaylı karakterizasyonu sağlamak için değerli bir araç kullanmaktır. Burada, peptidoglikan ekleme desenleri floresan d amino asitler kullanarak gözlendi, lipid etki alanları 4-64 ile görüntülenir ve nucleoids DAPI ya da portakal ile etiketli. Her iletişim kurallarının yıkama protokolü en iyi duruma getirme ve DMSO tedavisi büyüme veya morfolojisi zarar değil sağlamak sonra diğer bakteri kullanmak için adapte edilebilir. Kritik noktalar yıkama adımları, kuluçka süreleri için etiket şirketleşme ve otomatik Floresans önlemek için veya multiplex etiketleme çalışmaları etkinleştirmek için uygun bir fluorophore seçim için bir tampon yelpazesi içerir. Örneğin, alternatif lipofilik kırmızı-floresan membran leke (4-64) yeşil-floresan membran leke (1-43) olduğunu. Benzer şekilde, mavi, yeşil ve kırmızı-floresan-d-amino asitleri mevcut6,38 vardır ve biorthogonal kolları ile d-amino asitler ile tıklama kimya6,7ortak fluorophores için Birleşik. Son olarak, turuncu-floresan siyanür DNA yanı sıra boya, floresan siyanür DNA boya mevcuttur ve iyi ile gerçekleştiren bir yeşil canlı bakteri hücreleri10. Görselleştirme anahtar hücre yapıları hedef özel boyalar ile etiketli bakteri temel süreçleri içine mekanik ilgili bilgi sahibi olmak floresan proteinlerin gözlem ile kombine edilebilir.

Bu iletişim kuralları A. tumefaciens tükenmesi lekeler mikroskobik gözlem için koşullar gerekli içerir ve protein tükenmesi suşları diğer Bakterilerde bu yaklaşımlar uzatmak mümkün olacaktır. Hücreleri büyüyen durdurmak veya koşullar önce araştırmalar tamamlamak için sınırlı bir zaman çerçevesi olarak tükenmesi suşları karakterizasyonu özellikle zor olabilir. Yeterli etiketleme sırasında aşırı boya bütün izlerini kaldırmak için hücreleri yıkamak çok önemlidir; Ancak, bazı hücreler gerekli proteinlerin tükenmiş adımları yıkamak için duyarlı olmalarını neden olabilir onların hücre yüzey kusurları var. Hücre kültürleri başlangıç hacmi artan hücrelerinin kaybı için yıkama adımları uyguladığınızda telafi etmek yardımcı olabilir. Hücre zarlarında veya hücre duvarları tehlikeye tükenmesi suşları uyarıcı olmadan sıvı kültüründe yetiştirilen lizis hücre eğilimli olabilir. Bir osmoprotectant ( A. tumefaciensiçin de % 5 Sükroz çalışır) eklenmesi hücre morfolojisi korumak ve hücre lizis tükenmesi sırasında sınırlamak için yardımcı olabilir. Ampirik olarak önceden hücreleri ile floresan boya boyama önce tüketmek için uygun süreyi belirlemek gereklidir. Permeablized membran veya hücre duvarları içeren hücreleri hücre lizis veya non-selektif flüoresan ayıraçlar geç tükenmesi zaman Puan özellikle zor Imaging yapma etiketleme eğilimli olabilir.

A. tumefaciens (veya diğer bakteri hücreleri) hızlandırılmış mikroskopi için önemli bir adım özel yastık hazırlıktır. Özel yastık düzeyi hızlandırılmış mikroskobu deneyler boyunca iyi odak sağlamak için olması gerekir. Buna ek olarak, coverslip tamamen özel yastık kurutma ve odak düzlemi değiştirmesini önlemek için kapalı olmalı. A. tumefaciensiçin oksijen hücre büyümesi için gereklidir. Hava boşluğuna yakın görüntüleme A. tumefaciens güçlü büyüme uzun zaman hata mikroskobu deneyler (şekil 1 c) sırasında almak gereklidir. Hücreleri büyümek ya da sadece bir kaç saat sonra büyüyen durdurmak için başarısız olursa, daha büyük bir hava boşluğu ve görüntü hava cepleri yakınındaki bir özel paneliyle hazırlamak için tavsiye edilir. Uygun bir hava boşluğu ile bile bir iyi yapılandırılmış özel yastık-ebilmek biricik çekmek A. tumefaciens büyüme ~ 24 h maksimum. Artık bu hızlandırılmış dizileri gerekliyse, havacilik veya akış hücre düşünülmelidir gibi alternatif yaklaşımlar. Hücreleri görüntüleme sırasında odak dışında kayması, özel yastık düzey ve coverslip altında düzgün kapalı olduğundan emin olun. Bile bir çevre mükemmel özel ile pad, bazı hücreler odak dışında sürüklenir mümkündür böylece birden çok alan ve sık refocusing Imaging tavsiye olduğunu unutmayın. Diğer bakteriler için özel yastıkları hazırlama alternatif yaklaşımlar41,42,43 en iyi bakteri büyüme gereksinimlerini karşılamak için düşünülmelidir. Özel yastıkları da hızlandırılmış gerekli olmadığı zaman etiketli veya sabit hücre görüntüleme sırasında hücreler immobilizing için yararlı olur. Bu durumda, coverslip sızdırmazlık kadar depolanan özel tablalar oluşturmak için gerekli ve alternatif yaklaşımlar değil uygun43daha sonra olabilir.

Genel olarak, hedef özel boyalar ve hızlandırılmış mikroskobu kullanılması bakterilerde temel işlemler hakkındaki bilgileri sağlayabilir. Burada, lipofilik 4-64 boya ile etiketleme ve karakteristik kutup septal A. tumefaciensfloresan d amino asitleri ile etiketleme ve her zamanki at nalı desen göstermektedir. A. tumefaciens bu desenleri gözlemleri bu bakteri44 kutup büyüme ile tutarlı ve benzer çalışmalar diğer bakterilerde biçimlenme büyüme hakkında bilgiler gösterebilir olasıdır. Bulgu siyanür boya turuncu gibi hızlandırılmış mikroskobu10 (şekil 3) çalışmalar için uygundur çevrili Morfoloji dikkatli çalışmaları sırasında hücre büyüme wildtype ve mutant suşları sağlayacaktır. Floresan hedef özel boyalar gerekli bir protein tüketimi sırasında Imaging proteinin işlevini belirlemek için önemli gözlemler sağlayabilir. Son olarak, bu boyalar çoğunu farklı spektral özellikleri ile mevcut olduğundan, aynı anda birden çok etiket kullanma çalışmaları temel süreçleri koordinasyon hücre döngüsü ilerleme sırasında anlayışlar etkinleştirmeniz gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Michael VanNieuwenhze (Indiana Üniversitesi) Resim 2 ve şekil 4kullanılan FDAAs hediye için teşekkür ediyoruz. Bu el yazması hazırlanması sırasında üye kahverengi laboratuarının geribildirim için teşekkür. A. tumefaciens hücre büyümesi ve bölünme kahverengi laboratuarında Araştırma Ulusal Bilim Vakfı (IOS1557806) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58 ATCC 33970 Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH Fisher BioReagents BP359
KH2PO4 Fisher Chemical P288
20X AT Salts Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4 Fisher Chemical A701
MgSO4•7H2O Fisher BioReagents BP213
CaCl2•2H2O Fisher BioReagents BP510
MnSO4•H2O Fisher Chemical M114
Glucose Fisher Chemical D16 Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar Fisher BioReagents BP1423 Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name Company Catalog Number Comments
Optional Media Additives
Kanamycin GoldBio K-120 Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG GoldBio I2481C5 Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides Fisherbrand 12-550D 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-541-B 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner Home Depot 203261385 Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose Invitrogen 16500-100 Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS Fisher BioReagents BP399500 10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm Bemis PM-999 Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter SAAQIN SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly Target Corp. 06-17644
Paraffin Wax Crafty Candles 263012
Name Company Catalog Number Comments
Target-specific dyes
DMSO Fisher BioReagents BP231-1 Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA) FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S11368 Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64 Invitrogen T3166 Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dry bath Sheldon Manufacturing, Inc. 52120-200
Metallic thermal beads Lab Armor 42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26 (2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496 (2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219 (2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137 (2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730 (2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488 (2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322 (2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519 (2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682 (2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363 (2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

Tags

Mikrobiyoloji sayı: 129 Agrobacterium zorunluluk hızlandırılmış mikroskobu özel yastıkları floresan d amino asitler DNA boyama membran boyama epifluorescence mikroskobu
Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Howell, M., Daniel, J. J., Brown, P. … More

Howell, M., Daniel, J. J., Brown, P. J. B. Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth. J. Vis. Exp. (129), e56497, doi:10.3791/56497 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter