Summary
Capire la funzione dei processi essenziali nei batteri è complesso. Microscopia a fluorescenza con target-specifici coloranti possa fornire spunti preziosi per progressione di crescita e ciclo cellulare delle cellule microbiche. Qui, Agrobacterium tumefaciens è usato come un batterio modello per evidenziare i metodi per l'imaging di cellule vive per la caratterizzazione dei processi essenziali.
Abstract
Processi cellulari di base come replicazione del DNA e segregazione, sintesi proteica, biosintesi della parete cellulare e divisione cellulare si affidano la funzione delle proteine che sono essenziali per la sopravvivenza batterica. Una serie di coloranti specifici per la destinazione può essere utilizzata come sonde per meglio comprendere questi processi. Colorazione con coloranti lipofilici permette l'osservazione della struttura della membrana, visualizzazione di microdomini lipidici e la rilevazione delle vescichette di membrana. Utilizzo di fluorescente-d-amminoacidi (FDAAs) per sondare i siti della biosintesi del peptidoglicano possa indicare potenziali difetti nella biogenesi della parete cellulare o il modello di crescita delle cellule. Infine, le macchie di acido nucleico possono indicare eventuali difetti nella segregazione del cromosoma o replica di DNA. Cianina DNA macchie etichetta cellule viventi e sono adatto per microscopia time-lapse consentendo osservazioni in tempo reale della morfologia nucleoide durante la crescita delle cellule. Protocolli per l'etichettatura di cella possono essere applicati ai mutanti di deplezione di proteine per identificare i difetti nella struttura della membrana, biogenesi della parete cellulare o segregazione del cromosoma. Inoltre, microscopia time-lapse può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti morfologici come una proteina essenziale viene rimosso e può fornire ulteriori approfondimenti in funzione della proteina. Ad esempio, l'esaurimento delle proteine essenziali divisione cellulare provoca filamentazione o diramazione, considerando che l'esaurimento delle proteine della crescita delle cellule può causare le cellule a diventare più brevi o più rotondo. Qui, protocolli per la crescita delle cellule, l'etichettatura specifica della destinazione e microscopia time-lapse sono forniti per l'agente patogeno batterico pianta Agrobacterium tumefaciens. Insieme, target-specifici coloranti e time-lapse microscopia consentono la caratterizzazione dei processi essenziali in a. tumefaciens. Infine, i protocolli forniti possono essere facilmente modificati per sondare i processi essenziali in altri batteri.
Introduction
Progressione attraverso il ciclo cellulare batterica richiede il coordinamento di molti processi tra cui biosintesi membrana e parete cellulare, replicazione del DNA e la segregazione e la divisione cellulare. Per comprendere appieno la complessità della biologia della cellula batterica, è necessario studiare questi eventi essenziali; Tuttavia, questo è un compito banale, poiché la vitalità cellulare è compromessa quando componenti chiave di queste vie sono mutagenizzati. Epifluorescenza accoppiato con coloranti specifici per la destinazione è un approccio potente per sondare questi processi essenziali in wildtype e ceppi batterici mutanti.
Peptidoglicano specifici coloranti sono fluorescenti antibiotici (vancomicina-FL, bocillin-FL) e fluorescenti-ammino acidi (ad esempio, 7-hydroxycoumarin-3-carbossilico acido 3-ammino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina , NADA; tetrametilrodamina-3-ammino-d-alanina; TADA). Nei batteri Gram-positivi, l'uso di concentrazioni subletali di antibiotici fluorescente analoghi ai siti della biosintesi del peptidoglicano della sonda è stato una strategia efficace per rivelare peptidoglicano inserimento modelli1,2, 3,4. Mentre etichettatura fluorescente vancomicina è stato utilizzato per acquisire conoscenze nel peptidoglicano modelli di inserimento nei batteri gram-negativi fisso5, la membrana esterna generalmente fornisce una barriera di permeabilità che impedisce l'utilizzo di fluorescente antibiotici come una sonda per la biosintesi del peptidoglicano in cellule vive. Al contrario, brevi impulsi di fluorescente-d-amminoacidi o d-amminoacidi con gruppi funzionali biortogonali etichetta covalentemente regioni di recente inserimento di peptidoglicano in una vasta gamma di vita cellule batteriche6,7. Modelli di inserimento di peptidoglicano che sono stati osservati con d-amminoacidi sintetici includono punctate e settale (Escherichia coli e Bacillus subtilis), polar e settale (Agrobacterium tumefaciens e Monocytogenes di Listeria), unico settale (Staphylococcus aureus) e apicale (Streptomyces venezuelae)6,7. Queste osservazioni indicano che i batteri presentano diversi modelli di biogenesi della parete cellulare e che l'uso degli acidi d-amminoacido sintetici come sonde per l'esame di patterning di crescita è una strategia importante in molti batteri.
Coloranti che etichettano cromosomi batterici comprendono il legante specifico solco minore di acido desossiribonucleico (DNA) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) e ad alta affinità cianina coloranti (verde e arancione; vedere elenco dei materiali). DAPI macchiatura delle celle fisse assiste nell'enumerazione dei batteri da campioni ambientali8, mentre DAPI macchiatura delle celle in tensione viene utilizzata per indicare la vitalità batterica9. Al contrario, la cianina coloranti come arancione e verde sono spesso descritti come cellule "morte" impermeant membrana le macchie per enumerare le cellule non vitali9. Notevolmente, quando questi reattivi sono utilizzati per sondare la morfologia del nucleoide batterico durante la crescita delle cellule, DAPI, arancione e verde erano tutti indicati per essere membrana permeante e capace di etichettatura cellule vive10. In e. coli cellule vive, DAPI macchiatura del DNA appare diffusa a causa di auto-fluorescenza dal citoplasma ed esposizioni ripetute delle cellule DAPI-macchiato ai raggi ultravioletti (UV) perturba il nucleoide struttura10. Colorazione e. coli o Bacillus subtilis con Orange rivela che questa tintura è membrana permeante e fornisce lunga durata fluorescenza legandosi al DNA in cellule vive senza influire sulla crescita cellulare, replicazione del DNA o segregazione del cromosoma10 . Queste osservazioni suggeriscono che cianina DNA coloranti possono essere utilizzati per monitorare la morfologia del nucleoids durante la crescita delle cellule in molti batteri.
Phospholipid-specific stryl coloranti quali N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibromuro di pyridinium (4-64; veda lista materiali) sono composti cationici e associare preferenzialmente con carica negativa fosfolipidi come la cardiolipina e fosfatidilglicerolo11. Modelli distinti sono osservate quando 4-64 è usato per etichettare la membrana di batteri diversi. In Escherichia coli, 4-64 si arricchisce nei poli, nelle bande lungo la parete laterale e nei siti di divisione di ritardo pre-divisional cellule12. In Bacillus subtilis, 4-64 etichettatura consente la visualizzazione di lipido spirali13. In Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etichette la membrana esterna e si osserva in un modello caratteristico "ferro di cavallo" in cui il Polo di crescita è privo di etichettatura14,15. Queste osservazioni indicano che questi batteri presentano distribuzioni eterogenee dei lipidi a causa della presenza di domini lipidici che contribuiscono alla asimmetria cellulare. Cambiamenti nei modelli di etichettatura 4-64 come la presenza di etichettatura diffusa, vescichette o vescicole, i invaginations o restringimento della membrana può essere informativo nella caratterizzazione dei mutanti che influenzano la distribuzione o la biosintesi dei lipidi.
Limita macchiatura delle celle, determinare la funzione delle proteine che partecipano a processi essenziali è necessario. La caratterizzazione delle proteine essenziali è tecnicamente impegnativa perché non è possibile eliminare geni essenziali e studiare le conseguenze fenotipiche. Così, sono emersi approcci alternativi che riducono la proteina. Ad esempio, un gene essenziale può essere messo sotto il controllo di un promotore inducibile anziché suo promotore nativo. Promotori inducibili sono sensibli a reagire a piccole molecole come; 16, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinosio22, Vanillato17,23, di zinco e xilosio23, così la trascrizione del gene target cessa e la proteina di interesse è esaurita quando l'induttore viene rimosso. Approcci alternativi per esaurire le proteine essenziali di interesse includono riboswitches sintetico24 che utilizzare interazioni di piccola molecola-RNA per ostacolare la trascrizione di geni bersaglio, CRISPR interferenza25,26 blocco la trascrizione di geni bersaglio e proteina viscoelastica degradazione27,28 , che utilizza i tag di peptide proteine bersaglio per degradazione dalla proteasi ClpXP. Ceppi di svuotamento forniscono solo un breve periodo per caratterizzazione prima le cellule perdono vitalità, di conseguenza, la formazione immagine microscopica delle cellule nel tempo durante lo svuotamento della proteina è un approccio potente per caratterizzazione. Infatti, microscopia di cellule batteriche viventi ha permesso ai ricercatori di acquisire conoscenze in processi biologici fondamentali, compresi i meccanismi di mantenimento di forma delle cellule, secrezione e compartimentalizzazione29.
A. tumefaciens è un impianto batterico patogeno30 e ingegnere genetico naturale31,32. Così, tra cui meccanismi correlati alla patogenicità, ospite-patogeno interazioni33,34,35, secrezione36e host trasformazione30,31, 37 sono stati studiati. Per progettare strategie che prevenire le malattie a. tumefaciens mediata o migliorare impianto trasformazione, è necessario comprendere meglio i processi essenziali per la sopravvivenza di a. tumefaciens . L'uso di coloranti specifici per la destinazione e il recente sviluppo di una strategia di svuotamento della proteina per a. tumefaciens18 fornisce un mezzo per indagare i processi essenziali.
Qui, protocolli dettagliati per l'analisi al microscopio dei ceppi di svuotamento wildtype, mutante e proteina di a. tumefaciens sono forniti. I primi due protocolli descrivono come preparare cellule ed etichettarli con coloranti specifici per la destinazione. Il terzo protocollo vengono fornite istruzioni dettagliate per la preparazione dell'agarosi pastiglie (Figura 1) e imaging le cellule batteriche (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Questi protocolli possono anche essere adatti per altri batteri con ulteriori adattamenti per tenere conto per media differenti condizioni, tassi di crescita, fabbisogno di ossigeno e strutture cellulari.
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Protocol
1. crescita di ceppi di a. tumefaciens
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Coltura a. tumefaciens ceppi
- Usare una punta in legno sterile di bastone o una pipetta per inoculare 1 mL di coltura ATGN (Vedi la lista dei materiali per la ricetta) con una singola Colonia del ceppo desiderato.
Nota: Per i ceppi di svuotamento di a. tumefaciens , il ATGN deve contenere 1 mM IPTG come induttore per mantenere la biosintesi della proteina essenziale. - Crescere i ceppi di a. tumefaciens pernottamento in ATGN a 28 ° C con agitazione a 225 giri/min.
- Misurare la densità ottica delle cellule a 600 nm (OD600) usando uno spettrofotometro. Diluire la coltura cellulare a un OD600 = ~0.2 e continuano a crescere fino al OD600 = ~0.6 è raggiunto. Per i ceppi di svuotamento, continuare a crescere con induttore fino OD600 = ~0.6 è raggiunto.
- Utilizzare ceppi wildtype e mutante di a. tumefaciens OD600 = ~0.6 per colorazione specifica della destinazione e/o microscopia time-lapse (vedere paragrafi 2 e 3.1). Per i ceppi di svuotamento, lavare l'induttore (Vedi punto 1.2.)
- Usare una punta in legno sterile di bastone o una pipetta per inoculare 1 mL di coltura ATGN (Vedi la lista dei materiali per la ricetta) con una singola Colonia del ceppo desiderato.
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Rimozione di induttore per la caratterizzazione dei ceppi di a. tumefaciens proteina svuotamento
- A pellet 1 mL di coltura esponenziale (OD600 = ~0.4-0.6) mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min in una desktop centrifuga a temperatura ambiente.
- Per lavare, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in media fresco senza induttore e appallottolare le celle come descritto sopra (1.2.1). Lavare le cellule un totale di 3 volte nei mezzi freschi.
- Risospendere il pellet finale nei mezzi freschi e concentrare le cellule a un OD600 = ~0.8 per immediata colorazione con coloranti specifici target (sezione 2 e Figura 4B-D) o microscopia time-lapse (sezione 3.2 e Figura 4A) . In alternativa, pre-vuotano le cellule per la quantità desiderata di tempo coltivando le cellule in media senza induttore prima della colorazione e imaging delle cellule.
2. specifica della destinazione macchiatura delle cellule di a. tumefaciens
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Parete delle cellule fluorescenti acido ammino etichettatura
Nota: FDAAs sono atossici fluorescenti d-amminoacidi che sono prontamente incorporati il peptidoglicano di a. tumefaciens . Questa semplice procedura d'etichettatura sonde crescita patterning in cellule vive6. Protocolli per la sintesi di quattro FDAAs sono disponibili38.- A pellet 500 µ l di cultura esponenziale (OD600 = ~0.4-0.6) mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min in una desktop centrifuga. Risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di mezzi freschi.
- Aggiungere 5 µ l di 5mm FDAA a lavato e concentrati di cellule e incubare per 2 min al buio.
Nota: Limitare l'esposizione FDAA alla luce. Il tempo di incubazione varia a seconda del tasso di crescita del ceppo. In genere, i tempi di incubazione dovrebbero essere 5-10% del tempo raddoppiantesi6. - Agglomerare le cellule mediante centrifugazione e lavare le palline delle cellule con tamponato fosfato salino (PBS) tre volte.
- Risospendere il pellet in ~ 50 µ l PBS.
Nota: Il volume di PBS utilizzato per risospensione può variare basato sul formato della pallina. - Applicare 0.8-1 µ l di cellule di un pad di agarosio e immagine utilizzando epifluorescenza immediatamente (vedere paragrafi 3.1 e 3.2).
- In alternativa, arrestare ulteriore incorporazione di etichetta riparando le cellule con etanolo al 70% ghiacciata. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di etanolo al 70% ghiacciata e incubare in ghiaccio per 15 minuti.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere in un piccolo volume di PBS per l'imaging in un secondo momento. Conservare le sospensioni delle cellule a 4 ° C e immagine entro 48 ore.
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DNA di colorazione con DAPI o macchia arancia
Nota: Per osservare il DNA struttura, le cellule sono etichettate con DAPI o Orange (macchia di cellule morte). Anche se classicamente descritto come una "macchia di morti-cell", Orange è permeante, fotostabile e non influenza la crescita delle cellule batteriche, attivazione del DNA di cellule vive10di imaging. In a. tumefaciens, arancia etichettatura funziona bene nelle cellule viventi ed è adatto per la microscopia time-lapse (Figura 3). Al contrario, ultravioletta (UV) esposizione alla luce necessaria per imaging DAPI-macchiato le cellule è fototossico (Figura 3) e quindi colorazione DAPI è più adatto per la colorazione di cellule vive per immediato di imaging o colorazione celle fisse.- DAPI macchiatura delle cellule
- A pellet 1 mL di coltura esponenziale (OD600 = ~0.4-0.6) mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min in una desktop centrifuga.
- Facoltativamente, per correggere le cellule prima della colorazione, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di etanolo al 70% ghiacciata. Incubare in ghiaccio per 10-15 min. raccogliere le cellule per centrifugazione come descritto in 2.2.1.1.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS contenente 1 µ l di soluzione madre di DAPI (1 mg/mL; Vedi Materiali tavolo). Mescolare delicatamente pipettando e incubare per 5 minuti al buio.
- Pellet di cellule mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min e risospendere in 1 mL di PBS per rimuovere l'eccesso DAPI. Lavare le cellule altre due volte e risospendere il pellet in 50 µ l PBS o supporti.
- Applicare 0.8-1 µ l di cellule di un pad di agarosio e immagine utilizzando epifluorescenza immediatamente. Vedere paragrafi 3.1 e 3.2.
Nota: Questo protocollo non è ottimo per microscopia time-lapse per osservare cromosoma dinamiche (Figura 3). Considerare l'utilizzo di colorazione arancione come alternativa (vedere paragrafo 2.2.2).
- Colorazione arancione di cellule vive
- A pellet 1 mL di coltura esponenziale (OD600 = ~0.4-0.6) mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min in una desktop centrifuga. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS contenente 1 µ l di soluzione madre arancione (vedere elenco dei materiali). Mescolare delicatamente pipettando e incubare per 5 minuti al buio.
- Pellet di cellule mediante centrifugazione e risospendere in 1 mL di PBS per rimuovere l'eccesso arancione. Lavare le cellule altre due volte e risospendere il pellet in 50 µ l PBS.
- Applicare 0.8-1 µ l di cellule di un pad di agarosio e immagine utilizzando epifluorescenza immediatamente. Vedere paragrafi 3.1 e 3.2.
Nota: Questo protocollo funziona bene con cellule vive ed è adatto per la microscopia time-lapse di osservare le dinamiche del cromosoma (Figura 3). Se non è conveniente per l'immagine immediatamente, le cellule possono essere fissate in etanolo al 70% ghiacciata (Vedi sezione 2.2.1.2).
- DAPI macchiatura delle cellule
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Etichettatura di membrana
Nota: Il colorante fluorescente lipofilico styryl 4-64 è stato usato estesamente per osservare la membrana delle cellule batteriche. A differenza di molti batteri, 4-64 etichettati a. tumefaciens cellule non etichettare in modo uniforme, ma piuttosto frequentemente esibiscono un "ferro di cavallo" modello14,15. Notevolmente, il Polo di crescita è quasi priva di macchia mentre il vecchio palo intensamente con l'etichetta. Così, 4-64 permette la visualizzazione della struttura di membrana in a. tumefaciense modelli di crescita delle cellule.- Aggiungere FM 4-64 a una concentrazione finale di 8 µ g/mL in 1 mL di coltura cellulare fase esponenziale e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti al buio.
- Pellet con etichettate cellule mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 minuti in una centrifuga di desktop e risospendere le cellule in 1 mL di PBS. Lavare le cellule un totale di tre volte per rimuovere il colorante in eccesso.
- Risospendere le cellule in un piccolo volume di PBS e spot su un pad di agarosio all'immagine immediatamente. (Vedere paragrafi 3.1 e 3.2)
Attenzione: Le cellule devono essere imaged immediatamente per osservare i modelli caratteristici di etichettatura.
3. imaging delle cellule di a. tumefaciens
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Preparazione del tampone di agarosio
Nota: Nella figura 1 contiene una sequenza di immagini (pannello A) e schema (pannello B) di un pad di agarosio tipici preparato per microscopia time-lapse. Pastiglie di agarosio sono tipicamente preparate secondo le necessità.- 3.1.1. usare un vetrino coprioggetti come una guida e tagliare un 22 x 22 mm quadrati di laboratorio film (Vedi elenco materiali) eseguendo un bisturi intorno ai bordi.
- Ritagliare un quadrato fuori dal centro del film laboratorio lasciando un ~ 2-5 bordo mm per servire come una guarnizione per il pad di agarosio. Scartare il ritaglio di centro.
- Posizionare la guarnizione di film su una lastra di vetro (75 x 25 mm) pulita con un detergente privo di alcool e ammoniaca (vedere elenco dei materiali) e scaldare fino a quando il film è leggermente sciolto sul vetro (immagine in alto in Figura 1A). Per sciogliere il parafilm, utilizzare il bordo di un set di blocco del calore a 70 ° C o fondere leggermente sopra una fiamma.
- Preparare la soluzione di agarosio mescolando ~0.075 g agarosio (Vedi elenco materiali) in 5 mL di media in una piccola boccetta. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde con periodiche vorticoso per mescolare fino a quando si scioglie l'agarosio e la soluzione è limpida. Tenere la soluzione di agarosio a 55-70 ° C ed utilizzare per la costruzione di più dell'agarosi pastiglie entro 48 ore.
- Pipetta supporti contenenti 1.2-1.5% di agarosio nel centro della guarnizione.
Nota: Il volume dei media è in genere 50-60 µ l ma varia in base alla dimensione della guarnizione. Aggiunta di media a una diapositiva fredda può causare l'agarosio a solidificare troppo in fretta, così la diapositiva dovrebbe essere tenuta su una superficie calda. Il bordo di un blocco di calore imposta a 70 ° C funziona bene. Acqua dell'agarosi o soluzioni di agarosio tamponato come tamponato fosfato salino (PBS) possono essere utilizzati invece di supporto contenente agarosio per applicazioni in cui la crescita continua delle cellule non è necessaria. Per l'imaging di ceppi di svuotamento, induttore possa essere presenti o assenti nei media. Presenza di induttore può essere utilizzato come controllo, considerando che l'assenza di induttore rivelerà il fenotipo di svuotamento. - Posizionare un vetrino coprioggetto sopra la guarnizione per distribuire uniformemente l'agarosio.
- Porre il vetrino su una superficie piana, cool per solidificare per ~ 2 min evitare sgualciscano del pad agarosio come questo si tradurrà in una superficie rugosa sul pad di agarosio e pool della sospensione delle cellule quando applicato sulla superficie.
- Far scorrere delicatamente il vetrino coprioggetto dal cuscinetto di agarosio.
Attenzione: Non correre questo passaggio. Il pad di agarosio può facilmente strappare e un pad di agarosio irregolare può rendere difficile la formazione immagine. - Consentire il pad di agarosio per aria secca per 1-2 min a temperatura ambiente fino a quando la superficie del pad sembra asciutta. Usando un bisturi, rimuovere una piccola striscia di agarosio per creare sacche d'aria (immagine centrale, Figura 1A); la sacca d'aria è in genere ~ 2 x 7-10 mm e a. tumefaciens cellule tendono a crescere meglio vicino la sacca d'aria (Figura 1).
Nota: Per l'imaging delle cellule fisse o nelle circostanze dove la crescita non è monitorata, sacca d'aria non è necessaria. - Luogo: 0.8-1 µ l di cellule su agarosio pad e coprire con un vetrino coprioggetto di nuovo. Posizionare delicatamente il vetrino coprioggetto sopra la parte superiore del riquadro dell'agarosi per distribuire le cellule su tutta la superficie del pad dell'agarosi.
- Sigillare i bordi del coprivetrino utilizzando VALAP fuso (Vedi Materiali tavolo per ricetta; Figura 1A, parte inferiore dell'immagine). Per sigillare lungo tutti i bordi e gli angoli del coprivetrino potrebbe causarti essiccazione del pad agarosio, che porterà alla deriva delle cellule durante la formazione immagine. Nota: Tenuta del coprivetrino è necessaria solo per l'imaging di time-lapse a lungo termine.
Figura 1: preparazione di agarosio pad. (A) sequenza del protocollo dell'agarosi pad preparazione della battuta. Immagine 1 è una diapositiva con la guarnizione di film di laboratorio. Nell'immagine 2, vengono visualizzati il pad di agarosio e la sacca d'aria. Infine, immagine 3 Mostra il pad di agarosio completa con le cellule sotto un coprioggetto e sigillato con VALAP. (B) un disegno schematico di un pad di agarosio per microscopia time-lapse è fornito. Caratteristiche principali del pad agarosio sono etichettate sullo schema. (C), la sacca d'aria promosso la crescita di a. tumefaciens su agarosio pastiglie. Immagini di wildtype a. tumefaciens cellule coltivate su un pad di agarosio per 20 ore sono indicate. Immagini sono state scattate alle posizioni sempre più distanti dalla sacca d'aria. La distanza tra il bordo più vicino dell'immagine la sacca d'aria è indicata sopra ogni immagine. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Di imaging
Nota: Contrasto differenziale di interferenza, contrasto di fase ed epifluorescenza imaging viene eseguita con un microscopio invertito dotato di messa a fuoco automatica basata su hardware, una fase automatizzata, filtri standard, una sorgente di luce LED, immersione in olio 60 X obiettivi (1,4 NA) per contrasto di fase o contrasto differenziale di interferenza (DIC) e una fotocamera di charge-coupled-device (EMCCD) elettrone-moltiplicando 1K. Il microscopio deve essere messo in una camera a temperatura controllata. In alternativa, una fase più calda o una camera può essere utilizzato per mantenere la temperatura costante durante la formazione immagine.- Epifluorescenza
Nota: Per l'imaging di fluorescenza di cellule vive, è necessario limitare il numero di acquisizioni di immagine e ottimizzare il tempo di esposizione per ridurre al minimo photobleaching e fototossicità. Per l'imaging di ogni colorante, si consiglia di trovare un tempo di esposizione ottimale che fornisce sufficiente rilevazione della fluorescenza, ma non porta a photobleaching o fototossicità. Figure 2-4, tempi di esposizione di 200 ms sono stati utilizzati per tutte le immagini di fluorescenza. Per le sequenze di time-lapse illustrate nella Figura 3, immagini sono state acquisite ogni 10 min per 3 h.- Mettere olio da immersione sull'obiettivo desiderato e porre il vetrino invertito nel porta-diapositive sul palco. Utilizzare le manopole di messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule.
- Acquisire immagini in fase (o DIC) e il filtro di fluorescenza desiderato.
Nota: La massima eccitazione e emissione lunghezze d'onda per le macchie utilizzate in Figura 2, Figura 3e Figura 4 sono come segue: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), arancione (547/570).
- Time-lapse microscopia
Nota: Durante la microscopia time-lapse le funzionalità seguenti sono controllati dal computer: x, y e z posizione, persiane e fluorescenza filtri. Un sistema basato su hardware auto-focus è ottimo per mantenere lo stato attivo durante la formazione immagine di time-lapse. In alternativa, può essere utilizzato un ciclo di messa a fuoco automatica basata su software.- Mettere olio da immersione sull'obiettivo desiderato e porre il vetrino invertito nel porta-diapositive sul palco. Utilizzare le manopole di messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule.
- Facoltativamente: Acquisire più (x, y) posizioni. Selezionare casualmente 10 campi delle cellule nella prossimità vicina alla sacca d'aria dei pattini dell'agarosi.
- Set-up l'acquisizione di sequenza tempo all'immagine in fase o DIC a intervallo di tempo desiderato.
Nota: Per la sequenza di time-lapse illustrata nella Figura 4, DIC immagini sono state acquisite con l'esposizione di 30 ms ogni 10 min per 14 h. Quando si utilizza l'imaging di fluorescenza durante la microscopia time-lapse, regolare il tempo di esposizione e intervallo di acquisizione per minimizzare photobleaching e fototossicità.
- Epifluorescenza
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Representative Results
Target-specifici di etichettatura di wildtype A. tumefaciens cellule
Per illustrare che la morfologia delle cellule non è influenzato dal trattamento con 1% DMSO (che viene utilizzato per diluire i coloranti fluorescenti) o fasi di lavaggio, le cellule erano imaged direttamente dalla cultura (Figura 2A, pannello di estrema sinistra), dopo aver lavato le cellule di centrifugazione, come descritto in 1.2 (Figura 2A, pannello di sinistra), o dopo incubando le cellule con 1% DMSO per 10 min e lavare le cellule (Figura 2A, pannello di destra). Queste immagini illustrano che la morfologia non è influenzato da lavaggio o la presenza di DMSO. Inoltre, la crescita delle cellule non è influenzata da lavaggio o trattamento di DMSO basato sull'analisi della curva di crescita (dati non mostrati). Inoltre, fissaggio a. tumefaciens con etanolo ghiacciata non causa cambiamenti lordi nella morfologia (Figura 2A, pannello di estrema destra).
Successivamente, coloranti specifici target venivano utilizzati per osservare la biogenesi della parete cellulare, domini di membrana ed il DNA all'interno delle cellule di a. tumefaciens wildtype. I modelli del nuovo inserimento di peptidoglicano sono stati osservati dopo etichettatura con tre fluorescenti-d-amminoacidi: HADA (Figura 2B, pannello sinistro), NADA (Figura 2B, pannello centrale) e TADA (Figura 2, pannello di destra). In tutti e tre gli esperimenti d'etichettatura, nuova etichettatura peptidoglicano è stato arricchito al Polo di crescita o setto delle cellule. Questi modelli di crescita sono stati osservati costantemente con tutti i tre FDAAs, che indica che la selezione FDAA può essere modificata per consentire la doppia etichettatura con altre macchie o cellule che esprimono le proteine fluorescente contrassegnati. La tintura lipofilica 4-64 etichette preferenzialmente il vecchio polo regione di a. tumefaciens cellule risultanti in un modello caratteristico a ferro di cavallo (Figura 2). Orange (Figura 2D, pannello di sinistra) sia DAPI (Figura 2D, pannello di destra) etichetta DNA all'interno di a. tumefaciens cellule vive. In cellule pre-divisional fine, due distinti nucleoids sono osservate con colorazione arancione, considerando che DNA etichettatura appare più diffusa con DAPI (Figura 2D) la macchiatura coerenti con i risultati di esperimenti osservata in e. coli10.
Idoneità del DNA coloranti per microscopia time-lapse
Al fine di determinare se DAPI o arancione sono adatti per l'imaging time-lapse della morfologia nucleoide durante la crescita delle cellule, una proporzione uguale di adenoide, DAPI-etichettato e wildtype con etichetta arancio a. tumefaciens cellule erano misti e macchiato su pastiglie di agarosio. Al tempo 0, prime immagini sono state scattate con contrasto di fase, DAPI e TRITC filtri per determinare se ogni cella è stato etichettato. Le miscele di cella quindi erano imaged in tre diverse condizioni: microscopia di contrasto di fase (1) solo, microscopia di contrasto ed epifluorescenza (2) fase utilizzando il TRITC filtro (3) fase di contrasto ed epifluorescenza microscopia e utilizzando il filtro DAPI. Le immagini sono state acquisite ogni 10 minuti per 3 ore. Tutte le cellule è cresciuto bene indipendentemente la macchia fluorescente utilizzata quando imaged con fase microscopia di contrasto che indica tale colorazione né Orange o DAPI alterare la crescita delle cellule (Figura 3, pannello superiore). Tutte le cellule si sono sviluppate anche bene quando ripreso da microscopia di fase ed epifluorescenza utilizzando il filtro TRITC (Figura 3, pannello centrale). L'etichetta arancione è soggetto a photobleaching ma può essere osservata per almeno 2 h (13 esposizioni totale di 200 ms), che indica l'idoneità di questo colorante per microscopia a breve termine di cellule vive. Indipendentemente dall'etichettatura, tutte le cellule smettono di crescere all'interno di un'ora quando ripreso da microscopia di fase ed epifluorescenza utilizzando il filtro DAPI (Figura 3, pannello inferiore). Questa osservazione dimostra che a. tumefaciens è sensibile all'esposizione UV e indica che i coloranti che richiedono un filtro UV per l'imaging dovrebbero essere evitati per esperimenti di microscopia time-lapse.
Time-lapse imaging e target-specifici di etichettatura di un A. tumefaciens ceppo di svuotamento
Sia saturando trasposone mutagenesi39 e non riuscendo a costruire un eliminazione ceppo18,40 indicano che la proteina regolatore matrice, CtrA, è essenziale in a. tumefaciens. Per dimostrare il valore dell'analisi microscopica dei ceppi di svuotamento, un precedentemente descritti ctrA svuotamento ceppo18 è stato sottoposto a caratterizzazione di microscopia. In Figura 4A, microscopia time-lapse è stata usata per confrontare la crescita delle cellule di svuotamento ctrA nel quale espressione di ctrA è stato indotto (in alto) e uninduced (in basso). In presenza di CtrA, una singola cella ha provocato un microcolony all'interno di 14 h. Al contrario, quando è stato impoverito CtrA, cellule lisate o non è riuscito a dividere. Cellule che non è riuscito a dividere hanno esibito i cambiamenti morfologici lordi compreso arrotondamento da Mid-cella e ai poli di cella. Queste osservazioni suggeriscono che CtrA ha una funzione importante nella regolazione della divisione cellulare.
In Figura 4B-D, coloranti fluorescenti sono stati usati per caratterizzare il ceppo di svuotamento ctrA dopo induzione o lo svuotamento di ctrA per h. 10 cellule erano impulso etichettato con NADA per 2 min (Figura 4B). Quando CtrA era presente (pannello superiore), biosintesi del peptidoglicano polar è stata osservata. Al contrario, vasto NADA etichettatura si è verificato nei poli e grande Mid-cellula gonfiore si è verificato quando è stato impoverito CtrA. Questa osservazione è coerenza con sintesi del peptidoglicano continuato nonostante un guasto delle cellule a dividersi. La tintura di cianina DNA arancio è stata utilizzata per caratterizzare la distribuzione di DNA nel ceppo di svuotamento ctrA (Figura 4). Quando CtrA era presente, crescita delle cellule ha avuto una distribuzione uniforme del DNA e segregazione di nucleoids era evidente in una cella di pre-divisional fine; al contrario, quando è stato impoverito CtrA, DNA è stato distribuito in modo non uniforme in tutto le cellule. Queste osservazioni suggeriscono che CtrA contribuisce alla corretta replicazione del DNA o la segregazione. Infine, le cellule di svuotamento ctrA sono state etichettate con 4-64 (Figura 4). In presenza di CtrA, la membrana cellulare è stata etichettata con un modello caratteristico a ferro di cavallo in cui il Polo di crescita era privo di mordente. In cellule impoverite di CtrA, 4-64 è apparso per etichettare la membrana intera, anche se un polo è stato macchiato più intensamente. Questa osservazione suggerisce che le membrane rimangono intatte anche se l'organizzazione di microdomain del lipido venga interrotto quando è esaurita CtrA.
Figura 2: Immagini rappresentative del wildtype Agrobacterium tumefaciens cellule identificate con coloranti specifici target. Immagini di a. tumefaciens cellule di contrasto di fase di (A) prima e dopo il protocollo di lavaggio, quando trattati con 1% DMSO o dopo la fissazione con etanolo ghiacciata. (B) polare crescita delle cellule di a. tumefaciens è mostrato dall'etichettatura con i fluorescenti d-amminoacidi HADA, NADA e TADA. (C) colorazione di a. tumefaciens con la macchia di lipofilico 4-64. (D) colorazione delle cellule di a. tumefaciens con le tinture di DNA specifico Orange e DAPI. Per pannelli B-D, contrasto di fase (in alto) epifluorescenza (in basso) sono mostrate le immagini. Contorni di cella sono forniti nelle immagini di fluorescenza per riferimento. Barra della scala = 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto di DAPI e Orange etichettatura del DNA in vivo a. tumefaciens cellule. Proporzioni uguali di wildtype adenoide, DAPI-denominata e Orange a. tumefaciens cellule erano misti e macchiate su agarosio pastiglie. Al tempo 0, prime immagini sono state scattate con contrasto di fase, TRITC e DAPI filtri per determinare se le cellule sono state etichettate. (A) time-lapse delle cellule senza etichetta, DAPI-denominata e Orange ripresa da microscopia di contrasto di fase. (B) time-lapse delle cellule senza etichetta, DAPI-denominata e Orange ripresa da microscopia di fase ed epifluorescenza utilizzando il filtro TRITC. (C) time-lapse delle cellule senza etichetta, DAPI-denominata e Orange ripresa da microscopia di fase ed epifluorescenza utilizzando il filtro DAPI. Barra della scala = 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative del ceppo ctrA svuotamento in condizioni indotte e uninduced. (A) microscopia time-lapse del ceppo ctrA svuotamento in condizioni dove ctrA era indotto (in alto) o impoverito (in basso). I numeri sopra ogni pannello indicano il tempo in ore. (B) fase di contrasto (a sinistra) e immagini (a destra) epifluorescenza delle cellule identificate con NADA. (C) fase di contrasto (a sinistra) e immagini (a destra) di fluorescenza delle cellule identificate con Orange. (D) fase di contrasto (a sinistra) e immagini (a destra) di fluorescenza delle cellule identificate con 4-64. Contorni delle cellule sono stati forniti in immagini di fluorescenza per riferimento. Barra della scala = 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo contiene una serie di procedure per l'indagine dei ceppi di a. tumefaciens wildtype, mutante e svuotamento. Vale la pena notare che tutte le procedure elencate nella sezione protocollo può essere facilmente adattate per altri ceppi batterici con ulteriori modifiche per tenere conto per crescita media, temperature e tassi di crescita.
L'uso di coloranti specifici per la destinazione è uno strumento prezioso per fornire una caratterizzazione dettagliata degli eventi del ciclo cellulare nelle cellule batteriche. Qui, peptidoglicano inserimento modelli sono stati osservati utilizzando fluorescenti-d-amminoacidi, domini lipidici sono stati visualizzati con 4-64, e nucleoids sono stati etichettati con DAPI o Orange. Ciascuno dei protocolli può essere adattato per l'uso in altri batteri dopo ottimizzando il protocollo di lavaggio e garantendo che il trattamento di DMSO non altera la crescita o la morfologia. Considerazioni chiave includono la selezione di un buffer per fasi di lavaggio, tempi di incubazione per l'incorporazione di etichetta e la selezione di un fluoroforo appropriato per evitare auto-fluorescenza o abilitare gli studi d'etichettatura multiplex. Ad esempio, un'alternativa alla macchia lipofilico membrana rosso fluorescente (4-64) è la macchia verde-fluorescente membrana (1-43). Allo stesso modo, blu, verde e rosso-fluorescente-d-amminoacidi sono disponibili6,38 e d-amminoacidi con biortogonali maniglie possono essere coniugati a fluorofori comune tramite clic chimica6,7. Infine, oltre la cianina arancione fluorescente DNA tintura, un verde fluorescente cianina DNA colorante è disponibile e si esibisce anche con live cellule batteriche10. Visualizzazione delle strutture cellulari chiave contrassegnati con le tinture mirate combinabile con l'osservazione di proteine fluorescenti per acquisire conoscenze meccanicistiche in processi essenziali nei batteri.
Questi protocolli includono le condizioni necessarie per l'osservazione al microscopio di macchie di svuotamento di a. tumefaciens e dovrebbe essere possibile estendere questi approcci ai ceppi di deplezione di proteine in altri batteri. La caratterizzazione dei ceppi di svuotamento può essere particolarmente impegnativa come c'è un periodo di tempo limitato per completare le indagini prima le cellule smettono di crescere o lisare. È fondamentale lavare adeguatamente le cellule per rimuovere tutte le tracce del colorante in eccesso durante l'etichettatura; Tuttavia, alcune cellule impoveriti di proteine essenziali hanno difetti nel loro superfici delle cellule che possono causare loro di essere sensibili a lavare i passaggi. Aumentando il volume iniziale di colture cellulari può aiutare a compensare la perdita di cellule durante le fasi di lavaggio. Ceppi di svuotamento che hanno compromesso le membrane cellulari o pareti cellulari possono essere soggette a lisi quando coltivato in coltura liquida senza induttore di cella. L'inclusione di un osmoprotectant (5% di saccarosio funziona bene per a. tumefaciens) può aiutare a mantenere la morfologia delle cellule e limitare la lisi cellulare durante lo svuotamento. È necessario determinare empiricamente la giusta quantità di tempo per pre-vuotare le cellule prima della colorazione con colorante fluorescente. Cellule con membrane permeablized o pareti cellulari possono essere soggette a cellule lisi o etichettatura non selettivo con reagenti fluorescenti fare imaging di ritardo svuotamento tempo punti particolarmente impegnativi.
Un passo fondamentale per microscopia time-lapse di a. tumefaciens (o altre cellule batteriche) è la preparazione del pad dell'agarosi. Il pad di agarosio deve essere livello per garantire buona messa a fuoco nel corso di esperimenti di microscopia time-lapse. Inoltre, il vetrino coprioggetto deve essere completamente sigillato per impedire il pad di agarosio dall'essiccazione e cambiando il piano focale. Per a. tumefaciens, ossigeno è necessaria per la crescita cellulare. Formazione immagine vicino a sacca d'aria è necessaria per ottenere la robusta crescita di a. tumefaciens durante gli esperimenti di microscopia lungo time-lapse (Figura 1). Se le cellule non riescono a crescere o smettere di crescere dopo solo poche ore, si consiglia di preparare un tampone di agarosio con una sacca d'aria più grandi e l'immagine vicino le sacche d'aria. Anche un pad di agarosio ben costruito con una sacca d'aria adeguata è in grado di supportare solo a. tumefaciens crescita per un massimo di ~ 24 h. Se più sequenze di time-lapse sono necessari, i metodi alternativi come cellule microfluidica o flusso dovrebbero essere considerate. Se le cellule deriva fuori fuoco durante la formazione immagine, assicurarsi che il pad dell'agarosi è livellato e convenientemente sigillati sotto il vetrino coprioggetti. Si noti che anche con un'agarosi perfetta vicino pad, è possibile che alcune cellule andrà alla deriva fuori fuoco, così di imaging più campi e rifocalizzazione frequenti sono altamente raccomandati. Per altri batteri, approcci alternativi di preparazione di pastiglie di agarosio dovrebbero essere considerati41,42,43 per meglio soddisfare le esigenze di crescita per il batterio. Pastiglie di agarosio sono anche utili per l'immobilizzazione di cellule durante l'imaging delle cellule con etichettate o fisse quando Time-lapse non è necessario. In questo caso, il vetrino coprioggetto di tenuta non è approcci alternativi e necessari per la costruzione dell'agarosi pastiglie che possono essere memorizzate fino a successiva può essere appropriato43.
Nel complesso, l'uso di coloranti specifici per la destinazione e microscopia time-lapse può fornire approfondimenti sui processi fondamentali nei batteri. Qui, vi illustriamo il modello usuale a ferro di cavallo di etichettatura con il colorante lipofilico 4-64 e la caratteristica polare e settale etichettatura con fluorescenti-d-amminoacidi in a. tumefaciens. Le osservazioni di questi modelli in a. tumefaciens sono coerenti con la crescita polare di questo batterio44 ed è probabile che simili studi possono rivelare informazioni sulla crescita patterning in altri batteri. La constatazione che la cianina coloranti come Orange sono adatti per microscopia time-lapse studia10 (Figura 3) consentirà attenti studi della morfologia nucleoide durante la crescita delle cellule in ceppi wildtype e mutante. Coloranti fluorescenti specifici per la destinazione di imaging durante lo svuotamento di una proteina essenziale può fornire osservazioni chiave per determinare la funzione della proteina. Infine, poiché molti di questi coloranti sono disponibili con differenti proprietà spettrali, gli studi che utilizzano contemporaneamente più etichette dovrebbero consentire il coordinamento dei processi essenziali durante la progressione del ciclo cellulare: intuizioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Michael VanNieuwenhze (Indiana University) per il dono della FDAAs utilizzato nella Figura 2 e Figura 4. Ringraziamo i membri del lab marrone per feedback durante la preparazione di questo manoscritto. Ricerca in laboratorio marrone sulla divisione e crescita delle cellule di a. tumefaciens è supportato dalla National Science Foundation (IOS1557806).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
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