Summary
Понимание функции основных процессов в бактерий является сложной задачей. Микроскопии флуоресцирования целевой объект специфического красителями может обеспечить понимание ключевых микробных клеток роста и клеточный цикл прогрессии. Здесь Agrobacterium tumefaciens используется как модель бактерии для выделения методы для живых клеток изображений для характеризации основных процессов.
Abstract
Основные клеточные процессы такие как репликации ДНК и сегрегации, синтез белков, биосинтез клеточной стенки и деление клеток полагаются на функции белков, которые имеют важное значение для выживания бактерий. Серия красители для конкретных целевых объектов может использоваться как зонды для лучшего понимания этих процессов. Окрашивание с помощью липофильных красителей позволяет наблюдение мембранные структуры, Визуализация microdomains липидов и обнаружение шелесту мембраны. Использование флуоресцентных d-аминокислоты (FDAAs) для проверки сайтов биосинтез мукопептида может указывать на потенциальные дефекты в клеточной стенки биогенеза или патронирования рост клеток. Наконец пятен нуклеиновой кислоты могут указать возможные дефекты в ДНК хромосомы или репликация сегрегации. Цианиновые ДНК пятна лейбл живых клеток и подходят для покадровой микроскопии позволяет в реальном времени наблюдения nucleoid морфологии во время роста клеток. Протоколы для маркировки клеток может применяться для истощения мутанты белка для выявления дефектов в структуре мембраны, клеточной стенки биогенеза или хромосома сегрегации. Кроме того покадровой микроскопии может использоваться для мониторинга морфологические изменения как необходимый белок удаляется и может обеспечить дополнительное понимание функции протеина. Например истощение важнейших деление клеток белков приводит к филаментацию или ветвления, тогда как истощение белков рост клеток может привести к клетки, чтобы стать короче или круглее. Здесь протоколы для роста клеток, целевой объект специфического маркировки и time-lapse микроскопии предусмотрены возбудителя бактериального завод Agrobacterium tumefaciens. Вместе, целевой объект специфического красители и time-lapse микроскопии дать характеристику основных процессов в A. tumefaciens. Наконец протоколы могут быть легко изменены для зонда важнейшие процессы в других бактерий.
Introduction
Прогрессии через бактериальный клеточный цикл требует координации многих процессов, включая мембраны и клеточной стенки биосинтез, репликации ДНК и сегрегации и деление клеток. Чтобы полностью понять сложность биологии бактериальной клетки, необходимым для изучения этих основных событий; Однако это нетривиальная задача, поскольку жизнеспособность клеток нарушается, когда mutagenized ключевых компонентов этих путей. В сочетании с целевыми красители микроскопия помощью эпифлуоресцентного представляет собой мощный подход к зонд эти основные процессы в wildtype и мутантных штаммов бактерий.
Мукопептида конкретных красители включают люминесцентные антибиотики (ванкомицин FL, bocillin-FL) и люминесцентные d-аминокислоты (например, 7-hydroxycoumarin-3-карбоновых кислот-3-амино d аланина, ХАДА; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d аланина , НАДА; тетраметилродамина-3-амино d аланина; ТАДА). В грам-положительных бактерий использование сублетальные концентрации флуоресцентные антибиотик аналогов зонда сайты биосинтез мукопептида была эффективная стратегия раскрыть мукопептида вставки шаблоны1,2, 3,4. Хотя флуоресцентные ванкомицин маркировки был использован для получения понимание мукопептида вставки шаблоны в5фиксированных грамотрицательных бактерий, внешней мембраны обычно обеспечивает проницаемость барьер, который предотвращает использование люминесцентные антибиотики, как зонд для биосинтез мукопептида в живых клетках. В отличие от коротких импульсов люминесцентные d-аминокислоты или d-аминокислоты с биортогональный функциональных групп ковалентно ярлык регионах недавние мукопептида вставки в широкий спектр живых бактериальных клеток6,7. Шаблоны мукопептида вставки, которые были отмечены с синтетическими d-аминокислоты включают пунктата и межжелудочковой перегородки (кишечная палочка и Сенная палочка), полярных и межжелудочковой перегородки (Agrobacterium tumefaciens и Листерий), только межжелудочковой перегородки (Staphylococcus aureus) и верхушечно (Streptomyces venezuelae)6,7. Эти наблюдения показывают, что бактерии проявляют разнообразных моделей биогенеза клеточной стенки, и что использование синтетических d-аминокислоты как зонды для изучения роста патронирования ценные стратегии многих бактерий.
Красители, которые ярлык бактериальной хромосомы включают связывателя конкретные мелкие канавки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) и высоким сродством цианиновые красители (зеленый и оранжевый; список материалов). DAPI пятнать фиксированных ячеек помогает в перечислении бактерий из8проб окружающей среды, тогда как DAPI пятнать живых клеток используется для обозначения бактериальных жизнеспособности9. В отличие от цианиновые красители, такие, как оранжевый и зеленый часто описывается как impermeant «мертвых» клеток мембрана пятна для перечисления нежизнеспособных клеток9. Замечательно когда эти реагенты используются для зонда морфология бактериальный nucleoid во время роста клеток, DAPI, оранжевый и зеленый были все показано мембраны permeant и способных маркировки живых клеток10. В клетках E. coli живут, DAPI окрашивание ДНК появляется диффузных благодаря auto флуоресценции от цитоплазмы и повторные воздействия ультрафиолетового (УФ) света DAPI-окрашенных клеток возмущает структуры nucleoid10. Окрашивание E. coli или B. subtilis с оранжевый показывает, что эта краска является мембрана permeant и обеспечивает длительное флуоресценции после привязки к ДНК в живых клетках без влияния на рост клеток, репликация ДНК или хромосомы сегрегации10 . Эти наблюдения предполагают, что цианиновые красители ДНК может использоваться для мониторинга морфология нуклеоидах во время роста клеток в многих бактерий.
Phospholipid-specific stryl красителей, таких как N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) фенил) hexatrienyl) пиридиния дибромид (4-64; см. перечень материалов) Катионный соединений и связывается преимущественно отрицательно заряженные фосфолипиды например cardiolipin и фосфатидилглицерина11. Различные шаблоны наблюдаются при 4-64 используется для обозначения мембраны различных бактерий. В Escherichia coli4-64 обогащается в полюсах, в группах вдоль боковых стен и в конце pre-divisional сайтов отдела12клеток. Сенная палочка4-64 маркировки позволяет визуализацию липидов спирали13. В Agrobacterium tumefaciens4-64 этикетки внешней мембраны и наблюдается в шаблоне характерный «подкова», в котором полюса роста является лишен Этикетировочный14,15. Эти наблюдения показывают, что эти бактерии проявляют распределения гетерогенных липидов вследствие наличия липидных доменов, которые способствуют сотовой асимметрии. Изменения в 4-64 маркировки шаблонов, таких как наличие диффузного маркировки, раковины или везикулы, кариолеммы или мембраны усадка может быть информативным в характеристике мутантов, которые влияют на распространение или биосинтеза липидов.
Помимо окрашивания клеток, определения функции белков, участвующих в основных процессах является необходимым. Характеристика основных белков технически сложным, потому что это не возможно удалить важно генов и изучить фенотипические последствия. Таким образом появились альтернативные подходы, которые разрушают белки. Например важно генов может поставить под контролем индуцибельной промоутер, вместо того, чтобы его родной промоутер. Индуцибельной промоутеров реагировать малых молекул, таких как; цинка16, изопропиловый β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG)17,18,19,20,21, Арабиноза22,23vanillate17,, Ксилоза23, таким образом перестает транскрипции гена целевой и протеина интереса истощается при удалении индуктором. Альтернативные подходы для разрушающих эфироносных протеинов интереса включают синтетические riboswitches24 , которые используют малые молекулы РНК взаимодействия мешают транскрипции генов-мишеней, ТРИФОСФАТЫ вмешательства25,26 для блока транскрипции генов-мишеней, и протеин индуцибильный деградации27,28 , который использует пептид теги для белков-мишеней для деградации ClpXP протеазы. Истощение штаммов обеспечивают лишь на короткое время для характеризации, прежде чем клетки теряют жизнеспособность, поэтому, микроскопических изображений с течением времени во время белковых истощения клеток мощный подход для определения характеристик. Действительно микроскопия живых бактериальных клеток позволило исследователям получить понимание основных биологических процессов, включая механизмы клеток форму обслуживания, секреции и дробления29.
A. tumefaciens — возбудитель бактериальной растений30 и естественный генетический инженер31,32. Таким образом, механизмы, связанные с патогенностью, включая хост возбудитель взаимодействия33,34,35, секрецию36и принимающих преобразования30,31, 37 широко исследованы. Для разработки стратегий, которые предотвращают A. tumefaciens опосредованной болезни или расширить завод преобразования, процессов, необходимых для выживания A. tumefaciens необходимо лучше понимать. Использование целевых красителей и последние разработки стратегии истощения белка для A. tumefaciens18 предоставляет средства для изучения основных процессов.
Здесь предоставляются подробные протоколы для микроскопического анализа wildtype, мутанты и белка истощения штаммов A. tumefaciens . Первые два протокола описывается, как подготовить клетки и маркировать их с целевыми красители. Третий протокол содержит пошаговые инструкции для подготовки агарозы прокладки (рис. 1) и визуализации бактериальной клетки (Рисунок 2, Рисунок 3, , рис. 4). Эти протоколы также могут быть пригодны для других бактерий с дополнительных приспособлений для учета различных средств массовой информации условия, темпы роста, кислороде и клеточных структур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. рост A. tumefaciens штаммов
-
Культивирования штаммов A. tumefaciens
- Используйте стерильные деревянные палки или пипетки подсказка для инокуляции 1 мл с одной колонии штамма желаемого ATGN роста средств массовой информации (см. перечень материалов для рецепта).
Примечание: A. tumefaciens истощения штаммов, ATGN должен содержать 1 мм ИПТГ как индуктор для поддержания биосинтеза необходимый белок. - Растут в A. tumefaciens штаммов на ночь в ATGN на 28 ° C с встряхивания на 225 об/мин.
- Измерение оптической плотности клетки на 600 Нм (600OD) с помощью спектрофотометра. Разбавить клеточной культуры ОД600 = ~0.2 и продолжать расти до600 OD = ~0.6 достигается. Для истощения штаммов, продолжают расти с индуктором до600 OD = ~0.6 достигается.
- Используйте wildtype и мутантных штаммов A. tumefaciens ОД600 = ~0.6 для целевой объект специфического окрашивания или промежуток времени микроскопии (см. разделы 2 и 3.1). Для истощения штаммов промывают индуктором (см. раздел 1.2).
- Используйте стерильные деревянные палки или пипетки подсказка для инокуляции 1 мл с одной колонии штамма желаемого ATGN роста средств массовой информации (см. перечень материалов для рецепта).
-
Удаление индуктор для характеризации A. tumefaciens белка истощения штаммов
- Пелле 1 мл экспоненциального культуры (OD600 = ~0.4-0.6) центрифугированием в 7000 x g 5 мин в центрифугу Обои при комнатной температуре.
- Помыть, удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в свежих СМИ без индуктор и Пелле клетки, как описано выше (1.2.1). Вымойте клетки в общей сложности 3 раза в свежих СМИ.
- Ресуспензируйте окончательный Пелле в свежих СМИ и сконцентрировать клетки к ОД600 = ~0.8 для немедленного пятнать с целевых конкретных красители (раздел 2 и на рисунке 4В-D) или замедленной микроскопии (раздел 3.2 и рис. 4A) . Кроме того, предварительно разрушающим клетки для желаемого количества времени путем выращивания клеток в СМИ без индуктором до окраски и обработки изображений клеток.
2. Целевой объект специфического окрашивания клеток A. tumefaciens
-
Флуоресцентный d амино кислоты клеточной стенки маркировки
Примечание: FDAAs, нетоксичные флуоресцентные d-аминокислоты которые легко включены в мукопептида A. tumefaciens . Эта простая маркировка процедура зонды роста кучность в живые клетки6. Протоколы для синтеза четыре FDAAs являются доступны38.- Пелле 500 мкл экспоненциального культуры (OD600 = ~0.4-0.6) центрифугированием в 7000 x g 5 мин в центрифугу обои. Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл свежих средств массовой информации.
- 5 мкл 5 мм FDAA для промывают и сосредоточены клетки и инкубировать в течение 2 минут в темноте.
Примечание: Ограничение FDAA воздействия света. Время инкубации будет варьироваться в зависимости от темпов роста штамма. Как правило время инкубации должно быть 5-10% удвоения время6. - Пелле клетки центрифугированием и мыть ячейки окатышей с-фосфатный буфер (PBS) три раза.
- Ресуспензируйте Пелле в ~ 50 мкл PBS.
Примечание: Объем PBS для ресуспендирования может различаться в зависимости от размера гранул. - Применить 0,8-1 мкл клеток агарозы pad и изображения с помощью эпифлуоресцентного сразу (см. разделы 3.1 и 3.2).
- Кроме того остановите дальнейшее включение метки, фиксируя клетки с ледяной 70% этиловом спирте. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл ледяной 70% этанола и Инкубируйте 15 минут на льду.
- Собрать клетки центрифугированием и Ресуспензируйте в небольшом объеме PBS для изображений в более позднее время. Хранить клеточных суспензий на 4 ° C и изображения в течение 48 часов.
-
ДНК, окрашивание с DAPI или оранжевые пятна
Примечание: Соблюдать ДНК структуры, клетки помечены DAPI или оранжевый (мертвые клетки пятно). Хотя классически описал как «мертвых клеток пятно», оранжевый permeant, фотостабилен и не влияет на рост клеток бактерий, позволяя жить клеточной ДНК изображений10. В A. tumefaciensоранжевый маркировки работает также в живых клетках и подходит для покадровой микроскопии (рис. 3). В отличие от ультрафиолетового (УФ) света воздействия необходимые для визуализации DAPI-окрашенных клеток имеет фототоксических (рис. 3) и таким образом DAPI окрашивания лучше всего подходит для окрашивания живой клетки для немедленной обработки изображений или окрашивание фиксированные клетки.- DAPI окрашивания клеток
- Пелле 1 мл экспоненциального культуры (OD600 = ~0.4-0.6) центрифугированием в 7000 x g 5 мин в центрифугу обои.
- При необходимости исправить клетки до окрашивания, Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл ледяной этанол 70%. Инкубируйте на льду на 10-15 минут собрать клетки центрифугированием, как описано в 2.2.1.1.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS, содержащие 1 мкл DAPI Стоковый раствор (1 мг/мл; см. Таблицу материалов). Осторожно перемешать, закупорить и инкубировать в течение 5 минут в темноте.
- Пелле клетки центрифугированием в 7000 x g 5 мин и Ресуспензируйте в 1 мл PBS для удаления избыточных DAPI. Вымыть клетки еще два раза и Ресуспензируйте Пелле в средствах массовой информации или 50 мкл PBS.
- Применить 0,8-1 мкл клеток агарозы pad и изображения с помощью эпифлуоресцентного немедленно. Смотрите в разделах 3.1 и 3.2.
Примечание: Этот протокол не является оптимальным для покадровой микроскопии соблюдать хромосома динамика (рис. 3). Рассмотрите возможность использования оранжевой окраски как альтернатива (см. раздел 2.2.2).
- Оранжевой окраски живых клеток
- Пелле 1 мл экспоненциального культуры (OD600 = ~0.4-0.6) центрифугированием в 7000 x g 5 мин в центрифугу обои. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS, содержащие 1 мкл оранжевый раствор (см. список материалов). Осторожно перемешать, закупорить и инкубировать в течение 5 мин в темноте.
- Пелле клетки центрифугированием и Ресуспензируйте в 1 мл PBS для удаления избыточных оранжевый. Вымыть клетки еще два раза и Ресуспензируйте гранулы в 50 мкл PBS.
- Применить 0,8-1 мкл клеток агарозы pad и изображения с помощью эпифлуоресцентного немедленно. Смотрите в разделах 3.1 и 3.2.
Примечание: Этот протокол работает хорошо с живой клетки и подходит для покадровой микроскопии соблюдать хромосома динамика (рис. 3). Если это не удобно для изображения немедленно, клетки может быть исправлена в ледяной 70% этанола (см. раздел 2.2.1.2).
- DAPI окрашивания клеток
-
Мембрана маркировки
Примечание: Липофильных стириловых Люминесцентную краску 4-64 широко используется для наблюдения за мембраны клеток бактерий. В отличие от многих бактерий 4-64 помечены A. tumefaciens клетки метки не равномерно, но довольно часто exhibit шаблон14,«подкова»15. Удивительно полюса роста является почти лишена пятен, в то время как старый полюс обозначен интенсивно. Таким образом 4-64 позволяет визуализацию шаблонов роста клеток и мембранные структуры в A. tumefaciens.- Добавить FM 4-64 в конечной концентрации 8 мкг/мл в 1 мл экспоненциальная фаза клеточной культуры и инкубации при комнатной температуре на 5 минут в темноте.
- Пелле помечены клетки центрифугированием в 7000 x g 5 минут в центрифугу обои и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл ФСБ. Вымойте клетки в общей сложности три раза, чтобы удалить излишки красителя.
- Ресуспензируйте клетки в небольшом объеме PBS и пятно на площадку агарозы для изображения немедленно. (См. в разделах 3.1 и 3.2)
Предупреждение: Клетки должны быть imaged немедленно соблюдать характерными узорами маркировки.
3. imaging A. tumefaciens клеток
-
Подготовка площадки агарозы
Примечание: На рисунке 1 содержит последовательность изображений (Группа А) и схема (Группа B) типичный агарозы колодки, подготовленных для покадровой микроскопии. Агарозы колодки обычно готовы при необходимости.- 3.1.1. Использование coverslip как гид и вырезать 22 x 22 мм квадратный лаборатории фильм (см. перечень материалов), запустив скальпелем по краям.
- Вырезать квадрат из центра в фильме лаборатории, оставляя ~ 2-5 мм границы в качестве прокладок для pad агарозы. Отказаться от центра выреза.
- Поместите прокладку фильм на стеклянное скольжение (75 мм x 25 мм), протирать аммиака и чистого спирта (см. перечень материалов) и тепла до тех пор, пока фильм подтаявший на стекло (верхнее изображение на рисунке 1A). Таять Лаборатория фильм, использовать край набор блок тепла до 70 ° C или слегка расплава на огне.
- Подготовка агарозы решение путем смешивания ~0.075 g агарозы (см. перечень материалов) в 5 мл СМИ в небольшой флакон. Тепла раствор в микроволновую печь с периодической закрученного смесь до полного растворения агарозы и решение ясно. Держите агарозы решение на 55-70 ° C и использовать для строительства нескольких агарозы прокладки в течение 48 часов.
- Пипетка СМИ, содержащих 1,2-1,5% агарозы в центр прокладки.
Примечание: Объем средств массовой информации обычно составляет 50-60 мкл но будет зависеть от размера прокладок. Добавление средств массовой информации, в холодные слайд может вызвать агарозы закрепить слишком быстро, таким образом слайд должен храниться на теплой поверхности. Края блока тепла равным 70 ° C работает хорошо. Агарозы воды или буферизованное агарозы решения, такие как-фосфатный буфер (PBS) может использоваться вместо того, чтобы средства массовой информации, содержащие агарозы для приложений, в которых не требуется продолжение клеточный рост. Для визуализации истощения штаммов, индуктор можно представить или отсутствует в средствах массовой информации. Присутствие индуктор может использоваться как элемент управления, в то время как отсутствие индуктором покажет истощения фенотип. - Место coverslip через прокладку, чтобы равномерно распределить агарозы.
- Поместите слайд на прохладном, ровную поверхность для закрепления для ~ 2 мин во избежание Пересушивание агарозы колодки, как это приведет к морщинистой поверхности на площадку агарозы и объединение суспензию клеток при применении к поверхности.
- Осторожно сдвиньте coverslip покинуть площадку агарозы.
Предупреждение: Не спешите этот шаг. Агарозы pad может легко порваться и площадку неравномерным агарозы может затруднить изображений. - Разрешить агарозы pad в воздух сухой для 1-2 мин при комнатной температуре до поверхности панели появляется сухой. С помощью скальпеля, удалите небольшую полоску агарозы для создания воздушного кармана (средняя изображение, Рисунок 1A); воздушный карман обычно ~ 2 x 7-10 мм и A. tumefaciens клетки, как правило, растут лучшие вблизи воздушный карман (Рисунок 1 c).
Примечание: Для изображений фиксированных ячеек или в условиях, где рост не контролируется, воздушный карман не является необходимым. - Пятно 0,8-1 мкл клеток на агарозы панель и крышка с новой coverslip. Осторожно поместите coverslip над верхней частью агарозы pad распространить ячейки по всей поверхности панели агарозы.
- Уплотнение края с помощью расплавленного VALAP coverslip (см. Таблицу материалы для рецепта; Рисунок 1A, нижнее изображение). Нарушение герметизации вдоль все края и углы coverslip может вызвать сушки агарозы pad, который приведет к дрейфующих клеток во время визуализации. Примечание: Герметизация coverslip необходима только для долгосрочной покадровой изображений.
Рисунок 1: подготовка площадки агарозы. (A) изображение последовательности подготовки протокола агарозы площадку. Изображение 1 — это слайд с уплотнением фильм лаборатории. В изображении 2 визуализируются агарозы pad и воздушный карман. Наконец изображение 3 показывает полный агарозы pad с клетки под coverglass и опечатаны с VALAP. (B) схема площадку агарозы для покадровой микроскопии предоставляется. Ключевые особенности агарозы pad помечены на схеме. (C) воздушный карман способствовало росту A. tumefaciens на агарозы колодки. Показываются изображения wildtype A. tumefaciens клеток, выращиваемых на площадку агарозы для 20 часов. Изображения были взяты на позициях более далекие от воздушного кармана. Расстояние от ближайшего края изображения в карман воздуха показано выше каждого изображения. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
-
Обработка изображений
Примечание: Контраст дифференциальной помехи, Фазовый контраст и эпифлуоресцентного изображений производится с инвертированным микроскопом оснащены аппаратные автофокусировки, автоматизированный этап, стандартные фильтры, светодиодный источник света, 60 X нефти погружения цели (1,4 НС) для фазового контраста или дифференциальной помехи контраст (ОПК) и 1K электрон умножения заряд сочетании устройство (EMCCD) камеры. Микроскоп должны находиться в комнате с регулируемой температурой. Кроме того этап с подогревом или палата может использоваться для поддержания постоянной температуры во время визуализации.- Микроскопия помощью эпифлуоресцентного
Примечание: Для флуоресценции изображений живых клеток, необходимо ограничить количество изображений приобретений и оптимизировать время экспозиции, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание и Фототоксичность. Для отображения каждой краски, рекомендуется найти время оптимальной экспозиции, которая обеспечивает достаточную флуоресценции обнаружения, но не приводит к Фотообесцвечивание или Фототоксичность. В 2-4 цифрывыдержек из 200 мс были использованы для всех изображений флуоресценции. Для покадровой последовательности, показанный на рисунке 3изображения были приобретены каждые 10 мин за 3 ч.- Место погружения нефти на желаемой цели и место Перевернутый слайд слайд держатель на сцене. Используйте ручки фокусировки для приведения клетки в фокус.
- Приобрести изображений в фазе (или ДВС) и желаемый флуоресценции фильтр.
Примечание: Максимальная возбуждения и выбросах волн для пятна, используемых на рисунке 2, рис. 3и рис. 4 заключаются в следующем: ХАДА (405/460), Нада (450/555), Тада (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), оранжевый (547/570).
- Покадровой микроскопия
Примечание: Во время промежуток времени микроскопии следующие функции являются контролируется компьютером: x, y и z положение, ставни и флуоресценции фильтры. Аппаратные авто фокус системы является оптимальным для поддержания внимания во время промежуток времени визуализации. В качестве альтернативы может использоваться петлю автоматический пистолет фокус на основе программного обеспечения.- Место погружения нефти на желаемой цели и место Перевернутый слайд слайд держатель на сцене. Используйте ручки фокусировки для приведения клетки в фокус.
- Дополнительно: Приобрести несколько (x, y) позиции. Случайным образом выберите 10 поля клеток в непосредственной близости от воздушный карман агарозы колодки.
- Установка времени приобретения последовательности изображения в фазе или ДВС на желаемый временной интервал.
Примечание: Для покадровой последовательности, показанный на рисунке 4, DIC изображения были приобретены с воздействием каждые 10 мин для 14 h 30 мс. При использовании флуоресценции изображений во время промежуток времени микроскопии, Отрегулируйте время интервала и воздействия приобретение для сведения к минимуму Фотообесцвечивание и Фототоксичность.
- Микроскопия помощью эпифлуоресцентного
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Целевой объект специфического маркировки wildtype A. tumefaciens клетки
Для того чтобы проиллюстрировать что морфологии клеток не влияет мыть шаги или лечение с 1% ДМСО, (который используется для разбавления флуоресцентных красителей), клетки были образы непосредственно от культуры (рис. 2A, далеко левой панели), после мытья клетки Центрифугирование, как описано в 1.2 (рис. 2A, левой панели), или после инкубации клеток с 1% ДМСО 10 мин и мойки клетки (рис. 2A, правая панель). Эти изображения показывают, что стиральная или присутствии ДМСО не затронуты морфологии. Кроме того рост клеток не затронуты Стиральная или ДМСО лечения на основе анализа кривой роста (данные не показаны). Кроме того исправление A. tumefaciens с ледяной этанола не вызывают грубые изменения в морфологии (рис. 2A, правой панели).
Далее целевых конкретных красители использовались для наблюдать биогенеза клеточной стенки, мембраны доменов и ДНК в клетках wildtype A. tumefaciens . Образцы новых мукопептида вставки наблюдались после маркировки с тремя люминесцентные d-аминокислоты: ХАДА (Рисунок 2B, левая панель), Нада (Рисунок 2Б, центр Группа) и Тада (рис. 2 c, правая панель). В всех трех маркировки эксперименты новые мукопептида маркировки обогатилась на полюса роста или перегородки клеток. Эти модели роста наблюдались последовательно с все три FDAAs, указывающий, что выбор FDAA может быть изменен для включения двойной маркировки с другими пятна или клетки, выражая дневно обозначенные протеины. Липофильные краситель 4-64 преференциально этикетки старый Полюс региона A. tumefaciens клеток, что приводит к характерным подкова шаблон (рис. 2 c). Оранжевый (Рисунок 2D, левой панели) и DAPI (Рисунок 2D, правая панель) метка ДНК внутри живут A. tumefaciens клетки. В конце pre-divisional клеток два отдельных нуклеоидах наблюдаются с оранжевой окраски, тогда как ДНК маркировки появляется более диффузный с DAPI окрашивание (Рисунок 2D) в соответствии с результатами экспериментов наблюдается в E. coli10.
Пригодность ДНК красителей для покадровой микроскопии
Для того, чтобы определить, если DAPI или оранжевый подходят для покадровой изображений во время роста клеток nucleoid морфологии, равной пропорции неподписанных, DAPI-меченых, оранжевый меченых wildtype A. tumefaciens клетки смешанные и были запятнаны на агарозы колодки. В момент времени 0, первоначального изображения были взяты с помощью Фазовый контраст, DAPI и TRITC фильтры, чтобы определить, если было названо каждой ячейки. Клетки смеси были затем отражаться в трех различных условиях: (1) Фазово-контрастная микроскопия только, (2) этап контраст и эпифлуоресцентного микроскопии с помощью TRITC фильтр и (3) этап контраст и эпифлуоресцентного микроскопии с помощью фильтра DAPI. Изображения были приобретены каждые 10 минут на 3 часа. Все клетки выросли хорошо независимо от флуоресцентные пятна, используется, когда образы с фазой контрастной микроскопии, указывающее, что ни оранжевый или DAPI пятнать ослабить рост клеток (рис. 3, верхней панели). Все клетки также росли хорошо когда imaged фазы микроскопии и с помощью TRITC фильтра (рис. 3, центр Группа) микроскопия помощью эпифлуоресцентного. Оранжевая метка подлежит Фотообесцвечивание, но можно наблюдать по крайней мере 2 h (13 общего воздействия 200 мс), указывающее пригодность этой краситель для краткосрочных микроскопии живых клеток. Независимо от маркировки, все клетки перестают расти в течение часа когда imaged фазы микроскопии и используя DAPI фильтра (рис. 3, Нижняя панель) микроскопия помощью эпифлуоресцентного. Это наблюдение показывает, что A. tumefaciens чувствителен к УФ-облучения и указывает, что следует избегать красители, требующих УФ-фильтр для обработки изображений для покадровой микроскопии экспериментов.
Промежуток времени обработки изображений и целевой маркировки A. tumefaciens истощения штамм
Насыщая transposon мутагенеза39 и неспособность построить удаления штамма18,40 указывают, что главный регулятор белка, CtrA, имеет важное значение в A. tumefaciens. Чтобы продемонстрировать значение микроскопического анализа штаммов, истощение, ранее описанные ctrA истощения штамма18 был подвергнут характеристика микроскопии. В рисунке 4A, покадровой микроскопии был использован для сравнения рост клеток ctrA истощения в котором ctrA выражение был индуцированной (вверху) и uninduced (внизу). Присутствии CtrA одну ячейку породило microcolony в течение 14 часов. В отличие от этого когда CtrA был исчерпан, клетки лизированы или удалось разделить. Клетки, которые не смогли разделить выставлены грубые морфологические изменения, включая округления из середине ячейки и на полюсах клетки. Эти наблюдения предполагают, что CtrA имеет важную роль в регуляции клеточного деления.
В рисунке 4В-Dфлуоресцентных красителей были использованы для характеризовать ctrA истощения штамм после индукции или истощение ctrA для 10 h. клетки были помечены Нада на 2 мин (рис. 4B) пульс. Когда CtrA присутствовал (Верхняя панель), было отмечено, биосинтез мукопептида Полярный. В противоположность этому обширные Нада маркировки произошла в поляков и крупных отеках середине ячейки произошла, когда CtrA был исчерпан. Этот вывод согласуется с синтез мукопептида продолжение несмотря на неспособность деления клеток. Цианиновые ДНК краска оранжевый был использован для характеристики распределения ДНК в ctrA истощения штамм (рис. 4 c). Когда CtrA присутствовал, клетки имеют равномерное распределение ДНК и сегрегации нуклеоидах проявилась в конце pre-divisional ячейку; в противоположность этому когда CtrA был исчерпан, ДНК был неравномерно по всей клетки. Эти наблюдения предполагают, что CtrA способствует надлежащей репликации ДНК или сегрегации. Наконец ctrA истощения клетки были помечены 4-64 (рис. 4 d). Присутствии CtrA с характерным подкова шаблон, в котором полюса роста был лишен пятно было названо клеточной мембраны. В клетках обедненного CtrA 4-64 появился на этикетке весь мембраны, хотя один полюс более интенсивно окрашенные. Это наблюдение предполагает, что мембраны остаются неизменными, хотя Организация microdomain липидов может нарушаться при истощении CtrA.
Рисунок 2: Представитель изображений wildtype Agrobacterium tumefaciens клеток помечены целевых конкретных красителей. (A) фаза контраст изображения A. tumefaciens клеток до и после стирки протокол, когда лечение с 1% ДМСО или после фиксации с ледяной этанола. (B) полярных рост клеток A. tumefaciens показана маркировка с флуоресцентные d-аминокислоты ХАДА, Нада и тада. (C) окрашивания A. tumefaciens с пятно липофильных 4-64. (D) окрашивания клеток A. tumefaciens с ДНК конкретных красители оранжевый и DAPI. Для панелей B-D Фазовый контраст (вверху) и эпифлюоресцентной (внизу) изображения отображаются. Контуры клеток предоставляются в изображениях флуоресценции для справки. Шкалы бар = 2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сравнение DAPI и оранжевый маркировки ДНК в прямом A. tumefaciens клетки. Равных пропорциях неподписанных, DAPI-меченых и оранжевый меченых wildtype A. tumefaciens клеток были смешанные и заметили на агарозы колодки. В момент времени 0, первоначального изображения были взяты с помощью Фазовый контраст, TRITC и DAPI фильтры, чтобы определить, если клетки были помечены. (A) промежуток времени неподписанных, DAPI-меченых и оранжевый меченых клеток, отображаемого при фазово-контрастной микроскопии. (B) промежуток времени без метки, DAPI-меченых и оранжевый меченых клеток, отображаемого этапа микроскопии и с помощью фильтра TRITC микроскопия помощью эпифлуоресцентного. (C) промежуток времени без метки, DAPI-меченых и оранжевый меченых клеток, отображаемого этапа микроскопии и с помощью фильтра DAPI микроскопия помощью эпифлуоресцентного. Шкалы бар = 2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представитель изображения штамма ctrA истощения в условиях искусственного и uninduced. Промежуток времени микроскопии (A) штамма ctrA истощения в условиях, где был ctrA индуцированной (вверху) или истощены (внизу). Числа над каждой панели показывают время в часах. (B) этап контраст (слева) и эпифлуоресцентного (справа) изображения клеток, помечены Нада. (C) фаза контраст (слева) и (справа) изображения флуоресценции клеток, помечены оранжевым. (D) фаза контраст (слева) и (справа) изображения флуоресценции клеток с 4-64. Контуры клеток были предоставлены в флуоресценции изображения для справки. Шкалы бар = 2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол содержит ряд процедур для расследования случаев A. tumefaciens wildtype, мутант и истощение штаммов. Стоит отметить, что все процедуры, перечисленные в разделе Протокол может быть легко адаптирована для других бактериальных штаммов с дополнительными изменениями для учета роста СМИ, температуры и темпы роста.
Использование целевых красителей является ценным инструментом для обеспечения подробную характеристику клеточного цикла событий в бактериальных клетках. Здесь мукопептида вставки шаблоны были замечены с использованием флуоресцентных d-аминокислоты, липидных доменов были визуализированы с 4-64, и нуклеоидах были помечены DAPI или оранжевый. Каждый из протоколов может быть адаптирована для использования в других бактерий после оптимизации протокола мыть и обеспечение того, что лечение ДМСО не ограничивает рост или морфологии. Ключевые соображения включают выделение буфера для мытья шаги, инкубации раз для включения метки и выбор соответствующей Флюорофор избежание auto флуоресценции или возможность мультиплексного исследования маркировки. Например альтернативой липофильные флуоресцентные красный мембраны пятно (4-64) является зеленый люминесцентной мембраны пятно (1-43). Аналогичным образом синий, зеленый и красно флуоресцентный d-аминокислоты являются доступны6,38 , и d-аминокислоты с биортогональный ручками можно конъюгированных с общим флуорофоров через нажмите химии6,7. Наконец, кроме флуоресцентный оранжевый цианиновые ДНК краску, Зеленый флуоресцентный цианиновые ДНК краситель доступен и выполняет хорошо с живой бактериальной клетки10. Визуализация ключевых клеточных структур, помечены целевой объект специфического красители могут быть объединены с замечанием флуоресцентных белков, чтобы получить механистический понимание основных процессов в бактериях.
Эти протоколы включают в себя условия, необходимые для микроскопические наблюдения A. tumefaciens истощения пятен, и оно должно быть возможным распространить эти подходы к белка истощения штаммов в других бактерий. Характеристика истощения штаммов может быть особенно сложным, как ограниченные сроки для завершения расследований, прежде чем клетки перестают расти или лизируют. Важно адекватно вымыть клетки, чтобы удалить все следы избыток краски во время маркировки; Однако некоторые клетки истощены эфироносных протеинов имеют дефекты в их клеток поверхности, которые могут вызвать их быть чувствительным к мыть шаги. Увеличение начальный объем клеточных культур может помочь компенсировать потери клеток во время стирки шаги. Истощение штаммов, которые подорвали мембран клеток и клеточной стенки могут быть склонны к ячейке лизиса при выращивании культур в жидкой среде без индуктором. Включение osmoprotectant (5%-ая сахароза работает хорошо для A. tumefaciens) может помочь поддерживать морфологии клеток и ограничить лизис клеток во время истощения. Это необходимо чтобы эмпирически определить соответствующее количество времени перед разрушать клетки до окрашивания с флуоресцентной краской. Клетки с permeablized мембраны или клеточной стенки могут быть склонны к ячейке лизис или неизбирательной маркировки с флуоресцентных реагентов, делая изображений в последнее время особенно сложным моментам времени истощения.
Важным шагом для покадровой микроскопии A. tumefaciens (или другие бактериальные клетки) является подготовка агарозы pad. Агарозы pad должен быть уровень для обеспечения хорошего фокус на протяжении покадровой микроскопии экспериментов. Кроме того coverslip должны быть полностью закрыты для предотвращения агарозы площадку от высыхания и изменяя фокальной плоскости. Для A. tumefaciensкислород необходим для роста клеток. Визуализация возле воздушного кармана необходимо получить устойчивый рост A. tumefaciens во время экспериментов длинный промежуток времени микроскопии (рис. 1 c). Если клетки не смогут расти или остановить рост после всего лишь несколько часов, желательно подготовить площадку агарозы с большим воздушный карман и изображения вблизи воздушных карманов. Даже хорошо построены агарозы pad с надлежащей воздушный карман может поддерживать только A. tumefaciens роста для максимум ~ 24 h. Если необходимы более покадровой последовательности, альтернативные подходы, такие, как микрофлюидика или потока клетки должны рассматриваться. Если клетки Дрифт фокусе во время визуализации, убедитесь, что агарозы pad является уровень и должным образом опечатаны под coverslip. Обратите внимание, что даже с почти идеальной агарозы площадку, вполне возможно, что некоторые клетки будет дрейфовать в фокусе, таким образом визуализации несколько полей и частой переориентации настоятельно рекомендуется. Для других бактерий альтернативные подходы по подготовке агарозы колодки должны рассматриваться41,,4243 наилучшим образом соответствовать требованиям роста для бактерии. Агарозы колодки также полезны для иммобилизации клеток во время визуализации помечены или фиксированной клеток когда промежуток времени не является необходимым. В этом случае, уплотнительная coverslip не является необходимым и альтернативные подходы для построения агарозы колодки, которые могут храниться до позднее могут быть соответствующие43.
В целом использование целевых красителей и time-lapse микроскопии может обеспечить понимание основных процессов в бактериях. Здесь мы показываем обычных подкова шаблон маркировки с красителем липофильных 4-64 и характерным полярных и межжелудочковой перегородки маркировки с люминесцентные d-аминокислоты в A. tumefaciens. Замечания этих шаблонов в A. tumefaciens согласуются с полярных роста этой бактерии44 , и вполне вероятно, что аналогичные исследования может раскрыть информацию о росте образцу в других бактерий. Вывод что цианиновые красители например оранжевый подходят для покадровой микроскопии исследования10 (рис. 3) позволит тщательного исследования морфологии nucleoid во время роста клеток в wildtype и мутантных штаммов. Imaging флуоресцентных красителей целевой объект специфического во время истощение важнейших белков может предоставить ключевые наблюдения для определения функции белка. Наконец поскольку многие из этих красителей доступны с различных спектральных свойств, исследования с использованием нескольких меток одновременно должно позволить проницательности в координации основных процессов клеточного цикла прогрессии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Майкла VanNieuwenhze (Университет Индианы) за дар FDAAs, используемые в рисунке 2 и на рисунке 4. Мы благодарим членов коричневый лаборатории для обратной связи в ходе подготовки этой рукописи. Исследования в коричневый лаборатории на деление и рост клеток A. tumefaciens поддерживается Национальный научный фонд (IOS1557806).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
References
- Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
- Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
- Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26 (2010).
- Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
- Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496 (2013).
- Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
- Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
- Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
- Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
- Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
- Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219 (2014).
- Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
- Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
- Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
- Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
- Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137 (2007).
- Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
- Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
- Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
- McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
- Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
- Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730 (2014).
- Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488 (2016).
- Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322 (2014).
- Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519 (2013).
- Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
- Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
- Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682 (2013).
- Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363 (2011).
- Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).
