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Biology

Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

Published: November 24, 2017 doi: 10.3791/56497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

Summary

Es difícil entender la función de los procesos esenciales en bacterias. Microscopía de fluorescencia con objetivo específicos de colorantes puede proporcionar ideas claves en la progresión de crecimiento y el ciclo celular la célula microbiana. Aquí, Agrobacterium tumefaciens se utiliza como una bacteria modelo para resaltar los métodos de proyección de imagen de células vivas para la caracterización de los procesos esenciales.

Abstract

Los procesos celulares básicos como la replicación del ADN y segregación, la síntesis de proteínas, biosíntesis de la pared celular y división celular dependen de la función de proteínas que son esenciales para la supervivencia bacteriana. Una serie de objetivos específicos de colorantes puede utilizarse como sondas para mejor entienden estos procesos. Tinción con colorantes lipófilos permite la observación de la estructura de la membrana, visualización de microdominios lipídicos y la detección de las ampollas de la membrana. Uso de fluorescentes d-aminoácidos (FDAAs) a los sitios de la biosíntesis del peptidoglicano de la sonda puede indicar posibles defectos en la biogénesis de la pared celular o patrones de crecimiento de la célula. Por último, las manchas de ácido nucleico pueden indicar posibles defectos en la segregación de replicación o cromosoma de ADN. ADN de Cianina manchas etiqueta viven las células y son conveniente para Time-lapse microscopía permite observaciones en tiempo real de morfología nucleoid durante el crecimiento de la célula. Protocolos para el etiquetado de células pueden aplicarse a mutantes de agotamiento de la proteína para identificar defectos en la estructura de la membrana, la biogénesis de la pared celular o la segregación cromosómica. Además, Time-lapse microscopia puede utilizarse para monitorizar los cambios morfológicos como una proteína esencial se elimina y puede proporcionar perspectivas adicionales en función de la proteína. Por ejemplo, el agotamiento de proteínas esencial división celular produce filamentación o ramificación, mientras que el agotamiento de proteínas de crecimiento celular puede causar células llegar a ser más corto o más redondos. Aquí, los protocolos para el crecimiento de la célula, específico del destino etiquetado y microscopía de Time-lapse se proporcionan para el patógeno de la planta bacteriano tumefaciens de la agrobacteria. Juntos, tintes específicos del destino y Time-lapse microscopia permiten caracterización de procesos esenciales en a. tumefaciens. Por último, los protocolos proporcionados pueden modificarse fácilmente para probar procesos esenciales en otras bacterias.

Introduction

Progresión a través del ciclo de la célula bacteriana requiere la coordinación de muchos procesos incluyendo biosíntesis de membrana y pared celular, replicación del DNA y la segregación y división celular. Para entender completamente la complejidad de la biología de la célula bacteriana, es necesario estudiar estos acontecimientos esenciales; sin embargo, se trata de una tarea no trivial ya que la viabilidad celular se ve comprometida cuando componentes clave de estos caminos son mutagenized. Microscopía de epifluorescencia juntada con colorantes específicos del destino es un enfoque poderoso para estos procesos esenciales en el tipo salvaje y mutante de cepas bacterianas.

Colorantes específicos de peptidoglicano son fluorescentes antibióticos (vancomicina-FL, bocillin-FL) y fluorescente-d-amino ácidos (por ejemplo, 7-hidroxicumarina-3-carboxílico ácido-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanina; TADA). En bacterias Gram positivas, el uso de concentraciones subletales de fluorescentes antibióticos análogos a los sitios de la biosíntesis del peptidoglicano de la sonda ha sido una estrategia efectiva para revelar peptidoglicano patrones de inserción de1,2, 3,4. Mientras que el etiquetado fluorescente vancomicina se ha utilizado para ganar penetraciones en el peptidoglicano patrones de inserción en bacterias Gram-negativas fija5, la membrana externa proporciona generalmente una barrera de permeabilidad que impide el uso de fluorescentes antibióticos como sonda para la biosíntesis de peptidoglicano en células vivas. Por el contrario, pulsos cortos de fluorescente d-aminoácidos o d-aminoácidos con grupos funcionales de biorthogonal covalente etiqueta regiones de reciente inserción de peptidoglicano en una amplia gama de vida las células bacterianas6,7. Patrones de inserción de peptidoglicano que se han observado con los d-aminoácidos sintéticos incluyen punteado y septal (Escherichia coli y Bacillus subtilis), polar y septal (Agrobacterium tumefaciens y Listeria monocytogenes), sólo septal (Staphylococcus aureus) y apical (Streptomyces venezuelaa)6,7. Estas observaciones indican que las bacterias exhiben diversos patrones de la biogénesis de la pared celular y que el uso de sintéticos d aminoácidos como sondas para examinar los patrones de crecimiento es una estrategia valiosa en muchas bacterias.

Tintes que etiquetar los cromosomas bacterianos incluyen la carpeta de surco menor específicos de ácido desoxirribonucleico (ADN) (4, 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) y colorantes de Cianina de alta afinidad (verde y naranja; vea la lista de materiales). La coloración de DAPI de células fijas ayuda a enumeración de bacterias a partir de muestras ambientales8, mientras que la coloración de DAPI de células vivas se utiliza para indicar la viabilidad bacteriana9. En cambio, colorantes de Cianina como naranja y verde son frecuentemente descritos como células "muertas" impermeant membrana manchas para enumerar las células no viables9. Sorprendentemente, cuando estos reactivos se utilizan para sondar la morfología del nucleoide bacteriano durante el crecimiento de la célula, DAPI, naranja y verde todos mostraron ser membrana florescente y capaz de etiquetado células vivas10. En vivo las células de e. coli , la coloración de DAPI de ADN aparece difusa debido a auto fluorescencia del citoplasma y exposiciones repetidas de células con tinción DAPI a luz ultravioleta (UV) perturba la estructura nucleoide del10. Tinción e. coli o B. subtilis con naranja revela que este tinte es membrana florescente y proporciona fluorescencia de larga duración sobre la Unión al ADN en células vivas sin afectar el crecimiento de la célula, replicación del ADN o cromosoma segregación10 . Estas observaciones sugieren que colorantes de Cianina ADN pueden utilizarse para controlar la morfología de nucleoids durante el crecimiento celular de muchas bacterias.

Phospholipid-specific stryl tintes como N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibromuro de pyridinium (4-64; véase la lista de materiales) son compuestos catiónicos y asociar preferentemente con carga negativa fosfolípidos como la cardiolipina y fosfatidilglicerol11. Se observan patrones distintos al 4-64 se utiliza para etiquetar la membrana de bacterias diferentes. En Escherichia coli, 4-64 se enriquece en los polos, en bandas a lo largo de la pared lateral y en los sitios de la división de pre-divisional células de12. En Bacillus subtilis, 4-64 etiquetado permite la visualización de lípidos espirales13. En Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiquetas la membrana externa y se observa un patrón característico "Herradura" en el que el polo de crecimiento carece de etiquetado14,15. Estas observaciones indican que estas bacterias exhiben distribuciones lípido heterogéneo debido a la presencia de los dominios de lípidos que contribuyen a la asimetría celular. Cambios en los patrones Etiquetadoras 4-64 como la presencia de las etiquetas difusas, las ampollas o vesículas, invaginaciones o contracción de la membrana puede ser informativa en la caracterización de mutantes que afectan a la distribución o la biosíntesis de lípidos.

Más allá de la coloración de las células, es necesario determinar la función de las proteínas que participan en los procesos esenciales. La caracterización de las proteínas esenciales es un desafío técnico porque no es posible eliminar genes esenciales y estudiar las consecuencias fenotípicas. Así, han surgido enfoques alternativos que agotan la proteína. Por ejemplo, un gen esencial se puede poner bajo el control de un promotor inducible en lugar de su promotor nativo. Promotores inducibles son sensibles a moléculas pequeñas tales como; Isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG)17,18,19,20,21, arabinosa22,16, vanillate17,23, de zinc y así la transcripción del gen objetivo deja de xilosa23, y la proteína de interés se agota cuando se retira el inductor. Enfoques alternativos para el agotamiento de proteínas esenciales de interés incluyen riboswitches sintético24 que utiliza las interacciones ARN molécula pequeña para impedir la transcripción de genes diana, CRISPR interferencia25,26 a bloque de transcripción de genes diana y proteína inducible degradación27,28 que utiliza etiquetas de péptidos a las proteínas de la blanco para la degradación por la proteasa de ClpXP. Cepas de agotamiento proporcionan solamente un a corto plazo para la caracterización antes de que las células pierden viabilidad, por lo tanto, la proyección de imagen microscópica de células en el tiempo durante el agotamiento de la proteína es un potente enfoque para la caracterización. De hecho, microscopía de células bacterianas vivas ha permitido a los investigadores a ganar penetraciones en los procesos biológicos fundamentales, incluyendo los mecanismos de mantenimiento de forma celular, secreción y compartimentación29.

A. tumefaciens es un patógeno de planta bacteriana30 e ingeniero genético natural31,32. Así, los mecanismos relacionados con la patogenicidad, incluyendo huésped-patógeno interacciones33,34,35, secreción36y host transformación30,31, 37 han sido ampliamente investigados. Para diseñar estrategias que prevención la enfermedad de a. tumefaciens mediada o aumentar la planta de transformación, los procesos esenciales para la supervivencia de a. tumefaciens deban entenderse mejor. El uso de colorantes específicos del destino y el reciente desarrollo de una estrategia de agotamiento de la proteína de a. tumefaciens18 proporciona un medio para investigar los procesos esenciales.

Aquí, cuentan con protocolos detallados para el análisis microscópico de cepas de tipo salvaje y mutante proteína agotamiento de a. tumefaciens . Los dos primeros protocolos describen cómo preparar las células y etiquetarlos con colorantes específicos del destino. El tercer Protocolo proporciona instrucciones paso a paso para preparar pastillas de agarosa (figura 1) y proyección de imagen las células bacterianas (figura 2, figura 3, figura 4). Estos protocolos también pueden ser adecuados para otras bacterias con adaptaciones adicionales para tener en cuenta las condiciones de los diferentes medios de comunicación, las tasas de crecimiento, requerimientos de oxígeno y estructuras celulares.

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Protocol

1. crecimiento de las cepas de a. tumefaciens

  1. Cultivo de cepas de a. tumefaciens
    1. Utilice una punta de palillo o pipeta de madera estéril para inocular 1 mL de medio de crecimiento de ATGN (véase lista de materiales para la receta) con una sola Colonia de la cepa deseada.
      Nota: Para las cepas de a. tumefaciens agotamiento, el ATGN debe contener 1 mM IPTG como un inductor para mantener la biosíntesis de la proteína esencial.
    2. Crecen las cepas de a. tumefaciens noche en ATGN a 28 ° C con agitación a 225 rpm.
    3. Medir la densidad óptica de las células a 600 nm (OD600) utilizando un espectrofotómetro. Diluir el cultivo celular un OD600 = ~0.2 y continúan creciendo hasta OD600 = ~0.6 está alcanzado. Para cepas de agotamiento, seguir creciendo con inductor hasta OD600 = ~0.6 está alcanzado.
    4. Utilizar cepas de tipo salvaje y mutante de a. tumefaciens a OD600 = ~0.6 para el objetivo específico de tinción o Time-lapse microscopía (ver artículos 2 y 3.1). Para cepas de agotamiento, lavar el inductor (ver sección 1.2).
  2. Eliminación del inductor para la caracterización de cepas de agotamiento de la proteína de a. tumefaciens
    1. 1 mL de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente.
    2. Para lavar, eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en medio fresco sin inductor y sedimenten las células como se describe anteriormente (1.2.1). Lavar las células de un total de 3 veces en medios frescos.
    3. Resuspender el precipitado final en medios frescos y concentrar las células a un OD600 = ~0.8 inmediata tinción con colorantes específicos objetivo (sección 2 y Figura 4B-D) o microscopía de Time-lapse (sección 3.2 y Figura 4A) . Alternativamente, la agotan las células para la cantidad de tiempo deseada por cultivo de células en medios sin inductor antes de la coloración y la proyección de imagen de las células.

2. objetivo específico de tinción de las células a. tumefaciens

  1. Etiquetado ácida d-amino fluorescente de la pared celular
    Nota: FDAAs son no tóxico fluorescentes d-aminoácidos que se incorporan fácilmente en el peptidoglicano de a. tumefaciens . Este sencillo procedimiento etiquetado sondas crecimiento patrones en células vivas6. Protocolos para la síntesis de cuatro FDAAs están disponibles38.
    1. 500 μl de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa. Resuspender el precipitado de células en 100 μl de medio fresco.
    2. Añadir 5 μl de 5 mM FDAA para lavado y concentrado de células e Incube por 2 minutos en la oscuridad.
      Nota: Limitar FDAA exposición a la luz. El tiempo de incubación varía dependiendo de la tasa de crecimiento de la cepa. Normalmente, los tiempos de incubación deben ser 5-10% de la duplicación de tiempo6.
    3. Sedimenten las células por centrifugación y lavar el pellet celular con tampón fosfato salino (PBS) tres veces.
    4. Resuspender el precipitado en 50 μl PBS.
      Nota: El volumen de PBS utilizados por resuspensión puede variar según tamaño de la pelotilla.
    5. Aplicar 0.8-1 μl de células a un colchón de agarosa y la imagen mediante microscopía de epifluorescencia inmediatamente (ver secciones 3.1 y 3.2).
      1. Como alternativa, dejar más incorporación de etiqueta mediante la fijación de las células con etanol al 70% helada. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de etanol al 70% helada e incubar en hielo por 15 minutos.
      2. Recoger las células por centrifugación y resuspender en un pequeño volumen de PBS para la proyección de imagen en un momento posterior. Almacenar suspensiones celulares a 4 ° C y de imagen dentro de 48 horas.
  2. ADN de tinción con DAPI o mancha naranja
    Nota: Observar ADN estructura, las células están marcadas con DAPI o naranja (tinción de células muertas). Aunque clásicamente se describe como una"muerte celular", la naranja es florescente, Fotoestables y no afecta el crecimiento de las células bacterianas, permitiendo a DNA de células vivas imágenes10. En a. tumefaciens, naranja Etiquetadoras obras bien en células vivas y es adecuados para microscopía Time-lapse (figura 3). En contraste, el ultravioleta (UV) exposición a la luz necesaria para la proyección de imagen células con tinción DAPI es fototóxica (figura 3) y tinción DAPI es más adecuado para la tinción de células vivas para la proyección de imagen inmediata o tinción de células fijas.
    1. La coloración de DAPI de células
      1. 1 mL de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa.
      2. Opcionalmente, para fijar las células antes de la tinción, Resuspender el precipitado de células en 1 mL de etanol al 70% helada. Incubar en hielo durante 10-15 minutos recogen las células por centrifugación como se describen en 2.2.1.1.
      3. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con 1 μl de la solución madre de DAPI (1 mg/mL; ver la Tabla de materiales). Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar durante 5 minutos en la oscuridad.
      4. Pellet de células por centrifugación a 7.000 x g durante 5 min y resuspender en 1 mL de PBS para eliminar exceso DAPI. Lavan las células dos veces más y resuspender el precipitado en 50 μl PBS o en los medios de comunicación.
      5. Aplicar 0.8-1 μl de células a un colchón de agarosa y la imagen mediante microscopía de epifluorescencia inmediatamente. Consulte las secciones 3.1 y 3.2.
        Nota: Este Protocolo no es óptimo para Time-lapse microscopia observar la dinámica del cromosoma (figura 3). Considere el uso de la coloración naranja como una alternativa (consulte la sección 2.2.2).
    2. Coloración naranja de células vivas
    3. 1 mL de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con 1 μl de la solución madre naranja (véase lista de materiales). Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar por 5 min en la oscuridad.
    4. Pellet de células por centrifugación y resuspender en 1 mL de PBS para eliminar exceso naranja. Lavan las células dos veces más y resuspender el precipitado en 50 μl PBS.
    5. Aplicar 0.8-1 μl de células a un colchón de agarosa y la imagen mediante microscopía de epifluorescencia inmediatamente. Consulte las secciones 3.1 y 3.2.
      Nota: Este protocolo trabaja con células vivas y es adecuado para microscopía de lapso de tiempo observar la dinámica del cromosoma (figura 3). Si no es conveniente a la imagen inmediatamente, las células pueden fijarse en etanol al 70% helada (ver apartado 2.2.1.2).
  3. Membrana de etiquetado
    Nota: El tinte fluorescente styryl lipofílico 4-64 se ha utilizado extensivamente para observar la membrana de las células bacterianas. A diferencia de muchas bacterias, 4-64 con la etiqueta de las células a. tumefaciens no rotular uniformemente, pero algo con frecuencia exhiben un patrón de "Herradura"14,15. El polo de crecimiento es notable, casi desprovisto de manchas mientras que el polo viejo es intensamente marcado. 4-64 permite visualización de patrones de crecimiento celular y la estructura de la membrana en a. tumefaciens.
    1. Añadir FM 4-64 a una concentración final de 8 μg/mL en 1 mL de cultivo de células de la fase exponencial e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad.
    2. Pelotilla células marcadas por centrifugación a 7.000 x g durante 5 minutos en una centrifugadora de escritorio y resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS. Lavar las células de un total de tres veces para eliminar el exceso de tinte.
    3. Resuspender las células en un volumen pequeño de PBS y punto en una almohadilla de agarosa a la imagen inmediatamente. (Véanse las secciones 3.1 y 3.2)
      PRECAUCIÓN: Las células deben ser reflejadas inmediatamente para observar patrones característicos de etiquetado.

3. la proyección de imagen de las células a. tumefaciens

  1. Preparación del pad de agarosa
    Nota: La figura 1 contiene una secuencia de imágenes (panel A) y esquema (panel B) de una almohadilla de agarosa típica preparada para microscopía de Time-lapse. Cojines de agarosa se preparan normalmente según sea necesario.
    1. 3.1.1. utilizar un cubreobjetos como guía y corte un 22 x 22 mm cuadrado de laboratorio de la película (véase lista de materiales) ejecutando un bisturí alrededor de los bordes.
    2. Cortar un cuadrado en el centro de la película de laboratorio dejando un ~ 2-5 frontera mm para servir como una junta para la almohadilla de agarosa. Deseche la abertura del centro.
    3. Coloque el empaque de película en un portaobjetos de vidrio (75 mm x 25 mm) limpiado con amoniaco y limpiador sin alcohol (véase lista de materiales) y calentar hasta que la película se derrita ligeramente sobre el vidrio (imagen de arriba en la figura 1A). Película de laboratorio del derretimiento, utilice el borde de un conjunto de bloque de calor a 70 ° C o derretir suavemente a la llama.
    4. Preparar la solución de agarosa mezclando ~0.075 g agarosa (véase lista de materiales) en 5 mL de medio en un matraz pequeño. Calentar la solución en un microondas con agitación periódica para mezclar hasta que la agarosa se disuelve y la solución es clara. Mantener la solución de agarosa en 55-70 ° C y usar para la construcción de múltiples pastillas de agarosa dentro de 48 horas.
    5. Media pipeta que contiene 1.2-1.5% agarosa en el centro de la Junta.
      Nota: El volumen de los medios de comunicación suele ser de 50-60 μL pero variará según el tamaño de la Junta. Agregar medios a una diapositiva de frío pueden causar la agarosa se solidifique demasiado rápidamente, así la diapositiva debe mantenerse sobre una superficie caliente. El borde de un bloque de calor situado a 70 ° C obras bien. Agarosa de agua o soluciones de agarosa tamponado como tamponada fosfato salino (PBS) pueden utilizarse en lugar de los medios de comunicación que contenga agarosa para aplicaciones en las que el crecimiento celular continua no es necesario. Para cepas de agotamiento de la proyección de imagen, puede ser inductor de presentes o ausentes en los medios de comunicación. Presencia del inductor puede utilizarse como un control, mientras que la ausencia del inductor revelará el fenotipo de agotamiento.
    6. Coloque un cubreobjetos sobre el empaque para distribuir uniformemente la agarosa.
    7. Colocar el portaobjetos sobre una superficie fría, solidificar para min ~ 2 Evite un secado excesivo de la almohadilla de agarosa como resultado una superficie rugosa en la agarosa y puesta en común de la suspensión de la célula cuando se aplica a la superficie.
    8. Deslice con cuidado el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa.
      PRECAUCIÓN: No se apresure este paso. La almohadilla de agarosa puede rasgar fácilmente y una almohadilla de agarosa desigual puede dificultar la proyección de imagen.
    9. Seque la almohadilla de la agarosa al aire durante 1-2 min a temperatura ambiente aparezca seca la superficie de la almohadilla. Con el bisturí, quitar una pequeña tira de agarosa para crear una bolsa de aire (imagen media, figura 1A); la bolsa de aire es típicamente ~ 2 x 7-10 mm y las células a. tumefaciens tienden a crecen mejor cerca de la bolsa de aire (figura 1).
      Nota: Para la proyección de imagen de células fijas o en condiciones donde el crecimiento no se controla, una bolsa de aire no es necesaria.
    10. Punto 0.8-1 μl de células sobre la almohadilla de la agarosa y la tapa con un cubreobjetos nuevo. Coloque con cuidado el cubreobjetos sobre la parte superior de la almohadilla de la agarosa para la distribución de las células a través de la superficie de la almohadilla de agarosa.
    11. Sellar los bordes del cubreobjetos con VALAP fundido (ver la Tabla de materiales para la receta; Figura 1A, imagen inferior). Para sellar a lo largo de los bordes y esquinas del cubreobjetos puede causar sequedad de la almohadilla de agarosa, que conducirá a la deriva de las células durante la proyección de imagen. Nota: Sólo es necesario sellado de cubreobjetos para la proyección de imagen de lapso de tiempo a largo plazo.

Figure 1
Figura 1: preparación de agarosa pad. (A) imagen secuencia del Protocolo de preparación del pad de agarosa. Imagen 1 es una diapositiva con el empaque de película de laboratorio. En la imagen 2, se visualizan la agarosa cojín y bolsa de aire. Finalmente, la imagen 3 muestra la plataforma completa agarosa con las células bajo un cubreobjetos y sella con VALAP. (B) un esquema de una almohadilla de agarosa para Time-lapse microscopía se proporciona. Principales características de la almohadilla de agarosa están marcadas en el esquema. (C) el bolsillo de aire promovió el crecimiento de a. tumefaciens sobre soportes de agarosa. Se muestran imágenes de las células de a. tumefaciens wildtype cultivadas en una almohadilla de agarosa durante 20 horas. Imágenes fueron tomadas en posiciones cada vez más distantes de la bolsa de aire. La distancia desde el borde más cercano de la imagen a la bolsa de aire se muestra por encima de cada imagen. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. La proyección de imagen
    Nota: Imágenes epifluorescencia, contraste de interferencia diferencial y contraste de fases se realiza con un microscopio invertido con enfoque automático basado en hardware, una etapa automatizada, filtros estándar, una fuente de luz LED, inmersión de aceite de 60 X objetivos (NA 1.4) para contraste de fase o de contraste de interferencia diferencial (DIC) y una 1K multiplicadores de electrón--dispositivo de carga acoplada (EMCCD) de la cámara. El microscopio debe colocarse en una sala de temperatura controlada. Alternativamente, puede utilizarse un escenario más cálido o cámara para mantener temperaturas constantes durante proyección de imagen.
    1. Microscopía de epifluorescencia
      Nota: Para imágenes de fluorescencia de células vivas, es necesario limitar el número de adquisiciones de la imagen y optimizar el tiempo de exposición para minimizar el fotoblanqueo y fototoxicidad. Para la proyección de imagen de cada tinte, es aconsejable encontrar un tiempo de exposición óptimo que proporciona detección de fluorescencia suficiente pero no lleva al fotoblanqueo o fototoxicidad. En las figuras 2-4, se utilizaron tiempos de exposición de 200 ms para todas las imágenes de fluorescencia. Para las secuencias de lapso de tiempo que se muestra en la figura 3, imágenes fueron adquiridas cada 10 minutos durante 3 horas.
      1. Colocar aceite de inmersión en el objetivo deseado y coloque el carro invertido en el soporte de diapositivas en el escenario. Utilice las perillas de enfoque para poner las células en el foco.
      2. Adquirir las imágenes de fase (o DIC) y el filtro de la fluorescencia deseada.
        Nota: Las máximas longitudes de onda de excitación y emisión para las manchas en la figura 2, figura 3y figura 4 son los siguientes: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), naranja (547/570).
    2. Microscopía de Time-lapse
      Nota: Durante el Time-lapse microscopía las siguientes características son controlados por el ordenador: x, y y z filtros de posición, persianas y fluorescencia. Un sistema de enfoque automático basado en hardware es óptimo para mantener la atención durante la proyección de imagen de Time-lapse. Alternativamente, puede utilizarse un lazo basado en software de enfoque automático.
      1. Colocar aceite de inmersión en el objetivo deseado y coloque el carro invertido en el soporte de diapositivas en el escenario. Utilice las perillas de enfoque para poner las células en el foco.
      2. Opcionalmente: Adquirir múltiples (x, y) posiciones. Seleccionar al azar 10 campos de células en proximidad cercana a la bolsa de aire de los cojines de la agarosa.
      3. Puesta en marcha la adquisición de la secuencia de tiempo a la imagen en fase o CID en el intervalo de tiempo deseado.
        Nota: Para la secuencia Time-lapse que se muestra en la figura 4, DIC imágenes fueron adquiridas con la exposición de ms de 30 cada 10 minutos para las 14 h. Cuando utilice imágenes de fluorescencia durante el Time-lapse microscopia, ajuste el tiempo de exposición y el intervalo de adquisición para minimizar el fotoblanqueo y fototoxicidad.

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Representative Results

Objetivo específico de tipo salvaje Las células de a. tumefaciens
Para ilustrar esa morfología de la célula no se ve afectada por los pasos de lavado o tratamiento con DMSO 1% (que se utiliza para diluir los tintes fluorescentes), las células fueron imágenes directamente de la cultura (figura 2A, panel izquierdo), después de lavar las células por centrifugación como se describe en 1.2 (figura 2A, panel de la izquierda) o después de incubar las células con DMSO 1% durante 10 minutos y lavar las células (figura 2A, panel derecho). Estas imágenes ilustran que morfología no se ven afectada por el lavado o la presencia de DMSO. Además, el crecimiento celular no se ven afectado por el lavado o tratamiento de DMSO basado en análisis de la curva de crecimiento (datos no mostrados). Además, fijación de a. tumefaciens con etanol helada no causa cambios brutos en morfología (figura 2A, panel de la derecho).

A continuación, tintes específicos objetivo se utilizaron para observar la biogénesis de la pared celular, dominios de membrana y ADN dentro de las células a. tumefaciens wildtype. Los patrones de la nueva inserción de peptidoglicano se observaron después de etiquetado con tres fluorescentes-d-aminoácidos: HADA (figura 2B, panel de la izquierda), NADA (figura 2B, panel central) y TADA (figura 2, panel derecho). En los tres experimentos de etiquetado, etiquetado de peptidoglycan nuevo fue enriquecido en el polo de crecimiento o tabique de las células. Estos modelos de crecimiento se observaron constantemente con todos tres FDAAs, indicando que la selección de la FDAA puede ser modificada para permitir el etiquetado dual con otras manchas o las células que expresan proteínas fluorescencia marcadas. El tinte lipofílico 4-64 etiquetas preferencial de la antigua región de polos de las células a. tumefaciens resultando en un patrón de herradura característicos (figura 2). Naranja (Figura 2D, panel izquierdo) y DAPI (Figura 2D, panel derecho) etiqueta DNA dentro de las células a. tumefaciens en vivo. En las células pre-divisional finales, dos nucleoids diferentes se observan con tinción naranja, mientras que ADN etiquetado aparece más difuso con DAPI tinción (Figura 2D) consistentes con los resultados de experimentos observaron en e. coli10.

Conveniencia de ADN colorantes para microscopía de Time-lapse
Para determinar si la DAPI o naranja son convenientes para Time-lapse de imágenes de morfología nucleoid durante el crecimiento de la célula, se mezclaron y vistos en una proporción igual de etiqueta, etiqueta de DAPI y las células de a. tumefaciens wildtype marcado con naranja cojines de agarosa. A tiempo 0, se tomaron imágenes iniciales mediante contraste de fase, DAPI y TRITC filtros para determinar si cada célula se etiqueta. Las mezclas de células fueron entonces reflejadas en tres condiciones diferentes: microscopio de contraste de fase (1) solo, (2) fase contraste y epifluorescencia microscopía utilizando el TRITC (3) fase y filtro de contraste y epifluorescencia microscopía utilizando el filtro DAPI. Se adquirieron imágenes cada 10 minutos durante 3 horas. Todas las células crecieron bien independientemente de la mancha fluorescente cuando reflejada con fase microscopía de contraste indicando coloración naranja ni DAPI afectar el crecimiento de la célula (figura 3, panel superior). Todas las células también crecieron cuando reflejada por microscopio de fases y microscopía de epifluorescencia mediante el filtro TRITC (figura 3, panel central). La etiqueta naranja está sujeto a fotoblanqueo pero puede observarse durante al menos 2 h (13 exposiciones total de 200 ms), que indica la idoneidad de este colorante para microscopia a corto plazo de células vivas. Independientemente de la etiqueta, todas las células dejen de crecer dentro de una hora cuando reflejada por microscopio de fases y microscopía de epifluorescencia mediante el filtro DAPI (figura 3, panel inferior). Esta observación demuestra que a. tumefaciens es sensible a la exposición Ultravioleta e indica que se deben evitar tintes que requieren un filtro UV para la proyección de imagen para los experimentos de microscopía de Time-lapse.

Proyección de imagen de Time-lapse y etiquetado específico del destino de un A. tumefaciens tensión de agotamiento
Tanto transposon mutagénesis39 se satura y no construir una canceladura cepa18,40 indican que la proteína del regulador principal, CtrA, es esencial en a. tumefaciens. Para demostrar el valor del análisis microscópico de las cepas de agotamiento, una descrita ctrA agotamiento tensión18 fue sometido a caracterización por microscopia. En la Figura 4A, Time-lapse microscopia se usó para comparar el crecimiento de células de agotamiento de la Ctra que expresión ctrA fue inducido (arriba) y uninduced (abajo). En la Ctra., presencia de una sola célula dio lugar a un microcolony dentro de las 14 h. En cambio, cuando se agota la CtrA, células o lisis o no dividir. Las células que no se pudieron dividir mostraron cambios morfológicos brutos incluyendo redondeo de mitad de la célula y en los polos celulares. Estas observaciones sugieren que CtrA tiene una función importante en la regulación de la división celular.

En la Figura 4B-D, tintes fluorescentes fueron utilizados para caracterizar la tensión de agotamiento Ctra después de la inducción o el agotamiento de Ctra 10 h. células pulso marcado con NADA durante 2 minutos (Figura 4B). Cuando CtrA estaba presente (panel superior), biosíntesis de peptidoglicano polar fue observada. En cambio, amplia NADA etiquetado ocurrió en los polos y grandes hinchazones de media celdas se produjeron cuando se agota la CtrA. Esta observación es consistente con la síntesis de peptidoglicano continua a pesar de un fallo de las células a dividirse. El tinte de la DNA de Cianina naranja se utilizó para caracterizar la distribución del ADN en la cepa ctrA de agotamiento (figura 4). Cuando CtrA estaba presente, creciendo las células tenía una distribución uniforme de la DNA y la segregación de nucleoids era evidente en una celda pre-divisional finales; en cambio, cuando se agota la CtrA, ADN fue distribuido irregularmente a través de las células. Estas observaciones sugieren que CtrA contribuye a la adecuada replicación del ADN o la segregación. Por último, las células de agotamiento de la ctrA fueron etiquetadas con 4-64 (figura 4). En presencia de CtrA, la membrana de la célula fue etiquetada con un patrón de herradura característica en la que el polo de crecimiento carecía de mancha. En las células agotadas de CtrA, 4-64 apareció etiquetar la membrana entera, aunque un poste fue manchado más intensamente. Esta observación sugiere que las membranas permanecen intactas, aunque la organización microdomain de lípidos puede interrumpirse cuando se agota la CtrA.

Figure 2
Figura 2: Imágenes representativas de las células de Agrobacterium tumefaciens wildtype marcadas con colorantes específicos objetivo. Contraste de fase de (A) imágenes de las células a. tumefaciens antes y después del Protocolo de lavado, cuando tratados con DMSO 1% o después de la fijación con etanol helada. (B) crecimiento Polar de las células a. tumefaciens se muestra por el etiquetado con el fluorescente d aminoácidos TADA, HADA y NADA. (C) tinción de a. tumefaciens con el tinte lipofílico 4-64. (D) tinción de las células a. tumefaciens con el ADN específicos de colorantes naranja y DAPI. Para paneles B, D, se muestran imágenes epifluorescencia (abajo) y contraste de fases (arriba). Contornos de células disponen de imágenes de fluorescencia para la referencia. Barra de escala = 2 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Comparación de DAPI y naranja de etiquetado de la DNA en vivo a. tumefaciens células. Iguales proporciones de células de tipo salvaje sin etiqueta, DAPI-etiquetados y marcados con naranja a. tumefaciens se mezclaron y manchados en las plataformas de agarosa. A tiempo 0, se tomaron imágenes iniciales mediante contraste de fase, TRITC y DAPI filtros para determinar si las células fueron etiquetadas. (A) Time-lapse de células sin etiqueta, DAPI-etiquetados y marcados con naranja reflejadas por microscopía de contraste de fase. (B) Time-lapse de células sin etiqueta, DAPI-etiquetados y marcados con naranja reflejadas por microscopio de fases y microscopía de epifluorescencia mediante el filtro TRITC. (C) Time-lapse de células sin etiqueta, DAPI-etiquetados y marcados con naranja reflejadas por microscopio de fases y microscopía de epifluorescencia mediante el filtro DAPI. Barra de escala = 2 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes representativas de la tensión de agotamiento de ctrA en condiciones inducidas y uninduced. Microscopía Time-lapse (A) de la tensión de agotamiento ctrA bajo condiciones donde ctrA fue inducido (parte superior) o agotado (abajo). Los números encima de cada panel indican el tiempo en horas. (B) fase de contraste (izquierda) y epifluorescencia (derecha) imágenes de células con NADA. (C) fase de contraste (izquierda) e imágenes (derecha) de la fluorescencia de las células con naranja. (D) fase de contraste (izquierda) e imágenes (derecha) de la fluorescencia de las células con 4-64. Contornos de la célula fueron proporcionados en imágenes de fluorescencia para la referencia. Barra de escala = 2 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo contiene una serie de procedimientos para la investigación de cepas de tipo salvaje, mutante y el agotamiento de a. tumefaciens . Cabe destacar que todos los procedimientos enumerados en la sección de protocolo pueden ser fácilmente adaptados para otras cepas bacterianas con modificaciones adicionales para tener en cuenta medios de cultivo, temperaturas y tasas de crecimiento.

El uso de colorantes específicos del destino es una valiosa herramienta para proporcionar una caracterización detallada de los eventos del ciclo celular en células bacterianas. Aquí, se observaron patrones de inserción de peptidoglicano con fluorescente d-aminoácidos, dominios de lípidos fueron visualizados con 4-64, y nucleoids fueron etiquetadas con DAPI o naranja. Cada uno de los protocolos puede ser adaptado para su uso en otras bacterias después de optimizar el protocolo de lavado y asegurar que el tratamiento de DMSO no deteriora crecimiento o morfología. Consideraciones claves incluyen la selección de un búfer para pasos de lavado, tiempos de incubación para la incorporación de la etiqueta y la selección de un fluoróforo adecuado para evitar auto-fluorescencia o para permitir estudios de etiquetado multiplexores. Por ejemplo, una alternativa a la tinción de membrana rojo fluorescente lipofílico (4-64) es la mancha verde fluorescente membrana (1-43). Del mismo modo, azul, verde y rojo fluorescente-d-aminoácidos disponibles6,38 y d aminoácidos con asas biorthogonal pueden ser conjugados con fluoróforos común a través de clic química6,7. Finalmente, además de la Cianina naranja fluorescente DNA del tinte, un verde tinte de Cianina fluorescente DNA está disponible y se realiza con células bacterianas10en vivo. Visualización de las estructuras de la célula clave marcado con colorantes específicos del destino puede combinarse con la observación de proteínas fluorescentes a ganar penetraciones mecánicas en procesos esenciales de las bacterias.

Estos protocolos incluyen las necesarias condiciones para la observación microscópica de las manchas de agotamiento de a. tumefaciens y debería ser posible ampliar estos enfoques a las cepas de agotamiento de la proteína en otras bacterias. La caracterización de cepas de agotamiento puede ser particularmente desafiante ya que hay un tiempo limitado para completar las investigaciones antes de que las células dejen de crecer o lyse. Es importante lavar adecuadamente las células para eliminar los restos del exceso de tinte durante el etiquetado; sin embargo, algunas células agotadas de las proteínas esenciales tienen defectos en su superficie celular que puede ser sensible a los pasos de lavado. Aumentar el volumen a partir de cultivos celulares puede ayudar a compensar la pérdida de células durante las etapas de lavado. Cepas de agotamiento que han comprometido las membranas celulares o paredes celulares pueden ser propensas a la célula de la lisis cuando se cultiva en cultivo de líquido sin inductor. Inserción de un osmoprotectant (5% de sacarosa funciona bien para a. tumefaciens) puede ayudar a mantener la morfología celular y limitar la lisis celular durante el agotamiento. Es necesario determinar empíricamente la cantidad apropiada de tiempo para agotar previamente las células antes de la tinción con colorante fluorescente. Células con membranas permeablized o las paredes celulares pueden ser propensas a la célula lysis o etiquetado no selectivo con reactivos fluorescentes que la proyección de imagen de puntos de tiempo de agotamiento especialmente difíciles.

Un paso crítico para Time-lapse microscopía de a. tumefaciens (u otras células bacterianas) es la preparación de la almohadilla de agarosa. La almohadilla de la agarosa debe ser nivelado, para una buena atención a través de experimentos de microscopía de Time-lapse. Además, el cubreobjetos deben ser completamente sellado para evitar que la agarosa almohadilla de secado y cambiar el plano focal. Para a. tumefaciens, oxígeno se requiere para el crecimiento de la célula. La proyección de imagen cerca de una bolsa de aire es necesaria para tener un crecimiento robusto de a. tumefaciens durante experimentos de microscopía largo lapso de tiempo (figura 1). Si las células no crecen o deja de crecer después de un par de horas, es recomendable preparar una almohadilla de agarosa con una bolsa de aire más grande y la imagen cerca de los bolsillos de aire. Incluso un cojín de agarosa bien construido con un bolsillo de aire adecuado sólo puede apoyar crecimiento de a. tumefaciens para un máximo de ~ 24 h. Si ya secuencias de lapso de tiempo están necesarias, enfoques alternativos tales como células microfluídica o flujo deben ser consideradas. Si las células deriva fuera de foco durante la proyección de imagen, asegúrese de que la almohadilla de agarosa es nivel y debidamente sellado bajo el cubreobjetos. Tenga en cuenta que incluso con un casi perfecto agarosa pad, es posible que algunas células se deriva fuera de foco, así la proyección de imagen múltiples campos y reorientación frecuente son muy recomendables. Para otras bacterias, enfoques alternativos de preparar agarosa almohadillas deben considerarse41,42,43 para satisfacer mejor las necesidades de crecimiento de la bacteria. Cojines de agarosa son también útiles para inmovilizar células durante proyección de imagen de células marcadas o fijadas al lapso de tiempo no es necesario. En este caso, sellado de cubreobjetos no es enfoques necesarios y alternativos para la construcción de agarosa almohadillas que pueden ser almacenadas hasta que más adelante puede ser apropiado43.

En general, el uso de colorantes específicos del destino y microscopía de Time-lapse puede proporcionar conocimientos sobre los procesos fundamentales en las bacterias. Aquí, nos ilustra el patrón de herradura generalmente de etiquetado con el tinte lipofílico 4-64 y la característica polar y septal con fluorescente d-aminoácidos en a. tumefaciens. Observaciones de estos patrones en a. tumefaciens son consistentes con el crecimiento polar de esta bacteria44 y es probable que estudios similares pueden revelar información sobre patrones en otras bacterias de crecimiento. El hallazgo de que los colorantes de Cianina como naranja son adecuadas para Time-lapse microscopía estudia10 (figura 3) permitirá estudios de morfología nucleoid durante el crecimiento celular en las cepas de tipo salvaje y mutante. Proyección de imagen tintes fluorescentes específicos del destino durante el agotamiento de una proteína esencial puede proporcionar observaciones claves para determinar la función de la proteína. Por último, ya que muchos de estos colorantes están disponibles con diferentes propiedades espectrales, estudios con varias etiquetas al mismo tiempo deben permitir penetraciones en la coordinación de los procesos esenciales durante la progresión del ciclo celular.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Michael VanNieuwenhze (Indiana University) por el don de las FDAAs en la figura 2 y figura 4. Agradecemos a los miembros del laboratorio de marrón para la retroalimentación durante la preparación de este manuscrito. Investigación en el laboratorio de marrón en la división y crecimiento de las células a. tumefaciens es apoyada por la National Science Foundation (IOS1557806).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58 ATCC 33970 Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH Fisher BioReagents BP359
KH2PO4 Fisher Chemical P288
20X AT Salts Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4 Fisher Chemical A701
MgSO4•7H2O Fisher BioReagents BP213
CaCl2•2H2O Fisher BioReagents BP510
MnSO4•H2O Fisher Chemical M114
Glucose Fisher Chemical D16 Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar Fisher BioReagents BP1423 Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name Company Catalog Number Comments
Optional Media Additives
Kanamycin GoldBio K-120 Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG GoldBio I2481C5 Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides Fisherbrand 12-550D 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-541-B 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner Home Depot 203261385 Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose Invitrogen 16500-100 Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS Fisher BioReagents BP399500 10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm Bemis PM-999 Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter SAAQIN SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly Target Corp. 06-17644
Paraffin Wax Crafty Candles 263012
Name Company Catalog Number Comments
Target-specific dyes
DMSO Fisher BioReagents BP231-1 Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA) FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S11368 Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64 Invitrogen T3166 Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Dry bath Sheldon Manufacturing, Inc. 52120-200
Metallic thermal beads Lab Armor 42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.

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References

  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26 (2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496 (2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219 (2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137 (2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730 (2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488 (2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322 (2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519 (2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682 (2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363 (2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

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Howell, M., Daniel, J. J., Brown, P. J. B. Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth. J. Vis. Exp. (129), e56497, doi:10.3791/56497 (2017).

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