Summary
Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.
Abstract
وظهرت الزرد كنموذج قوي من مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان وأداة مفيدة لمجموعة متزايدة من الدراسات التجريبية، التي تغطي الأساسية علم الأحياء التنموي من خلال شاشات الجينية والكيميائية على نطاق واسع. ومع ذلك، العديد من التجارب، لا سيما تلك المتعلقة بالعدوى ونماذج إكسينوجرافت، وتعتمد على microinjection وتصوير الأجنة واليرقات، وهي تقنيات الشاقة التي تتطلب مهارة وخبرة. لتحسين الدقة والإنتاجية الحالية microinjection التقنيات، قمنا بتطوير سلسلة من الأجهزة ميكروستروكتوريد لتوجيه واستقرار الأجنة الزرد في 2 يوما بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) في اتجاه البطني أو الظهرية الجانبية قبل الإجراء. للمساعدة في تصوير الأجنة، صممنا أيضا جهاز بسيط مع القنوات التي توجه الزرد 4 أفقياً جنبا إلى جنب ضد زلة غطاء زجاج. معا، والأدوات التي نحن الحاضرين هنا تبين فعالية النهج فوتوليثوغرفيك لإنشاء الأجهزة مفيدة لتعظيم الاستفادة تقنيات الزرد.
Introduction
الزرد ظهرت كنموذج قوي للعديد من المجالات، من الدراسات الأساسية البيولوجيا التنموية على نطاق واسع الوراثية والكيميائية شاشات1،2. التلاعبات الجينية الروتينية، مثل ترانسجينيسيس والطفرات كريسبر/Cas9، overexpression الجينات وضربه قاضية تعتمد على microinjection المواد الوراثية في اقحه خلية واحدة، مما أدى إلى وضع بسيطة وسهلة الاستخدام، تجارياً الأدوات المتاحة لتوجيه واستقرار البيض لحقن3. الطرق الأخرى، مثل زرع الأعضاء، والعدوى، غالباً ما تتطلب microinjection في وقت لاحق مرحلة الأجنة واليرقات باستخدام الإبر الشعرية قياس أكبر4. ومع ذلك، استخدام إبر قياس أكبر تحديات كبيرة التقنية، كما أنها أكثر صعوبة لاختراق الأنسجة المستهدفة دون دفع أو المتداول الجنين. في ظل هذه الظروف، قد لا يكون الحصول على التوتر المياه المناسبة المطلوبة لتثبيت الجنين في حين يصعب تفادي التجفيف أثناء الإجراء، والأجنة المنحى المثالي لحقن الأنسجة المستهدفة.
بعد microinjection، يكون من المفيد غالباً الشاشة حقن الأجنة لتحديد تلك التي قد تم حقنه بنجاح، والتقاط الصور للمرة الأولى النقطة. لمواجهة هذه التحديات، قمنا بتطوير مجموعة من الأجهزة ميكروستروكتوريد التي تساعد على استقرار 2 من الأجنة إدارة الشرطة الاتحادية في التوجهات المختلفة سواء microinjection5، وللفرز السريع القائم على الصورة بعد الحقن.
للحصول على قرار الهيكلية الكافية في هذه الأجهزة، ونحن تستخدم تقنيات فوتوليثوغرفيك. يشيع استخدامها في الصناعات الإلكترونية الدقيقة وأكثر مؤخرا باستقراء لتلفيق موائع جزيئية، يمكن تحقيق هذه النهج الهياكل العمودية تتراوح بين 1-1,000 ميكرون، نطاق مناسب تماما للتلاعب بالأجنة الزرد واليرقات. كانت ملفقة كافة الأجهزة باستخدام بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، ورخيصة وقوية جسديا وبيولوجيا الخاملة وشفافة.
ميكروستروكتوريد صفائف السطحية (MSAs) تم تنسيقها ككتل PDMS مع سطح العلوي منقوشة، مماثلة لقنوات بسيطة في كتل [اغروس] شائع الاستخدام microinjection البيض. لفحص ما بعد الحقن، يمكن صفت 6 أجهزة تصوير في لوحة 6-جيدا زجاجية قياسية. صممت هذه الأجهزة لتحميل سهل للأجنة، بينما مريح يسمح الإجراء تفريغ إنقاذ الأجنة محددة، تيسير المستندة إلى الصور فحص النهج بطريقة أكثر سهولة من تلك الأجهزة وضعت سابقا مختبر بيب6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر microinjection يرقات "ماساشوستس العام مستشفى اللجنة الفرعية" المعنية "أبحاث رعاية الحيوان" تحت بروتوكول 2011N000127.
1. تصنيع الجهاز
ملاحظة: جميع بمساعدة الكمبيوتر (CAD) ملفات الرسم المستخدمة لتصميم الأقنعة التصويرية الموصوفة هنا (الشكل 1) متوفرة للتحميل. انظر "الجدول للمواد" للروابط.
- اختﻻق يفر العفن الرئيسي في غرفة نظيفة 1,000 فئة باستخدام التقنيات القياسية فوتوليثوغرفيك7. للمصفوفات المجهرية وقنوات، نمط مقاوم الضوء السلبية على أساس الإيبوكسي التتابع في 3 طبقات باستخدام أقنعة منفصلة 3، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة: 100 ميكرومتر للميزات الضحلة و 200 ميكرومتر ميزات متوسطة 400 ميكرون ل ميزات العميق. لجهاز التصوير، طبقات النمط الثاني باستخدام 400 ميكرون للميزات الضحلة و 600 ميكرون للميزات العميق.
- الشريط يفر المكتملة إلى قاعدة 15 سم طبق بيتري الصب (الشكل 2).
2-إعداد المصفوفات السطحية ميكروستروكتوريد-PDMS
- لجعل الأجهزة صالحة للاستعمال، ويلقي بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، باستخدام رقاقة رئيسية كالعفن. الجمع بين 50 جرام مونومر PDMS مع 5 غ بادئ ومزيج دقيق في بلاستيك وزنها الطبق مع شوكة بلاستيكية.
- صب الخليط بعناية أكثر من العفن.
- ديغا في مجفف فراغ في إينهج 16-25 (54-85 كيلو باسكال) ح 1.
- لعلاج PDMS، خبز عند 65 درجة مئوية على الأقل 3 ح. ينبغي علاج PDMS إلى مادة صلبة ثابتة ولكنها مرنة.
- قص بعناية حول الجهاز على رقاقة رئيسية باستخدام مشرط، مع التأكد من الحفاظ على الاتصال بين طرف دون مشرط والسطح ويفر. استخدام الملقط، قشر النسخة المتماثلة PDMS بعيداً عن ويفر، ونقل إلى سم 10 نظيفة طبق بيتري، ميزة الجانب الأعلى (الشكل 3).
- التعامل مع الجهاز بالبلازما الأكسجين باستخدام فرن بلازما مقابل 35 ثانية للحد من هيدروفوبيسيتي.
- تغطية مع الزرد الجنين المتوسطة (E3) الذي يحتوي على 168 مغ/لتر من إيثيل 3-أمينوبينواتي ميثانيسولفوناتي (مرض التصلب العصبي المتعدد-222، الرقم الهيدروجيني 7.5). إزالة أي فقاعات من أعمق من الميزات التي تتدفق المياه عبر سطح الجهاز باستخدام ماصة نقل.
3-إعداد المصفوفات السطحية ميكروستروكتوريد-[اغروس]
- جعل العفن PDMS سلبية، أول علاج جهاز PDMS مع الأكسجين في البلازما.
-
علاج الجهاز PDMS مع 1ح، 1ح، 2ح،ح2-بيرفلوروكتيلتريثوكسيسيلاني (بفدتس) سيلاني البخار لإنشاء سطح خامل8. باختصار:
- ضع PDMS أن تكون ميزة-الجانب-متابعة المعالجة في فراغ غرفة داخل غطاء دخان.
- بجوار PDMS، ضع طبق الزجاج أو الألومنيوم مفتوحة صغيرة، وعناية "الماصة؛" 200 ميليلتر من بفدتس (silane 98 ٪) في الطبق.
تنبيه: silane بفدتس هو درجة عالية من التقلب، وعنف ويتفاعل مع الماء، القابلة للاشتعال، ويسبب أضرارا بالغة في العين والجلد على الاتصال. قراءة العظمية بالتفصيل قبل الاستخدام. - إغلاق الدائرة فراغ وتطبيق فراغ لمدة 15-30 دقيقة، أو حتى يتبخر silane بفدتس تماما.
- ضع الجهاز في طبق بتري واستخدامه كقالب ل PDMS الطازجة، إعداد كما هو موضح في الخطوة 2، 2، 1-3.
- خبز عند 65 درجة مئوية على الأقل 3 ح، ثم قشر الطبقة بأكملها من PDMS جديدة من جهاز المعالجة ووضع في طبق بتري طازجة. وهذا يمكن ثم استخدامها كالعفن سلبية يلقي [اغروس].
- إعداد [اغروس]، غلى حل 2% لانخفاض مجمد درجة الحرارة [اغروس] في E3 في فرن ميكروويف حتى يذوب تماما [اغروس].
- صب [اغروس] الساخنة على القالب PDMS السلبية وإزالة أي فقاعات في [اغروس] تغطي الجهاز قبل [اغروس] الساخن يتدفق أكثر الميزات مع ماصة نقل.
- حالما تتم إزالة فقاعات، الثلاجة عند درجة 4 مئوية لتعيين [اغروس].
- إزالة الكتلة [اغروس] من العفن PDMS السلبية بتشويه PDMS من تحت من جهة، ونقل الكتلة [اغروس] إلى طبق بتري الجديدة، والرطب مع E3 التي تحتوي على مرض التصلب العصبي المتعدد-222.
4-إعداد PDMS أجهزة تصوير
- لجعل الأجهزة قابلة للاستخدام، يلقي PDMS، استخدام رقاقة رئيسية كقالب. الجمع بين 50 جرام مونومر PDMS مع 5 غ من البادئ (نفس المستخدمة في الخطوة 2، 1) ومزيج دقيق في بلاستيك وزنها الطبق مع شوكة بلاستيكية.
- صب الخليط بعناية أكثر من العفن.
- ديغا في مجفف فراغ في إينهج 16-25 (54-85 كيلو باسكال) ح 1.
- لعلاج PDMS، خبز عند 65 درجة مئوية على الأقل 3 ح. ينبغي علاج PDMS إلى مادة صلبة ثابتة ولكنها مرنة.
- قطع الأجهزة من يفر الرئيسي ولكمه على منافذ باستخدام لكمه 1.5 مم.
- علاج الأجهزة وزجاج 6-جيدا-قاع لوحة جيدا مع الأكسجين في البلازما ل 35 s، كما هو موضح في الخطوة 2، 6.
- السندات واحد الجهاز ميزة الجانب-لأسفل لكل ساترة زجاج لوحة 6-جيدا بوضعه في هوتبلت 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: لتأكيد الترابط الناجح، تطبيق الضغط الثابت إلى جانب واحد من الجهاز المرتهن باستخدام الملقط. ينبغي أن يظل الجهاز المرفقة إلى ساترة زجاجية.
5-الزرد الثقافة
- الثقافة الزرد الأجنة إلى 2 إدارة الشرطة الاتحادية باستخدام التقنيات القياسية3.
- مزيج الأجنة ديتشوريوناتي استخدام الملقط أو 1 مغ/مل مبطلات (انظر الجدول المواد)3 على الأقل 30-60 دقيقة قبل تحميلها على الجهاز، للسماح لهم بتصويب.
- تخدير الأجنة استخدام الحل (168 مغ/لتر) مرض التصلب العصبي المتعدد-222 (درجة الحموضة 7.5) بإضافة 1 مل 25 X الأسهم إلى E3 في طبق بتري بهم.
6-توجه الزرد على سطح ميكروستروكتوريد-صفائف ديفت
- إعداد كتلة PDMS من الخطوة 2.7 (الشكل 3A) في طبق بتري به أن كان مغطى بطبقة رقيقة (1-2 مم) من E3، مما يتيح سهولة التلاعب بالأجنة.
- نقل العدد المطلوب من الأجنة (عادة 10-20 كل الظروف) على سطح كتلة PDMS استخدام ماصة نقل.
- باستخدام أداة ميكرومانيبوليشن (حلقة الشعر أو ما شابه ذلك)، دفع الأجنة في ديفوتس ميكروستروكتوريد (الشكل 3A). استخدام ديفوتس مناسبة خاصة لتوجهات الظهرية والبطني.
ملاحظة: ديفوتس مع أشد تناسب (الظهري والبطني)، حاول الأجنة لتحديد المواقع على سطح الكتلة بالتوازي مع ديفت، والمتداول ثم منها إلى موضع استخدام حلقة شعر. دفعهم أعمق في ديفوت ستساعد على إبقائها مستقرة.
7-توجه الزرد على سطح ميكروستروكتوريد-قنوات ميكروستروكتوريد
- رسم E3 قبالة كتلة PDMS منقوشة مع قنوات ميكروستروكتوريد (الشكل 3B) باستخدام ماصة نقل حتى مستوى E3 يسقط تحت حافة الكتلة، ولكن لا تزال موجودة في الخزان والقنوات وفي طبقة رقيقة على PDMS.
- نقل الأجنة 10 من الخطوة 5.3 إلى الخزان باستخدام ماصة نقل، مع الحرص على عدم تجاوز الحواف.
- استخدام حلقة شعر، التعامل مع كل جنين إلى القمع عند مدخل القناة الملائمة وتوجيه رأس الجنين اتجاه القناة والجنين بالاتجاه المناسب لأنه يدخل القناة.
- حرك كل الجنين إلى أسفل القناة باستخدام حلقة شعر حتى تصل إلى ميكروفيتوريس توجه في جدران القناة التي تساعد على الاحتفاظ به في مكان. يوصي باستخدام القنوات ميكروستروكتوريد خاصة للاتجاه الأفقي.
ملاحظة: للحد من انزلاق أثناء microinjection الجنين، حاول ضبط مقدار التوتر السطحي بالرسم E3 من الخزان.
8-microinjection الزرد
-
إعداد إبرة microinjection.
- جعل الإبر ميكروكابيلاري البورسليكات الزجاج باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي كما هو موضح سابقا4. ينبغي مدبب الإبر الناتجة إلى نقطة نهاية واحدة، تفتق طولها حوالي 10 مم.
- إعداد الحل بالحقن، في هذه الحالة 100 نانومتر chemoattractant (N-فورميلميثيونيني-لوسيل-فينيلالاناين (فملب) أو Leukotriene B4 (LTB4)) و 100 نانومتر من 70 كاتشين والرودامين ديكستران الراسم في برنامج تلفزيوني.
- تحميل 5 ميليلتر من الحل في إبرة ماصة مدبب ناعما استخدام تلميح (انظر الجدول المواد).
- جبل الإبرة في ميكرومانيبولاتور التي شنت على الوقوف مغناطيسية ومتصلا ميكروينجيكتور بيكوبومب.
- كسر غيض الإبرة بزاوية 45 درجة معسر طرف مدبب مع الملقط.
- ضبط حجم بلعه حقن 1 nL بضبط الوقت الحقن على وحدة تحكم بيكوبومب.
- قم بضبط زاوية إبرة microinjection. عموما بإبرة زاوية 45 ° على وحدة تحكم ميكرومانيبوليشن نقطة انطلاق جيدة، مع الإبرة موازية لطول الجنين. يمكن استخدام زاوية انحدارا لتقليل الحركة الجانبية للجنين أثناء microinjection.
- السيطرة على طبق بيتري مع اليد اليسرى وميكرومانيبولاتور إبرة مع الحق، جلب الإبرة أقرب قدر الإمكان إلى الموقع المقصود من microinjection، في هذه الحالة حويصلة عتيق.
ملاحظة: يمكن تحديد حويصلة عتيق هيئة مستطيل الخلفي للعين التي تحتوي على أصغر متميزة الظلام مستطيل هيكلين (أوتوليثس). - باستخدام وحدة تحكم ميكرومانيبوليشن، اختراق الأنسجة المستهدفة (في هذه الحالة حويصلة عتيق) يكون طرف الإبرة داخل حويصلة، وحقن وحدة التخزين مسبقاً باستخدام رمز التبديل بيكوبومب سيرا على الأقدام.
ملاحظة: إذا كان النسيج يقاوم الاختراق، حاول بلطف التنصت على مقبض تحكم ميكرومانيبوليشن. - للإفراج عن الأجنة، تدفق E3 على السطح من أعلى إلى أسفل باستخدام ماصة نقل، أو بواسطة يحوم الطبق مثل أن يتم الإفراج عن الأجنة في E3 المحيطة بها.
- نقل الأجنة إلى طبق انتعاش من E3 دون استخدام ماصة نقل مرض التصلب العصبي المتعدد-222.
9-فحص أجنة PDMS جهاز التصوير باستخدام
- رئيس الجهاز من الخطوة 4.7 تتدفق E3 (+ مرض التصلب العصبي المتعدد-222) عن طريق المنفذ. هذا يمكن أن يتم استخدام ماصة ميليلتر 1,000 أو ماصة نقل تلميح ضيق.
- سد البئر مع E3 + مرض التصلب العصبي المتعدد-222 حتى يتم تغطية الجهاز.
- تسليم 4 حقن الأجنة من الخطوة 8.7 في كل جيدا باستخدام ماصة نقل. يمكن أن تكون الأجنة قبل أنيسثيتيزيد إذا رغبت بحضانة في E3 + مرض التصلب العصبي المتعدد-222 لمدة 1-2 دقيقة قبل تحميل (الخطوة 5، 3).
- باستخدام أداة ميكرومانيبوليشن (حلقة الشعر أو ما شابه ذلك)، وتوجيه الأجنة عند مداخل القنوات التصوير في الاتجاه المطلوب (الذيل الأول أو رئيس--أولاً، اعتماداً على الجهاز المستخدم)، ودفعهم جزئيا إلى الجهاز (الشكل 4 أ). هذا سوف يساعد في رسم لهم في الجهاز بالتساوي.
- رسم E3 من خلال الجهاز من المنفذ باستخدام 1,000 ميليلتر ماصة أو ماصة نقل حتى يتم رسمها الأجنة في القنوات في التوجه الصحيح للتصوير (الشكل 4 باء).
ملاحظة: كن حذراً حتى لا تمتص الأجنة في الماضي هذه النقطة الملائمة، وهذا سوف يضر الأجنة وتغيير اتجاهها. - نقل لوحة جيدا بالمجهر للتصوير (الشكل 4).
-
صورة باستخدام مجهر فلوري مقلوب.
- ضبط التكبير عن طريق اختيار العدسة المناسبة. 10 X عادة تكبير مفيدة للتصوير الزرد هجرة العَدلات.
- ضبط كثافة مصدر الضوء ووقت التعرض لكل قناة حيث يكون كل إشارة واضحة، ولكن غير المشبعة.
- التقاط صور لكل قناة. هنا، يمكننا استخدام البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء، السابقين: م 470/22،: 525/50)، "تكساس الأحمر" (تكسريد، السابقين: 585/29، م: 628/32) وأحال القنوات. ويمكن الجمع بين الصور الأقنية خلال مرحلة ما بعد المعالجة (الشكل 4 باء--أنا).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النهج المذكور هنا يدل على التصميم (الشكل 1) وتصنيع الأجهزة للاستخدام مع 2 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد، استخدام تقنيات (الشكل 3) لينة معدني وفوتوليثوغرفيك (الشكل 2). يسمح هذا الأسلوب لاختبار السريع العديد من التكرارات التصميم والتعديلات، والتعديلات والأمثل للأبعاد المجهرية للاستخدام مع الزرد في مراحل أخرى من التنمية، ويمكن توسيع نطاق تطبيقها.
علينا أن نظهر استخدام هذه الأجهزة لتحدي microinjection تقنيات وتصوير مريحة. حويصلة عتيق (الشكل 4، أبيض مخطط تفصيلي متقطع) يوفر موقع المفيد والمميز المناعي ومعزولة لاختبار تجنيد العَدلات في الزرد9. لاختبار قدرة العَدلات الزرد للاستجابة لمعيار تشيمواتراكتانتس، 100 نانومتر فملب و LTB4 تم ميكروينجيكتيد إلى الحويصلات عتيق 2 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد الأجنة (4F الشكل، ي)، باستخدام جهاز قناة ميكروستروكتوريد ( الشكل 1) لتثبيت الأجنة في الاتجاه الأفقي. حقن تتبع مع ارتفاع الوزن الجزيئي ديكستران والرودامين، وأداؤها في الأجنة Tg(mpx:EGFP) لتسهيل التصور لتجنيد العَدلات. أونينجيكتيد والأجنة (الشكل 4، ح) أجنة حقن والرودامين وحدها (4E الشكل، وأنا) كانت تستخدم كعناصر سلبية. عقب microinjection، نقلوا إلى جهاز قناة الصور (الشكل 1 أ، ب) الأجنة وتصويرها باستخدام أفوس مجهر فلوري (الشكل 4) في 30 دقيقة وحقن وظيفة ح 5 (الشكل 4-G و الشكل 4 حك، على التوالي). كما هو متوقع، عدد صغير من العَدلات نيون إضافيون لحويصلة عتيق حقنت وهمية في تيميبوينت المبكر (الرقم 4I)، يرجح أن سبب الضرر بوساطة التوظيف. من المثير للاهتمام، والتتبع ديكستران والرودامين لوحظ أن تتراكم في أوتوليثس أثناء التجربة. لكلا تشيمواتراكتانتس (الرقم 4F, J)، تم تعيين العَدلات في أرقام أعلى، وبصفة خاصة ردا على LTB4 (4F الشكل).
وتبين النتائج الممثل هو موضح هنا الاستخدام الناجح لهذا الأسلوب microinjection والتصوير من الزرد. في سياق فحوصات تجنيد العَدلات الزرد، تطبيق هذه الأدوات في تركيبة مع تقنيات التصوير حية تفصيلية و تحليل الهجرة الخلية المتطورة10 قد توفر منبرا مفيداً للتجارب المستقبلية في هذا المجال.
رقم 1: مساعدة الحاسوب الرسم (كندي) تصميم الأقنعة التصويرية. (أ-ج) تصميم كندي ميكروستروكتوريد ديفوتس السطحية لتحديد المواقع في جانبية (A) والبطني (ب)، والظهريه (ج) التوجهات. خطوط ملونة مختلفة تمثل تصاميم قناع كندي لميزات مختلفة، مع الأخضر 100 ميكرومتر، الأزرق 200 ميكرومتر، ومرتفعات ميزة 400 ميكرون أحمر. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (د-F) تصميم كندي للقنوات ميكروستروكتوريد لتحديد المواقع في جانبية (د) والبطني (E)، والظهريه (F) التوجهات. خطوط ملونة مختلفة تمثل تصاميم قناع لميزات مختلفة، مع الأخضر 100 ميكرومتر، الأزرق 200 ميكرومتر، ومرتفعات ميزة 400 ميكرون أحمر. مقياس بار: 500 ميكرومتر. (ز--أنا) تصميم CAD للتصوير الأجهزة المصممة لتحميل الرأس-أول (ز) أو الذيل-أول (حاء وطاء). الخطوط الزرقاء تمثل 400 ميكرون الميزات، بينما تمثل الخطوط الحمراء 600 ميكرون الميزات. تبين الأسهم اتجاه اليرقات التي يتم تحميلها. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من إليت et al. 5 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: رقاقة سيليكون الرئيسي- (أ) القسم العلوي ليفر الرئيسي يظهر الميزات لتوجيه اليرقات الفردية في ديفوتس. (ب) أسفل المقطع ليفر الرئيسي عرض التصميم للقنوات ميكروستروكتوريد. وقد تم تعديل هذا الرقم من إليت et al. 5 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: أجهزة PDMS ميكروستروكتوريد- (أ) PDMS كتلة المدلى بها من يفر الرئيسي عرض ديفوتس لتوجيه اليرقات الفردية. (ب) PDMS كتلة المدلى بها من يفر الرئيسي عرض القنوات ميكروستروكتوريد. وقد تم تعديل هذا الرقم من إليت et al. 5 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: نتائج تمثيلية: التصوير تجنيد العَدلات الزرد عقب تسليم microinjection من تشيمواتراكتانتس إلى حويصلة عتيق. (أ-ب) تحميل وتركيب أجنة للتصوير. (أ)-أول الرئيس الجهاز مع الأجنة جاهزة للتحميل، مع منفذ المشار إليه (السهم الأسود). (ب) تحميل الأجنة بعد أنهم انتقلوا إلى موقف (السهم الأصفر). (ج) 6-كذلك الزجاج-أسفل لوحة مع التصوير أجهزة المجهر. يسمح هذا التنسيق التصوير 4 جانبياً الموجهة لاجنة كل بئر (مجموع الأجنة 24)، باستخدام مجهر مقلوب قياسية. (د-ز) العَدلات (اجفب-الأخضر) أونينجيكتيد (د) الجنين وبالتالي حويصلة عتيق microinjection من والرودامين ديكستران (أحمر، وفتح السهم الأبيض) وحدها (E)، 100 نانومتر LTB4 (F)، وشمال البحر الأبيض المتوسط 100 فملب (ز) 30 دقيقة بعد الحقن (mpi). (ح-ك) العَدلات (اجفب-الأخضر) في جنين (ح) أونينجيكتيد و 5 ح عقب حويصلة otic microinjection من والرودامين ديكستران (أحمر، وفتح السهم الأبيض) وحدها (أنا) 100 نانومتر LTB4 (J)، وشمال البحر الأبيض المتوسط 100 فملب (ك) ح 5 وظيفة حقن ( hpi). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يمكننا وصف الاستخدام الأجهزة وضعنا مؤخرا تيسير إدارة الشرطة الاتحادية 2 الزرد microinjection5، وإدخال جهاز بسيط تركيب مجاناً [اغروس] لتصوير مريحة للأجنة. وتبرز هذه الأدوات الأداة المساعدة فوتوليثوغرفيك تقنيات تصنيع الأجهزة مفيدة لتقنيات الزرد.
أننا وجدنا الأجهزة بدل مفيدة بشكل خاص لحقن الخلايا أو الجزيئات المعرضة للتجميع داخل الإبرة microinjection، مثل كونيديا الفطرية أو الخلايا السرطانية البشرية، التي تتطلب استخدام إبرة تحمل أكبر للتسليم. حقن في حويصلة عتيق (الشكل 4) يمثل تحديا خاصا، الأجنة لفة غالباً عند الاتصال مع الإبرة. فإننا نجد أن استخدام القنوات ميكروستروكتوريد التي توجه واستقرار الزرد في جانبية اتجاه تحسن كبير في كل من الإنتاجية والدقة لهذا الأسلوب في أيدينا.
للتصوير السريع من الزرد أفقياً المنحى في نقاط زمنية مختلفة، مثل تقييم لتجنيد العَدلات أو xenograft خبيث، تجنب [اغروس] زيادة الاتساق المتصاعدة بين الأجنة وانخفاض احتمالات الضرر أثناء بعد انتهاء التصوير الإنقاذ. هذه الأجهزة أيضا إظهار الوعد لتصوير انقضاء فترة زمنية ممتدة، وقد استخدمت بنجاح التقاط صور متعددة القنوات، مولتيبلاني مع حركة السمك الأدنى أكثر من 12 ح. نظراً لأنها مقيدة لا بسبب [اغروس]، استطالة النشطة لليرقات خلال هذه الفترة (~ 300 ميكرون من هبف 54-78)11 غير مقيد ويمكن متابعة عادي.
الخطوات الأكثر أهمية في إعداد واستخدام هذه الأدوات شائعة لاستخدام معظم أجهزة موائع جزيئية PDMS على أساس: يجب أن تكون الأجهزة ترطب جيدا وتجنب الفقاعات. لتجنب هذه المشاكل، الرطب الأجهزة في E3 فورا بعد أنها ملفقة، بينما hydrophilicity السطحية التي يمنحها الأوكسجين البلازما المعاملة لا تزال موجودة. أيضا يمكن إعادة المعالجة بالأكسجين البلازما عابر استعادة هيدروفيليسيتي للمسنين PDMS الأجهزة.
الهندسات الدقيقة المستخدمة هنا الاستفادة من دقة عالية من تقنيات فوتوليثوغرفيك، ولكن استخدام حد التصاميم الحالية إلى الزرد أثناء إخصاب بعد انتهاء اليوم الثاني. إعادة تصميم الهندسيات استناداً إلى النظام الأساسي الحالي سيسمح نجاح التوجه 1 إدارة الشرطة الاتحادية وإدارة الشرطة الاتحادية 3 ل microinjection. أن التوجه لليرقات إدارة الشرطة الاتحادية 4 أكثر ازدهارا مع تضخم السباحة قرب يرجح أن تكون أكثر صعوبة، وتتطلب الهندسات دافئ في تركيبة مع ارتفاع حدة التوتر في المياه. أجهزة معقدة دمج تدفق أو فراغ قد يوفر نهج بديل تنطبق على نطاق أوسع من مراحل النمو، ولكن يتطلب أيضا استخدام مضخات وأنابيب، تزايد تكاليف ومخاطر فشل الجهاز.
PDMS مادة فعالة من حيث التكلفة، ومفيدة لاختلاق أجهزة مثل تلك الموضحة هنا، توفير توافق مع الحياة، والشفافية، وإعادة استخدام. عيب واحد من استخدام أجهزة PDMS لالزرد هو هيدروفوبيسيتي، التي يمكن أن تجعل الحفاظ على الطبقات الضحلة من E3 على سطح الجهاز صعبة. يمكنك تجنب هذه المشكلة بصب الأجهزة microinjection في [اغروس]، على الرغم من أن هذا يحد من إعادة استخدام ويزيد من هشاشة الأجهزة. وسيكون بديلاً مفضل تحديد متوافق حيويا في المعاملة السطحية أن الزيادات hydrophilicity PDMS12، أو استخدام الركيزة بلاستيكية مناسبة.
استخدام الأساليب الحالية ل microinjection الزرد في إدارة الشرطة الاتحادية 2 أما التوتر المياه4 أو يلقي قنوات بسيطة في [اغروس] استخدام القوالب التجارية لشل وموقف اليرقات. هذه النهج توفير رقابة محدودة للتوجه ويمكن أن تكون معقدة التجفيف السريع للأجنة. المجهرية تدمج ديفوتس والقنوات المستخدمة هنا تهدف إلى توجيه وشل اليرقات دون الاعتماد كلياً على التوتر المياه، مما يقلل من الخطر للتجفيف. ديفوتس باستخدام قوالب المطبوعة 3D سابقا قد استخدمت للتوجه للأجنة ل أغراض التصوير13، على الرغم من عمق هذه ديفوتس جعلها غير قابلة للوصول ل microinjection.
استخدام نظم موائع جزيئية لتصوير الزرد أصبحت شائعة بشكل متزايد14.
وقد وضعت أنظمة متعددة من خلال تدفق للسماح بمراقبة التنمية الزرد على مر الزمن مع القدرة على إدخال المركبات على الطلب15،،من1617. قد صممت أجهزة أكثر تعقيداً للأجنة الصفيف بينما لا يزال داخل هذه المشيمة، التي تنص هندسة كروية بسيطة التي يمكن التلاعب بها بسهولة مع الإنتاجية العالية نسبيا في هذه النظم18،19. ووضعت عدة مجموعات منصات أرايينج والتصوير الزرد مرحلة اليرقات في مختلف التوجهات6،20، يجري الأكثر استعمالا ميكروبومب السلبي مدفوعة "زيبرا" نظام تطوير مختبر بيب6 . خلافا لنظام وحشي، يستخدم الجهاز الذي يصف لنا هنا الشفط، والذي تم إنشاؤه باستخدام ماصة نقل قياسية، رسم اليرقات في القنوات، أثناء تحميل متوازية بدلاً من أن تكون متسلسلة من اليرقات يسمح الإنقاذ يرقات الفردية بعد انتهاء التصوير تطبيق تدفق إيجابي عن طريق نفس المنفذ. وعلاوة على ذلك، يتطلب نهجنا بصمة أصغر، حيث يمكن المستعبدين الأجهزة PDMS إلى أسفل الزجاج التقليدية 6-جيدا لوحات للتصوير.
التصميم التجريبي الحالي يستخدم أجهزة منفصلة ل microinjection والتصوير أساسا حيث أنه يمكن استخدامها مع المعدات التقليدية microinjection ومعيار مقلوب مجاهر. النهج موائع جزيئية للألى microinjection البيض الزرد الفعل توجد21، وفي تركيبة مع "الأسماك-فخ" نوع الأساليب لدرجة عالية من الدقة أرايينج والتوجه لليرقات20، فمن المنتظر أن الأجهزة دمج حقن اليرقات الآلي والتصوير قد أيضا يوم واحد يصبح حقيقة واقعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر لانجينو ديفيد لسخاء توفير مساحة الحوض؛ إريك ستون، جون مور جيم وتشين تانغ للمساعدة في صيانة الزرد والكواشف، وروبرتسون أن واليوت Hagedorn من مختبر ليونارد زون لشراء سلالة الزرد المستخدمة هنا. كما أنها يود أن يشكر هورتادو أوكتافيو لتقديم المشورة بشأن التقنيات فوتوليثوغرفيك. مولت FE زمالات من مستشفى شرينير للأطفال و "الرابطة الأسترالية الأمريكية". تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة منح GM92804.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI - 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
