Summary
Mikroskop av zebrafisk embryon och yngel är en avgörande men utmanande teknik som används i många zebrafiskar modeller. Här presenterar vi en rad hur provtagningsutrustningen skall verktyg till stöd i stabiliseringen och orientering av zebrafisk för både Mikroskop och imaging.
Abstract
Zebrafisk har dykt upp som en kraftfull modell av olika mänskliga sjukdomar och ett användbart verktyg för ett ökande utbud av experimentella studier, som spänner över grundläggande utvecklingsbiologi genom att storskaliga genetiska och kemiska skärmar. Dock lita många experiment, särskilt de som rör infektion och xenograft-modeller, på Mikroskop och avbildning av embryon och yngel, som är mödosam tekniker som kräver skicklighet och sakkunskap. För att förbättra precisionen och genomströmning av nuvarande Mikroskop tekniker har vi utvecklat en serie microstructured enheter att orientera och stabilisera zebrafiskar embryon på 2 dagar efter befruktning (dpf) i ventrala, dorsal, eller lateral riktning före den förfarandet. För att underlätta bildtagning av embryon, har vi också utformat en enkel anordning med kanaler som orienterar 4 zebrafiskar sidled parallellt mot ett glas täckglas. Tillsammans, visar de verktyg som vi presenterar här effektiviteten av photolithographic metoder att generera användbar enheter för optimering av zebrafisk tekniker.
Introduction
Zebrafisk har tillkommit som en kraftfull modell för många områden, från studier av grundläggande utvecklingsbiologi till storskaliga genetiska och kemiska skärmar1,2. Rutinmässiga genetiska manipulationer, som genen överuttryck, överväldigande, CRISPR/Cas9 mutagenes och genmodifiering lita på Mikroskop av genetiskt material i encelliga zygoten, vilket har lett till utvecklingen av enkel, lätt att använda, kommersiellt tillgängliga verktyg för orientering och stabilisera ägg för injektion3. Andra metoder, såsom transplantation och infektion, kräver ofta Mikroskop i senare skede embryon och yngel med större spårvidd kapillär nålar4. Användning av större spårvidd nålar presenterar emellertid betydande tekniska utmaningar, eftersom det är svårare att tränga igenom målvävnaden utan driver eller rullande embryot. Under dessa förhållanden kanske att erhålla lämpligt vatten spänning krävs för att stabilisera embryot samtidigt undvika torkning under förfarandet är svårt, och embryon inte idealiskt orienterad för injektion i målvävnaden.
Efter Mikroskop är det ofta användbart att skärmen injicerade embryon att välja de som framgångsrikt har injicerats, och ta bilder av den första tidpunkten. För att möta dessa utmaningar, har vi utvecklat en rad microstructured enheter som hjälper till att stabilisera 2 dpf embryon i olika riktningar Mikroskop5, såväl för snabb image-baserad screening efter injektion.
För att erhålla tillräcklig strukturell upplösning i dessa enheter, utnyttjade vi photolithographic tekniker. Vanligen används i mikroelektroniska industrier och mer nyligen extrapoleras till mikroflödessystem fabrication, kan dessa synsätt uppnå vertikala strukturer som sträcker sig från 1-1000 µm, en skala som väl lämpade för manipulation av zebrafisk embryon och yngel. Alla enheter var fabricerade med hjälp av Polydimetylsiloxan (PDMS), vilket är billigt, fysiskt robust, biologiskt inert och transparent.
Microstructured yta matriser (MSAs) var formaterade som block av PDMS med en mönstrad topp yta, analogt med de enkla kanalerna i agaros block används vanligen för ägg Mikroskop. För efter injektion screening, kan 6 imaging-enheter vara klädd i ett glas botten 6-väl Kantbockade. Dessa enheter är konstruerade för enkel lastning av embryon, medan förfarandet för lossning kan bekvämt räddning av specifika embryon, underlätta image-baserad screening metoder på ett mer användarvänligt sätt än dessa enheter tidigare utvecklats av den Beebe laboratorium6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mikroskop av larver godkändes av Massachusetts allmänt sjukhus underutskottet forskning djur vård under protokoll 2011N000127.
1. anordning tillverkning
Obs: Alla datorstödd ritning (CAD) filer används för att utforma photolithography masker beskrivs här (figur 1) är tillgänglig för nedladdning. Se tabell för material för länkar.
- Fabricera herre mögel rånet i renrum klass 1000 använder standardtekniker photolithographic7. Mikrostruktur matriser och kanaler, mönster av epoxy-baserat negativa fotoresist sekventiellt i 3 lager med 3 separata masker, enligt tillverkarens instruktioner: 100 µm för grunt funktioner, 200 µm för medelstora funktioner och 400 µm för de djupa funktionerna. För bildenheten lager mönster två med 400 µm för grunt funktioner och 600 µm för djupa funktioner.
- Tejpa avslutade rånet på basen av en 15 cm petriskål för gjutning (figur 2).
2. förberedelse av Microstructured yta matriser - PDMS
- För att göra användbara enheter, gjutna Polydimetylsiloxan (PDMS), använder master rånet som gjutform. Kombinera 50 g av PDMS monomer med 5 g initiativtagare och blanda i en plast som väger maträtt med en plast gaffel.
- Häll blandningen försiktigt över formen.
- Degas i vakuum exsickator på 16-25 inHg (54-85 kPa) för 1 h.
- För att bota PDMS, grädda på 65 ° C i minst 3 tim. PDMS bör bota till en fast men flexibel solid.
- Skär försiktigt runt enheten på master rånet med hjälp av en skalpell, se till att upprätthålla kontakten mellan spetsen på skalpell och wafer ytan. Med pincett, skala PDMS repliken från rånet och överföring till en ren 10 cm petriskål, funktionen sida upp (figur 3).
- Behandla enheten med syre plasma med en plasma ugn för 35 s att minska vattenavvisande egenskaper.
- Täck med zebrafiskar embryo medium (E3) innehållande 168 mg/L av etyl 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5). Ta bort alla bubblor från djupare funktioner av strömmande vatten över ytan av enheten med överföring pipett.
3. förberedelse av Microstructured yta matriser - agaros
- För att göra en negativ PDMS-mögel, först behandla en PDMS enhet med syre plasma.
-
Behandla PDMS enheten med 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silan vapor att skapa en inert yta8. Kortfattat:
- Plats i PDMS vara behandlade funktionen-side-up i en vakuumkammare inom ett dragskåp.
- Bredvid PDMS, placera en liten öppen glas eller aluminium maträtt och noggrant Pipettera 200 µL av PFDTS (98% silan) i skålen.
Varning: PFDTS silan är mycket flyktiga, reagerar våldsamt med vatten, är brandfarligt och orsakar allvarliga hud- och skador på kontakt. Läs säkerhetsdatablad i detalj före användning. - Stänga vakuumkammare och tillämpa vakuum i 15-30 min eller tills den PFDTS silan är helt avdunstat.
- Placera enheten i en petriskål och använda som gjutform för färska PDMS, bereds enligt anvisningarna i steg 2.1-2.3.
- Baka på 65 ° C i minst 3 tim och sedan skal hela lagret av färska PDMS från behandlade enheten och placera i en färsk petriskål. Detta kan sedan användas som negativa gjutform för att gjuta agaros.
- För att förbereda agaros, koka en 2% lösning av låg gelbildande temperatur agaros i E3 i mikrovågsugn tills Agarens är helt upplöst.
- Häll den heta agarosen över PDMS negativa formen och ta bort eventuella bubblor i Agarens hela enheten av flödande varma agaros över funktionerna med överföring pipett.
- När bubblorna tas bort, kylskåp vid 4 ° C ställa Agarens.
- Ta bort blocket agaros från negativa PDMS mögel genom att deformeras PDMS från undersidan för hand, överföra agaros blocket till en ny petriskål och våt med E3 som innehåller MS-222.
4. beredning av PDMS bildenheter
- För att göra användbara enheter, gjutna PDMS, använder master rånet som gjutform. Kombinera 50 g av PDMS monomer med 5 g initiator (samma som används i steg 2.1) och blanda noga i en plast som väger maträtt med en plast gaffel.
- Häll blandningen försiktigt över formen.
- Degas i vakuum exsickator på 16-25 inHg (54-85 kPa) för 1 h.
- För att bota PDMS, grädda på 65 ° C i minst 3 tim. PDMS bör bota till en fast men flexibel solid.
- Skär enheterna från Master rånet och stansa ut portar med en 1,5 mm punch.
- Behandla enheterna och en 6-väl glasbotten väl platta med syre plasma för 35 s, som beskrivs i steg 2,6.
- Bond en enhet funktion-och-ner till varje täckglas av 6-väl plattan genom att placera det på en 85 ° C värmeplatta i 10 min.
Obs: För att bekräfta lyckad limning, gäller fast tryck på ena sidan av bonded enheten med hjälp av tången. Enheten bör vara fäst vid täckglaset.
5. zebrafiskar kultur
- Kultur zebrafiskar embryon till 2 dpf med standardtekniker3.
- Dechorionate embryon med pincett eller 1 mg/mL proteas blanda (se material tabell)3 minst 30-60 minuter före lastning på enhet, att tillåta dem att räta ut.
- Bedöva embryon med (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) genom att tillsätta 1 mL 25 X stamlösning till E3 i deras petriskål.
6. läggning av zebrafisk på Microstructured yta - Divot matriser
- Förbereda PDMS blocket från steg 2,7 (figur 3A) i dess petriskål så att det täcks av ett tunt (1-2 mm) lager av E3, som gör lättare manipulation av embryon.
- Överföra erforderligt antal embryon (i allmänhet 10-20 per skick) på ytan av PDMS blocket med överföring pipett.
- Använda ett verktyg för mikromanipulation (hår slinga eller liknande), tryck in embryon i de microstructured divots (figur 3A). Användning av divots är särskilt lämpad för rygg- och ventrala riktlinjer.
Obs: För divots med en tätare passform (dorsala och ventrala), prova positionering embryona på ytan av blocket parallellt med divot, och sedan rulla dem i position med hjälp av en hår slinga. Driver dem djupare in i divot hjälper till att hålla dem stabila.
7. läggning av zebrafisk på Microstructured yta - Microstructured kanaler
- Tappa E3 av PDMS blocket mönstrad med microstructured kanaler (figur 3B) med överföring pipett tills nivån på E3 sjunker under kanten på blocket, men finns kvar i behållaren och kanaler och i ett tunt lager på PDMS.
- Över 10 embryon från steg 5.3 i behållaren med överföring pipett, vara noga med att inte svämma över kanterna.
- Använda en hår slinga, manipulera varje embryo till tratten vid infarten till rätt kanal och rikta så att chefen för embryot är mot kanalen och embryot har lämplig orientering som det går in i kanalen.
- Dra varje embryo ner kanalen med en hår slinga tills den når den orientering microfeatures i kanal väggar som hjälper till att hålla den på plats. Användning av microstructured kanaler rekommenderas särskilt för laterala orientering.
Obs: För att minska embryo glider under Mikroskop, prova att justera mängden ytspänning genom att rita E3 från reservoaren.
8. Mikroskop av zebrafisk
-
Förbereda Mikroskop nål.
- Gör borosilikatglas microcapillary nålar med en mikropipett avdragare som tidigare beskrivits4. De resulterande nålarna bör vara avsmalnande till en punkt i ena änden, med en Kona längd av ca 10 mm.
- Beredning av lösningen injiceras, i detta fall 100 nM korrektiv (N-Formylmethionine-leucyl-fenylalanin (fMLP) eller leukotrien B4 (LTB4)) och 100 nM 70 kDa rodamin dextran spårämne i PBS.
- Läsa in 5 µL lösning i nålen med fint avsmalnande pipett (se material tabell).
- Montera nålen i en micromanipulator monterad på en magnetisk stå och ansluten till en picopump microinjector.
- Bryta spetsen av nålen i 45 ° vinkel genom att nypa den avsmalnande spetsen med pincett.
- Justera injektion bolus storlek till 1 nL genom att justera den injektion tid på picopump controller.
- Justera vinkeln på Mikroskop nålen. En nål i 45 ° vinkel på mikromanipulation handkontrollen är i allmänhet en bra utgångspunkt, med nålen parallellt med längden på embryot. En brantare vinkel kan användas för att minimera laterala rörelse av embryot under mikroskop.
- Styra petriskål med vänster hand och den nål micromanipulator med rätt, ta nålen så nära som möjligt till den avsedda platsen för Mikroskop, i detta fall den öron vesikler.
Obs: Den öron vesikler kan identifieras som avlånga orgeln posteriort ögat innehållande två mindre distinkta mörka avlånga strukturer (öronstenarna). - Använda mikromanipulation controller, penetrera målvävnaden (i detta fall den öron vesikler) så att spetsen på nålen är inom vesikler och injicera den förinställda volym användande picopump fotpedalen.
Obs: Om vävnaden motstår penetration, prova försiktigt knacka mikromanipulation controller ratten. - För att frigöra embryona, flöde E3 över ytan från topp till botten med överföring pipett eller genom virvlande skålen så att embryona släpps ut i den omgivande E3.
- Överföra embryon till en återhämtning maträtt av E3 utan MS-222 med överföring pipett.
9. screening av embryon med hjälp av PDMS Imaging enhet
- Prime enheten från steg 4,7 av flödande E3 (+ MS-222) via porten. Detta kan göras med antingen 1000 µL pipett eller smal-tips överföring pipett.
- Fyll borrhålet med E3 + MS-222 tills enheten är täckt.
- Leverera 4 injicerade embryon från steg 8,7 till varje brunn med överföring pipett. Embryon kan vara pre sövda om så önskas genom ruvning i E3 + MS-222 för 1-2 min före lastningen (steg 5.3).
- Använda ett verktyg för mikromanipulation (hår slinga eller liknande), orient embryon vid ingångarna imaging kanaler i önskad orientering (svans-första eller huvudet först, beroende på vilken enhet som används) och driva dem delvis i enheten (figur 4A). Detta hjälper dra dem in i enheten jämnt.
- Dra E3 genom enheten från porten med 1000 µL pipett eller överföring pipett tills embryona dras in i kanalerna i rätt riktning för imaging (figur 4B).
Obs: Var noga med att inte suga embryona förbi den svällning punkten, detta kommer att skada embryon och förändra sin läggning. - Överföra väl-platta till Mikroskop för imaging (figur 4 c).
-
Bild med en inverterad fluorescerande Mikroskop.
- Justera förstoringen genom att välja lämpliga linsen. 10 X är vanligtvis en användbar förstoring för imaging zebrafiskar neutrofila migration.
- Justera ljuskällan intensitet och exponeringstid för varje kanal så att varje signal är tydlig, men inte mättade.
- Fånga bilder för varje kanal. Här använde vi grönt fluorescerande protein (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) och överförs kanaler. Flerkanals bilder kan kombineras under efterbehandlingen (figur 4B-jag).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metod som beskrivs här visar design (figur 1) och tillverkning av utrustning för användning med 2 dpf zebrafiskar, med photolithographic (figur 2) och mjuka-Konstlitografiska (figur 3) tekniker. Denna metod tillåter snabb testning av många design iterationer och modifieringar och ombyggnader och optimering av mikrostrukturen dimensioner för användning med zebrafiskar på andra stadier av utveckling kan förlänga deras ansökan.
Vi demonstrera användningen av dessa enheter för utmanande Mikroskop tekniker och bekväm imaging. Den öron vesikler (figur 4 d, vit streckad kontur) ger en användbar, immun-privilegierade och isolerade webbplats för att testa neutrofila rekrytering i zebrafiskar9. För att testa zebrafiskar neutrofiler förmåga att svara på standard chemoattractants, 100 nM fMLP och LTB4 var microinjected i de öron vesikler 2 dpf zebrafiskar embryon (figur 4F, J), använder microstructured kanal enheten ( Figur 1 g) att stabilisera embryon i laterala orientering. Injektioner var spåras med hög molekylvikt rodamin dextran, och utförs i Tg(mpx:EGFP) embryon att underlätta visualisering av neutrofila rekrytering. Uninjected embryon (figur 4 d, H) och embryon som injiceras med rodamin ensam (figur 4E, jag) användes som negativa kontroller. Efter Mikroskop, embryon överfördes in i kanalen bildenheten (figur 1A, B) och avbildas med ett EVOS fluorescerande Mikroskop (figur 4 c) på 30 min och 5 h efter injektionen (figur 4 d- G och figur 4 H-K, respektive). Som förväntat, rekryterades ett litet antal fluorescerande neutrofiler till den mock-injiceras öron vesikler på den tidiga tidpunkt (figur 4I), sannolikt på grund av skador-medierad rekrytering. Intressant, observerades rodamin dextran spårämne ansamlas i öronstenarna under experimentet. För båda chemoattractants (figur 4F, J), neutrofiler rekryterades i högre nummer, särskilt som svar på LTB4 (figur 4F).
De representativa resultat visas här visar den framgångsrika användningen av denna metod för Mikroskop och avbildning av zebrafiskar. I samband med zebrafiskar neutrofila rekrytering analyser föreskriva tillämpningen av dessa verktyg i kombination med detaljerade levande avbildningstekniker och sofistikerade cell migration analys10 en användbar plattform för framtida experiment i det här fältet.
Figur 1: datorstödd ritning (CAD) konstruktion av photolithographyen masker. (A-C) CAD design för microstructured yta divots för placering i sidled (A), ventrala (B) och dorsala (C) riktlinjer. Olika färgade linjer representerar CAD mask mönster till olika funktioner, med grön 100 µm, blå 200 µm, och röd 400 µm funktionen höjder. Skalstapeln = 500 µm. (D-F) CAD design för microstructured kanaler för placering i sidled (D), ventrala (E) och dorsala (F) riktlinjer. Olika färgade linjer representerar mask design för olika funktioner, med grön 100 µm, blå 200 µm, och röd 400 µm funktionen höjder. Skalstapeln: 500 µm. (G-jag) CAD design för imaging-enheter utformad för lastning huvudet först (G) eller svans-första (H och jag). Blå linjer representerar 400 µm funktioner, medan röda linjerna representerar 600 µm funktioner. Pilarna visar i vilken riktning där larverna är laddad. Skalstapeln = 200 µm. Denna siffra har ändrats från Bergström et al. 5 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: silikon master wafer. (A) övre delen av master wafer visar funktioner för orientera enskilda larver i divots. (B) nedre delen av master wafer visar design för microstructured kanaler. Denna siffra har ändrats från Bergström et al. 5 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Microstructured PDMS enheter. (A), PDMS block casta från master wafer visar divots för orientera enskilda larver. (B) PDMS blockera rösterna från master wafer visar microstructured kanaler. Denna siffra har ändrats från Bergström et al. 5 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat: Imaging rekrytering av zebrafisk neutrofiler efter Mikroskop leverans av chemoattractants i de öron vesikler. (A-B) Lastning och montering embryon för avbildning. (A), i huvud-första enhet med embryon redo för lastning, med den port visas (svart pil). (B) den inlästa embryon när de har dragits in i position (gul pil). (C) 6-väl glas-bottenplatta med bildenheter på Mikroskop. Detta format kan imaging 4 sido orienterade embryon per brunn (24 embryon totalt), med standard inverterade Mikroskop. (D-G) Neutrofiler (andra-grön) i en uninjected (D) embryo och följande öron vesikler Mikroskop av rodamin dextran (röd, öppen vit pilspets) ensam (E), 100 nM LTB4 (F), och 100 nM fMLP (G) 30 min efter injektionen (mpi). (H-K) Neutrofiler (andra-grön) i embryots uninjected (H) och 5 h efter öron vesikler Mikroskop av rodamin dextran (röd, öppen vit pilspets) ensam (jag), 100 nM LTB4 (J), och 100 nM fMLP (K) 5 h post injektion ( HPI). Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, vi beskriver användningen av enheter vi nyligen utvecklat för att underlätta 2 dpf zebrafiskar Mikroskop5, och införa en enkel agaros-fri montering anordning för bekväm avbildning av embryon. Dessa verktyg belysa nyttan av photolithographic tekniker för tillverkning av enheter som är användbar för zebrafiskar tekniker.
Vi har hittat MSA enheter särskilt användbart för injektion av celler eller partiklar benägna att aggregation inom Mikroskop nålen, såsom svamp conidia eller mänskliga cancerceller, som kräver användning av en större cylinderdiameter nål för leverans. Injektion i den öron vesikler (figur 4) är en särskild utmaning, som embryon rullar ofta vid kontakt med nålen. Finner vi att användningen av microstructured kanaler som orientera och stabilisera zebrafiskar i sidled orientering förbättrats avsevärt både genomströmning och riktigheten av denna teknik i våra händer.
För snabb avbildning av sido orienterade zebrafisk vid olika tidpunkter, såsom bedömning av neutrofila rekrytering eller xenograft metastaser, undvika agaros ökade montering konsekvens mellan embryon och reducerade risken för skada under efter imaging räddning. Dessa enheter också visar löfte för längre tid förflutit imaging, och har använts för att framgångsrikt fånga flerkanaliga, multiplane bilder med minimal fisk rörelse över 12 h. Eftersom de inte hindras av agaros, aktiva töjning av larverna under denna period (~ 300 µm från 54-78 hpf)11 är obegränsad och kan fortsätta normalt.
De mest kritiska steg i förberedelse och användning av dessa verktyg är gemensamma för användningen av de flesta PDMS baserat mikroflödessystem enheter: enheter måste vätas ordentligt och bubblor undvikas. För att undvika sådana problem, våt enheterna i E3 omedelbart efter det att de är tillverkade, medan den ytan hydrophilicitet som är knutna till syre plasmabehandling är fortfarande närvarande. Återinsatt behandling med syre plasma kan också användas till normalnivå återställa hydrophilicitet till åldern PDMS enheter.
Exakt geometrier används här utnyttja den höga upplösningen av photolithographic tekniker, men den nuvarande mönster begränsa användningen till zebrafiskar under andra dagen efter befruktningen. Re-design av geometrier baserat på den aktuella plattformen skulle möjliggöra framgångsrika orientering 1 dpf och 3 dpf för Mikroskop. Orientering av mer livaktig 4 dpf larver med uppblåsta Simblåsor skulle sannolikt vara mer utmanande och kräver ombonad geometrier i kombination med högre vatten spänning. Komplexa enheter att integrera flöde eller vakuum kan tillhandahålla ett alternativt tillvägagångssätt tillämpas på ett bredare utbud av utvecklingsstadier, men skulle också kräva användning av pumpar och slangar, öka kostnaderna och risken för fel.
PDMS är ett kostnadseffektivt, användbart material för fabricera enheter som de som beskrivs här, biokompatibilitet, öppenhet och återanvändbarhet. En nackdel med att använda PDMS enheter för zebrafisk är vattenavvisande egenskaper, vilket kan göra underhåll av ytliga lager av E3 på ytan av enheten utmanande. Detta problem kan undvikas genom gjutning Mikroskop enheterna i agaros, även om detta begränsar återanvändbarhet och ökar bräckligheten i enheter. En rekommenderad alternativ vore identifiering av en biokompatibel ytbehandling som ökar hydrophilicitet PDMS12, eller användning av en lämplig plast substrat.
Nuvarande metoder för Mikroskop av zebrafisk på 2 dpf använda antingen vatten spänning4 eller enkla kanaler gjutna i agaros använda kommersiella formar att immobilisera och placera larverna. Dessa metoder ger begränsad kontroll av orientering och kan kompliceras av snabb torkning av embryon. Mikrostrukturer integreras i divots och kanaler som används här är utformade för att orientera och immobilisera larver utan beroende helt på vatten spänningar, vilket minskar risken för uttorkning. Divots gjorda med 3D tryckta formar har tidigare använts för orientering av embryon för imaging ändamål13, även om djupet av dessa divots gjorde dem oåtkomliga för Mikroskop.
Användning av mikrofabricerade system för zebrafiskar imaging blir allt vanligare14.
Flera genomströmmande system har utvecklats för att observation av zebrafisk utveckling över tiden med möjligheten att införa föreningar på efterfrågan15,16,17. Mer komplexa enheter har utformats till array embryon medan fortfarande i sin chorion, vilket ger en enkel sfärisk geometri som kan lätt manipuleras med relativt hög genomströmning i dessa system18,19. Flera grupper har utvecklat plattformar för arraying och imaging larvstadium zebrafiskar i olika riktlinjer6,20, den mest användarvänliga som den passiva micropump driven ”ZEBRA”-systemet som utvecklats av Beebe lab6 . Till skillnad från ZEBRA systemet, den enhet som vi beskriver använder här sug, genererade med standardöverföring pipett, för att dra in larver i kanalerna, medan parallellt i stället för sekventiell lastning av larver tillåter räddning av enskilda larver efter avbildning av tillämpa positiva flödet genom samma port. Vårt förhållningssätt kräver dessutom ett mindre fotavtryck, så PDMS enheter kan limmas till konventionella glas-6-väl bottenplåtar för avbildning.
Den nuvarande experimentell designen använder tredjeparts separata enheter för Mikroskop och imaging primärt så att de kan användas med konventionella Mikroskop utrustning och standard inverterade Mikroskop. Mikroflödessystem strategier för automatiserad Mikroskop zebrafiskar ägg redan finns21, och i kombination med ”fisk-fällan” typ metoder för noggranna arraying och läggning av larver20, det är förutsebar som enheter att integrera automatiserad larval injektion och imaging kan också en dag bli verklighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka David Langenau för generöst ge akvarium utrymme; Eric Stone, John C. Moore och Qin Tang för hjälp med zebrafiskar underhåll och reagenser, och Anne Robertson och Elliott Hagedorn från Leonard Zon's lab för att skaffa zebrafiskar stammen används här. De skulle också vilja tacka Octavio Hurtado för råd om photolithographic tekniker. FE finansierades av stipendier från Shriner's Hospital för barn och amerikansk australiska Association. Detta arbete finansierades av NIH bevilja GM92804.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI - 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
