Summary
Uranium is bekend dat het invloed op bot metabolisme. Hier presenteren we een protocol gericht op het onderzoeken van het effect van natuurlijk uranium blootstelling op de levensvatbaarheid, de differentiatie en de functie van osteoclasten, de cellen die verantwoordelijk is voor bot resorptie.
Abstract
Uranium is aangetoond te bemoeien met bot fysiologie en het is reeds lang gevestigd dat dit metaal hoopt zich op in bot. Echter, er is weinig bekend over het effect van natuurlijk uranium op het gedrag van de cellen van het bot. In het bijzonder is het effect van uranium op osteoclasten, de cellen die verantwoordelijk zijn voor de resorptie van de bot-matrix, niet gedocumenteerd. Om dit probleem nader te onderzoeken, hebben we een nieuw protocol met behulp van uranyl acetaat als een bron van natuurlijk uranium en de lymfkliertest cellijn van rauwe 264.7 als een model van osteoclast precursoren opgericht. We gedetailleerde hierin alle testen die nodig is voor het testen van uranium cytotoxiciteit op osteoclast precursoren en voor de evaluatie van de invloed ervan op de osteoclastogenesis op de resorbeerbare functie van volwassen osteoclasten. De voorwaarden die wij hebben ontwikkeld, met name voor de bereiding van de voedingsbodems uranyl-bevattende en voor het zaaien van rauwe 264.7 cellen toestaan om betrouwbare en zeer reproductieve resultaten te verkrijgen. Bovendien hebben we het gebruik van softwaretools om de analyse van de verschillende parameters zoals de grootte van de osteoclasten of het percentage van geresorbeerd matrix geoptimaliseerd.
Introduction
Uranium is een natuurlijk voorkomende radioactieve element aanwezig in de bodem, lucht en water; als zodanig, worden dieren en mensen blootgesteld aan natuurlijk uranium in hun dieet. Naast natuurlijke bronnen, is uranium afkomstig uit antropogene activiteiten, dat verhoogt de overvloed in de omgeving. Uranium vormt zowel chemische en radiologische risico's. Echter, omdat natuurlijk uranium (dat is een isotopische mengsel met 99.27% 238U 0.72% 235U, en 0.006% 234U) heeft een lage specifieke activiteit (25.103 Bq.g-1), worden de effecten ervan op de gezondheid toegeschreven aan de chemische toxiciteit.
Wat de vermelding route (inhalatie, inslikken of dermale blootstelling), de meeste van uranium invoeren van het lichaam wordt geëlimineerd met uitwerpselen en slechts een klein gedeelte bereikt de systemische circulatie. Ongeveer 67% van uranium in het bloed is op zijn beurt gefilterd door de nieren en verlaat het lichaam in de urine binnen 24 h1. De rest wordt meestal gestort in de nieren en de botten, de twee voornaamste doelorganen van uranium toxiciteit,2,,3,4. Omdat het skelet heeft aangemerkt als de primaire site van uranium op lange termijn bewaring2,3,4,5,6, verschillende studies zijn uitgevoerd om te verkennen de effect van uranium op bot fysiologie7.
Bot is een gemineraliseerde weefsel dat is voortdurend gerenoveerd tijdens zijn levensduur. Het remodelleren van het bot is een complex proces dat afhankelijk van gespecialiseerde celtypen en bestaat meestal uit twee fasen: resorptie van de reeds bestaande oude matrix door osteoclasten gevolgd door de novo bot bouw van botcellen. Osteoclasten zijn grote multinuclear cellen als gevolg van de fusie van voorlopercellen van hematopoietische oorsprong die naar resorptie sites waar zij hechten migreren aan het bot van8. Hun gehechtheid vindt gelijktijdig plaats met een uitgebreide reorganisatie van hun cytoskelet9. Deze reorganisatie is vereist voor de totstandbrenging van een geïsoleerd compartiment tussen de cel en het oppervlak van de bot waarin de osteoclast protonen scheidt, wat leidt tot de ontbinding van hydroxyapatiet en proteasen die betrokken zijn bij de afbraak van de organische matrix. De resulterende afbraakproducten worden endocytosed, vervoerd door de cel naar het membraan gebied tegenover het bot oppervlak en uitgescheiden, een proces genaamd transcytosis10,11.
Resultaten van in vivo en in vitro studies blijkt dat uranium biomineralisatie remt en het nummer en de activiteit van botcellen7,12 wijzigt. In tegenstelling, hebben de effecten van uranium op bot resorptie en osteoclasten slecht onderzocht. Verschillende in vivo studies hebben gemeld een versterking van bot resorptie na toediening van uranyl nitraat naar muizen of ratten13,14. Een epidemiologisch onderzoek stelde voorts dat de toename van de uranium inname via drinkwater de neiging te worden geassocieerd met een toename van de serum-niveau van een bot resorptie markering in mannen15. Samen genomen, deze bevindingen leidde tot de conclusie dat uranium, dat zich in bot ophoopt bot resorptie kan bevorderen. De cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij dit potentiële effect van uranium blijven echter een open vraag. Om deze reden besloten hebben we te onderzoeken van het effect van uranium op gedrag van resorbeerbare bot cellen.
Hier beschrijven we het protocol die we hebben vastgesteld te karakteriseren en te kwantificeren van de effecten van natuurlijk uranium over pre osteoclasten levensvatbaarheid en differentiatie van osteoclasten en resorptive activiteit. De hierin beschreven proeven zijn gedaan met de RAW 264.7 lymfkliertest getransformeerde macrofaag cellijn, die gemakkelijk kan onderscheiden in osteoclasten wanneer gekweekt in aanwezigheid van de cytokine RANKL voor 4 of 5 dagen, en die is klassiek gebruikt om te studeren osteoclast differentiatie en functie16. De procedures ontwikkeld zijn betrouwbaar, zeer reproduceerbare resultaten en zijn volledig van toepassing op primaire osteoclasten geven. Om al deze redenen vinden wij dat deze methode handig is voor het verkrijgen van een beter begrip van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij uranium toxiciteit in bot. Bovendien denken wij dat deze aanpak aangepast als een screening tool worden kan voor het identificeren van nieuwe uranium chelaat agenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Uranyl acetaat oplossing
- Ter voorbereiding van een 100 mM uranyl acetaat 2 mL, voeg 85 mg uranyl-acetaat (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) in vaste toestand naar een plastic tube van 5 mL.
- Voeg 2 mL gedestilleerd water aan de kunststof buis en passen met een kunststof stop.
- Goed schudden de buis tot het totale uiteenvallen van de vaste stof. Zet de oplossing in de koelkast gedurende 24 uur.
Let op: De manipulatie van uranyl [U(VI)] presenteert sommige chemische en radiologische risico's. Alle monsters moeten worden voorbereid en gekenmerkt met ad hoc apparatuur in specifieke laboratoria. Alle U VI-bevattende vloeistoffen moeten worden verzameld in specifiek toegewezen afvalcontainers en als giftig afval. Droog afval (pipets, buizen, enz.) kan worden gewassen met 0,1 N HNO3 oplossing, die zal solubilize en U(VI) verwijderen. - Controleer of de pH van de oplossing met behulp van een micro-elektrode en een pH-meter.
Opmerking: De micro-elektrode moet worden eerder gekalibreerd met behulp van commerciële bufferoplossingen (pH = 4 en pH = 7).
2. rauwe 264.7 celkweek
-
Onderhoud van de cellen.
- RAW 264.7 cellen (ATCC, TIB-71) cultiveren in 75 cm2 flacons in de volgende groeimedium: Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 5% foetale runderserum en antibiotica: 100 IU/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine. Cellen in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2handhaven.
- Gemiddeld elke 2 tot 3 dagen wijzigen. Wanneer de cellen 85-90% heuvels, mechanisch verwijderen uit de cultuur-kolf met behulp van een cel schraper (zoals aanbevolen door het ATCC) en gesplitst in een verhouding van 1:6.
Opmerking: alleen cellen tussen passages 3 tot en met 10 worden gebruikt voor differentiatie experimenten.
-
Voorbereiding van de cellen van experimenten
- Verjagen van cellen uit de kolf substraat zoals hierboven beschreven en deze overbrengen naar een steriele 50 mL-buis. Meng cellen door pipetteren omhoog en omlaag om het breken van de bosjes. Ze tellen met een hemocytometer. 35-40 miljoen cellen per 75 cm2 kolf verwachten.
- Volume van cellen schorsing nodig voor elk experiment als volgt berekenen:
Aantal experimentele voorwaarden x 3 (triplicates) x 1 mL/putje + 3-4 mL (pipetting verliezen).
Opmerking: Zaaien dichtheid voor alle tests beschreven in dit protocol is 5.000 cel/cm2. Dus, voor een 24-well plaat, het betekent 10.000 cellen per putje in 1 mL medium, en opschorting van de celdichtheid dus 10.000 cellen/mL. - Voorbereiden van benodigde volume van 10.000 cellen/mL celsuspensie en zaad van de cellen in 24-Wells-platen. Voor cytotoxiciteit testen, gebruikt u de normale groeimedium. Voor differentiatie en resorptie assays, gebruik alpha aangepast Minimum essentiële Medium (αMEM) aangevuld met 2 mM L-Glutamine, 5% FBS en 50 ng/mL GST-RANKL17.
Opmerking: De GST-RANKL eiwit geproduceerd in eigen huis kan worden vervangen door een commercieel verkrijgbare RANKL cytokine. Wanneer u werkt met een nieuwe partij van de RANKL, is het wellicht nuttig om te testen van de effectiviteit ervan in inducerende osteoclastogenesis door het uitvoeren van een dosis-respons-experiment met RANKL concentratie variërend van 20 tot 150 ng/mL.
3. de verdunning van de 100 mM Uranyl acetaat oplossing in een kweekvloeistof
Opmerking: Uranyl ionen [U(VI)] in een kweekvloeistof meerdere complexen vormen met andere middellange componenten die zijn cellulaire toxiciteit18,19,20,21kunnen wijzigen. Om deze reden moet uranyl-bevattende media gebruik zonder weglaten of verkorting van de evenwichtsinstelling stappen worden voorbereid.
- Koos uranyl blootstellingsconcentraties en berekenen van volumes van voedingsbodems nodig zijn voor het experiment (rekening houdend met dat elke voorwaarde is uitgevoerd in drievoud).
- Waterige oplossing van 7,5% natriumbicarbonaat vanaf de steriele celcultuur getest ([HCO3van-] = 893 mM), bereid een 100 mM HCO3- -oplossing in water en afkoelen in de ijskast.
- Voeg druppelsgewijs-1 deel uranyl acetaat 100 mM-stockoplossing aan 9 volumes ijskoude 100 mM HCO3- oplossing, het mengen van de tube zachtjes te schudden. Deze operatie verdunt uranyl-acetaat-stockoplossing ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) tot 10 mM en breng de pH aan ongeveer 7.
- Steriel water 1 deel aan 9 volumes ijskoude 100 mM HCO3- oplossing te bereiken van 90 mM HCO3- (gelijk aan HCO3- -concentratie in de oplossing van de uranyl 10 mM), die dienen zal ter voorbereiding van het besturingselement toevoegen medium.
- Laat bereide oplossingen te staan gedurende 3 uur bij kamertemperatuur (RT) voor evenwichtsinstelling.
- In de tussentijd bereidt het fundamentele blootstelling medium: αMEM met 2 mM L-Glutamine en 5% FBS.
Opmerking: Voor differentiatie en resorptie vitrotests, toevoegen 50 ng/mL GST-RANKL aan het fundamentele blootstelling medium. - Na 3U, Verdun passende bedragen van de 10 mM uranyl oplossing druppelsgewijs in het blootstelling medium met het oog op de gewenste uranyl werken van concentraties. Bereiden gelijktijdig het medium van de controle door het toevoegen van de hoeveelheid bicarbonaat gebruikt in de meest geconcentreerde uranyl-behandelde voorwaarde tot het medium van de blootstelling.
- Bereid media te staan gedurende 3 uur bij RT voor evenwichtsinstelling toestaan.
- Groei media uit de putten verwijderen en het vervangen van het besturingselement en de media uranyl-bevattende.
4. analyse van de ruwe 264.7 precursoren levensvatbaarheid in de aanwezigheid van U(VI) (MTT cytotoxische Assays)
Let op: Zowel MTT DMSO kan leiden tot huid en irritatie van het oog. Draag handschoenen en een veiligheidsbril als u met hen. Verzamelen van afvalproducten in specifiek toegewezen afvalcontainers.
- Ontbinden van een juiste hoeveelheid 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) poeder in PBS te verkrijgen van een stamoplossing van 10 x 5 mg/ml. Het steriliseren door filtratie met een 0,22 µm filter en slaan aliquots bij-20 ° C.
- De cellen van de plaat op 24-Wells-platen (3 wells per experimentele voorwaarde per plaat). Vergeet niet te reserveren 3 lege wells per plaat voor de spectrofotometer blanks.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 22-24 uur voorafgaand aan uranium blootstelling te laten cellen koppelen.
- Bereiden uranyl-bevattende media zoals beschreven in sectie 3.
- Vervangen door groeimedium in de cel-geplaatste platen uranyl-bevattende media. Incubeer gedurende 24 uur.
- De nodige hoeveelheid 1 x MTT oplossing als volgt berekenen:
(Aantal experimentele omstandigheden + lege) x 3 (triplicates) x 0,4 mL per putje + 10% volume voor pipetting verliezen. - Het vereiste volume van 1 x MTT oplossing bereid door verdunning van de 10 x MTT stockoplossing in Eagle's Minimum essentiële Medium (EMEM) zonder fenol rood.
Opmerking: voor een succesvolle colorimetrische assay, MTT moet worden beschermd tegen licht. Het is raadzaam om te verdunnen MTT in EMEM in plaats van DMEM ter beperking van het signaal van de achtergrond. - Verwijder uranyl-bevattende medium van de putten, ze wassen met PBS en 400 µL van MTT-oplossing toevoegen aan elk putje (inclusief 3 lege putten voor lege cellen). Incubeer 2,5 h bij 37 ° C in het donker. Controleer of onder Microscoop dat donkere paarse formazan kristallen hebben gevormd binnen levensvatbare cellen.
- De MTT-oplossing verwijderen en toevoegen van 220 µL van dimethylsulfoxide (DMSO) per putje. Platen wikkel in aluminiumfolie te beschermen hen tegen het licht en zachtjes doorroeren voor 10 min te ontbinden formazan kristallen.
- Een microplate spectrometer reader gebruiken om te bepalen van de optische dichtheid (OD) bij 570 nm (formazan specifiek) en 690 nm (achtergrond). Aftrekken voor elk putje, 690 nm OD van 570 nm OD aanpassen aan de mogelijke schommelingen van de waarde van aspecifieke OD als gevolg van krassen of turbiditeit22.
- Bereken de OD leeg-gecorrigeerd voor elk putje door aftrekken van de gemiddelde OD van de blanco uit de Franse overzeese departementen die is verkregen in de vorige stap. Bepaal het gemiddelde OD-waarde voor elke experimentele voorwaarde.
- Gemiddelde OD van de conditie van het besturingselement instellen ([UO22 +] = 0 mM) tot 100% levensvatbaarheid en bereken het overeenkomstige percentage van de levensvatbaarheid van de cellen voor de andere geteste uranyl-concentraties. Een dosis-responscurve uitzetten. Evalueren van de cytotoxiciteit Index 50 (CI50), gedefinieerd als de concentratie van de uranyl leidt tot de dood van de cel van 50% na 24 uur blootstelling.
5. analyse van Osteoclast differentiatie in de aanwezigheid van U(VI)
-
Differentiatie van rauwe 264.7 cellen in aanwezigheid van uranyl en TRAP (tartraat-resistente zuur fosfatase) kleuring.
- Plaat RAW 264.7 cellen op een 24-well plaat, 3 wells per experimentele voorwaarde. Incubeer bij 37 ° C gedurende ongeveer 6 uur, de tijd voor te bereiden en de media blootstelling uranyl-bevattende equilibreer.
- Differentiatie media met gewenste uranyl concentraties zoals beschreven in sectie 3 (Vergeet niet aan toe te voegen GST-RANKL media) voor te bereiden.
- Zachtjes voedingsbodem in putten vervangen uranyl-bevattende medium. Deze dag wordt beschouwd als dag 0 osteoclastic differentiatie.
- Wijzigen, het medium op dag 2 of 3 van osteoclastic differentiatie herhaalt stap 5.1.2 en 5.1.3. Multinucleaire osteoclasten moeten worden weergegeven tussen dag 3 en 4.
- Voer de kleuring van de TRAP met de verkrijgbare Leukocyte zure fosfatase kit na instructies van de fabrikant.
Opmerking: tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) zure fosfatase 5, tartraat resistent (ACP5) een afkorting is sterk uitgedrukt in volwassen osteoclasten en op grote schaal gebruikt als een marker voor osteoclast differentiatie. Daarom wordt val kleuring uitgevoerd om te visualiseren osteoclasten. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden en het tempo van osteoclastogenesis, kan het worden gedaan op dag 4 en dag 5 van het proces van de differentiatie. - Houd TRAP gebeitste wells in PBS bij 4 ° C voor verdere analyse (zij kunnen worden gehandhaafd onder deze omstandigheden tot 3 of 4 weken).
-
Osteoclast grootte/morfologie analyse.
- Een afbeelding van het gehele oppervlak van elk putje te verwerven. De resolutie van de afbeelding moet voldoende zijn om te onderscheiden van celkernen. TRAP-positieve cellen met 3 of meer kernen, beschouwen als osteoclasten.
- Open een afbeelding van een put in de ImageJ software: "Bestand" → "Open".
- Controleer of de schaaleenheden in de linkerbovenhoek van de afbeelding. Voor de relatieve kwantificering, kan elke eenheid worden gebruikt. Als de absolute waarde van osteoclast grootte nodig is, schaaleenheden omzetten in µm: "Het beeld van" → "Eigenschappen". Vink het vakje "global" in het pop-upvenster om nieuwe schaaleenheden toegepast op alle afbeeldingen later geopend.
Opmerking: Als een Microscoop werd gebruikt voor Beeldacquisitie, is de pixelgrootte in µm geïndiceerd voor elke doelstelling in de beeldbewerkingssoftware. - Meting te analyseren parameters opgeven: "Analyseren" → "Set metingen". In het venster instellen metingen "Ruimte" en "Display Label" selectievakjes en uncheck alle andere vakken.
- Open de ROI (regio van belang) manager: "Analyseren" → "Tools" → "ROI-Manager".
- In het hoofdvenster bevindt, kiest u het rechthoekig gereedschap. Gebruik het overal in het beeld te schetsen van een sector van ongeveer 1.000 x 1.000 µm. Deze selectie nu definieert de eerste regio in welke osteoclast grootte zal worden geanalyseerd.
- In het venster van de Manager van de ROI, klik op "Add" knop om het toevoegen van deze regio van belang aan de manager van de ROI en opslaan door te klikken op "Meer" → "Opslaan". De opgeslagen ROI kan nu worden herladen met de manager van de ROI op elk gewenst moment door te klikken op "Meer" → "Open".
- Herhaal stap 5.2.5 - 5.2.6 definiëren 4 extra gebieden osteoclast grootte p.a. (figuur 2A en 2D).
Opmerking: De gedefinieerde regio's zal worden gebruikt voor het analyseren van osteoclast maten in alle beelden. - Maak een kopie van een van de 5 regio's worden geanalyseerd: koos deze ROI in hoofdzaak de ROI-manager (de desbetreffende selectie zal verschijnen op de hoofdafbeelding) → Klik met de rechtermuisknop binnen de selectie → "Duplicate". Het gebruik van dit duplicaat voor verdere analyse.
- In het ROI Manager venster, selectievakjes "Toon Al" l en 'Labels'.
- Kies het gereedschap Veelhoek overzicht handmatig maken van een van de osteoclasten in de selectie in het hoofdvenster. Dit overzicht aan de ROI-manager toevoegen door te klikken op "Toevoegen" in het venster van de manager ROI. Ga op dezelfde manier verder voor alle osteoclasten die volledig binnen de geselecteerde regio liggen (figuur 2B en 2E).
- In het venster van de Manager van de ROI, selecteer alle de contouren en het meten van hun oppervlakte door te klikken op "Maatregel". De metingen die zijn verschenen in een nieuw venster (resultaten venster, figuur 2C en 2F) overbrengen naar een werkblad.
Opmerking: Op dit punt, de regio van analyse met alle contouren van de osteoclasten kan worden opgeslagen als een onafhankelijke afbeelding: "Bestand" → "Opslaan als" formaat van keuze. - Herhaal stap 5.2.8 - 5.2.12 voor de overige regio's van de analyse van de huidige afbeelding. Herhaal vervolgens de hele procedure voor alle andere afbeeldingen.
-
Osteoclast nummer analyse met ImageJ software.
Opmerking: Zoals osteoclast distributie in de put zelden homogeen is, voeren het tellen over het geheel genomen goed in plaats van op enkele geselecteerde zones. Gezien het feit dat osteoclasten heterogene in vorm en grootte, niet geautomatiseerde tellen cell, methode is uitvoerbaar.- Open de afbeelding van een geheel-well in de ImageJ software (voor deze analyse, gebruik beelden van vorige onderafdeling).
- Open het venster van de teller cel: "Plugins" → "analyseren" → "Cel Counter". Klik op het selectievakje "Type 1" en "Initialiseren" (of wat u liever typenummer). Controleer of "Toon nummer" is aangevinkt en vak "Verwijderen Mode" niet is aangevinkt.
- Op de afbeelding, klik op een osteoclast: gekleurde stip en een getal wordt weergegeven wanneer erop wordt geklikt. Ga verder op dezelfde wijze voor alle osteoclasten. De markers regelmatig opslaan door te klikken op "Opslaan Markers" in het venster van de teller cel
Opmerking: Als het laatste punt dat worden verwijderd uit de graaf moet, klikt u op "Verwijderen" in het venster van de teller cel. Als er meer dan één punt te verwijderen, Vink het vakje "Delete Mode" en geven alle ongeldige punten door te klikken op hen. Vervolgens ontketenen naar de vogelhuisje "Delete Mode" om verder te gaan van de graaf. - Het resultaat van tellen door te klikken op resultaten in het venster van de teller cel weergegeven. De eindresultaten tellen overbrengen naar een werkblad.
6. analyse van Osteoclast functie in aanwezigheid van U(VI)
-
Pit resorptie assay.
- Plaat RAW 264.7 cellen op een 24-well osteo assay plaat, waarmee een synthetische anorganische osteomimetic oppervlak dat kon worden geresorbeerd door osteoclasten.
Opmerking: om te laten hechten aan het oppervlak biomimetische cellen, is het vaak beter om de plaat hen de dag voordat het differentiatie-medium wordt toegevoegd. - RAW 246.7 cellen in de osteoclasten onderscheiden, zoals beschreven in sectie 5 (stappen 5.1.2 - 5.1.4)
- Op dag 5 van osteoclastogenesis, door osteoclasten uit het mimetische oppervlak van bot door vervanging van uranyl-bevattende gemiddeld met 10% bleekwater oplossing te verwijderen. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de putjes tweemaal met gedeïoniseerd water en laat ze drogen.
- Breng een 1% Alizarine Red S natrium zout oplossing in de putjes om vlek calciumzouten op het gebied van niet-geresorbeerd. Alizarine oplossing verwijderen na 10-15 s incubatietijd en voorzichtig de putjes 3 - 4 keer met water wassen. Laat die de putjes goed drogen.
Opmerking: De hierboven beschreven kleuring procedure is ontworpen om het contrast tussen de resorbed en de niet-geresorbeerd gebieden ter vergemakkelijking van de opeenvolgende analyse verbeteren. Deze procedure moet zorgvuldig worden gedaan omdat als wells niet volledig droog zijn voordat de kleuring, delen van het resterende bot-mimetische oppervlak per ongeluk kunnen worden verwijderd. Bovendien, als Alizarine oplossing is te lang in de putjes verliet een permanente kleuring van het niet-specifieke verschijnt. Opgemerkt moet worden dat de in deze sectie beschreven proef betrekking op het effect van uranium op zowel osteoclastic differentiatie en functie heeft. Om te bestuderen van het effect van uranium op resorptie onafhankelijk van osteoclast vorming, ruwe 264.7 cellen kunnen worden behandeld met uranyl-bevattende medium voor 24 uur slechts eenmaal volwassen osteoclasten worden gevormd (op dag 4 of 5 van het proces van differentiatie) 23.
- Plaat RAW 264.7 cellen op een 24-well osteo assay plaat, waarmee een synthetische anorganische osteomimetic oppervlak dat kon worden geresorbeerd door osteoclasten.
-
Pit resorptie analyse.
- Een afbeelding van het gehele oppervlak van elk putje van de plaat osteo assay verwerven.
Opmerking: Spiegelbeeld overname werkwijze kunnen variëren, maar moeten consistent repliceren experimenten. Een foto genomen met een doelstelling van de macro van een vaste camera, een hoge resolutie scannen of een afbeelding van de mozaïek gemaakt met een hoge-doorvoer geautomatiseerde Microscoop kan worden opgenomen. - Beginnen analyse door stappen 5.2.2 tot 5.2.4 uit het vorige gedeelte te herhalen.
- Een RGB-afbeelding omzetten in een indeling van de 8-bits grijstinten: "Het beeld van" → "Type" → '8-bit'.
- In het belangrijkste venster, selecteer het gereedschap Ovaal selecteren. Gebruiken om een overzicht van alle van het oppervlak van de put te worden geanalyseerd voor resorptie cirkel te tekenen.
- Sla deze nieuwe ROI zoals in stap 5.2.6.
- Om te vergemakkelijken drempel selectie, schakelt u alle functies buiten de gedefinieerde ROI: "Edit" → "Duidelijk buiten".
Opmerking: Op dit punt, het is vaak beter een paar kopieën van de afbeelding te maken: Schakel ROI door buiten de geselecteerde zone → Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding → "Duplicate" te klikken. Deze actie zal helpen met het vermijden van een herhaling van de behandeling van de afbeelding hierboven beschreven als de drempel die is gekozen in de volgende stap onbevredigend is. - Selecteer "Beeld" → "Aanpassen" → "drempel". Gebruik de schuifbalk om te kiezen van een geschikte drempel in het venster drempel. Alle resorbed gebieden moeten de drempel (wit) en niet-geresorbeerd, boven (rood). Om de drempel selectie hebt voltooid, klikt u op "Apply" in het venster van de drempel.
- Opslaan van de binaire eindbeeld: "Bestand" → "Opslaan als" → formaat van uw keuze.
- Definiëren van metingen te nemen in de regio van belang: "Analyseren" → "Set metingen". In het venster instellen metingen controleren "Gebied", "Gebied fractie" en "Limiet aan drempel" vakken en uncheck alle anderen.
- Met het oog op de breuk van "geresorbeerd" gebied rechtstreeks in het resultatenvenster, omkeren de binaire image ("bewerken" → "Omkeren"). Zorg ervoor dat de belangrijkste ROI is geselecteerd op de binaire eindbeeld (anders geresorbeerd gebied breuk zal worden berekend op basis van de oppervlakte van het venster van de hele afbeelding). Maatregel geresorbeerd gebied breuk door te klikken op "Maatregel" in het venster van de manager ROI of op "Analyseren" → "Meten". Sla het resultaat.
- Een afbeelding van het gehele oppervlak van elk putje van de plaat osteo assay verwerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tartraat-resistente zure fosfatase kleuring werd gebruikt voor het visualiseren van osteoclasten als grote paarse cellen met 3 of meer kernen. Representatieve beelden van osteoclasten verkregen uit rauwe 264.7 cellen gekweekt in aanwezigheid van RANKL en uranyl ionen zijn afgebeeld in Figuur 1. Veranderingen in aantal en grootte van osteoclasten in reactie op uranium zijn gemakkelijk zichtbaar in samengestelde afbeeldingen van hele putten en uitgebreide foto's.
Grootte van osteoclasten werd geanalyseerd met behulp van ImageJ software (Figuur 2). Voor dit doel, geheel-well beelden van Val gekleurd osteoclasten werden gebruikt en dezelfde gebieden werden behandeld in elk putje van elke cultuur voorwaarde (figuur 2A en 2D). Alle osteoclasten aanwezig in elke regio werden geschetst (figuur 2B en 2E) waardoor de bepaling van hun oppervlak (uitgedrukt in µm2) (figuur 2C en 2F). Voorbeelden afgebeeld in Figuur 2 ziet u het sterke effect van uranium op osteoclast grootte.
Om te onderzoeken de impact van uranium op osteoclast resorptie activiteit, werden ruwe 264.7 cellen verguld en gedifferentieerde op osteomimetic oppervlak plaat. Aan het eind van de test, werden osteoclasten verwijderd. Vervolgens mimetische oppervlak van bot in elk goed werd behandeld door Alizarine Red S natriumzout om de vlek gebied niet-geresorbeerd en beelden van elke geheel goed werden verworven (figuur 3A en 3D). De resulterende foto's werden verwerkt met afbeelding J software. Ze werden omgezet in 8 bits grijstinten afbeeldingen (figuur 3B en 3E), onderworpen aan drempelmethode (Figuur 3 c en 3F) en het resorbed gebied (witte regio's) werd automatisch berekend.
Figuur 1: visualisatie van het effect van U(VI) op osteoclast vorming. RAW 264.7 cellen werden onderscheiden in aanwezigheid van de aangegeven concentratie van uranyl. Op dag 4, werd tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) kleuring uitgevoerd. Representatieve geheel-well microfoto (bovenste panelen) Toon val gebeitste osteoclasten verkregen in deze voorwaarden. Voorbeelden van multinucleaire osteoclasten in vakken worden weergegeven bij een hogere vergroting (pijlen in de onderste panelen). Deze foto's illustreren het effect van de dosis-afhankelijke van U(VI) op osteoclast vorming. Zwarte hoofd pijlen geven aan voorbeelden van osteoclast kernen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: analyse van het effect van U(VI) op osteoclast grootte. (A en D): geheel-well beelden van de osteoclasten met boxed oppervlakte die overeenkomt met de regio's in welke osteoclast grootte was geanalyseerd worden weergegeven. De rode vakken gebied (A en D) komen overeen met die getoond in (B) en (E), respectievelijk. (B en E): de handmatige tekening van osteoclast randen in de twee voorwaarden van uranyl-concentratie in het blauw wordt weergegeven. (C en F): windows vanaf ImageJ software toont de metingen uit analyse van de onder B en E, respectievelijk resulteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: analyse van het effect van U(VI) op osteoclast functie. Beelden van Alizarine gekleurd osteomimetic oppervlak na osteoclastic resorptie die in de afwezigheid (A) of in de aanwezigheid van 25 µM voor uranyl (D plaatsvonden). Foto's in (A en D) waren eerst omgezet in 8 bits grijstinten afbeeldingen zoals in (B en E) en, vervolgens, in binaire afbeeldingen (C en F) door toepassing van een geschikte drempel worden ingesteld. Deze binaire afbeeldingen werden gebruikt voor de berekening van het percentage van ruimte in elke voorwaarde geresorbeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor zover we weten, is dit de eerste keer dat een gedetailleerde procedure gericht op het bestuderen van het effect van natuurlijk uranium op bot resorbeerbare cellen wordt beschreven. Deze aanpak nuttig zal zijn voor het bereiken van een beter begrip van uranium impact op bot fysiologie en een interessante nieuwe tool kan voorzien in de screening van uranium chelaatvormers. Wij zijn bovendien van mening dat het protocol hier beschreven kan worden toegepast om te bestuderen van de impact van andere zware metalen op osteoclatogenesis.
Het is bekend dat uranyl complexvorm met anorganische en organische componenten in kweekmedia18,19,20,21. Deze complexations beïnvloeden de speciatie van uranium en, op deze manier, de cytotoxiciteit. Om deze reden is een cruciale stap in het protocol de bereiding van de voedingsbodems uranium bevatten. Wij hebben eerder getoond23 , dat de aanwezigheid van foetale runderserum van 5% in het kweekmedium van rauwe 264.7 cellen geen significant effect op de cytotoxiciteit van uranyl hadden wanneer gebruikt in concentraties variërend van 0 tot 400 µM. Dit is een belangrijk punt, aangezien de aanwezigheid van serum in het medium is vereist voor het analyseren van de effecten van uranium blootstelling tijdens het gehele proces van osteoclastic differentiatie. Wij willen echter benadrukken dat de procedure van de lange in twee stappen beschreven voor de bereiding van blootstelling media (6 uur) moet zorgvuldig worden gevolgd. Inderdaad, de stap van de incubatie van 3 uur na elke verdunning van uranyl zouten kan de stabilisatie van de uranyl-complexen potentieel gevormd in oplossing vóór verdere verdunning of cel blootstelling. Dit is absoluut noodzakelijk om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Een andere belangrijke parameter voor de reproduceerbaarheid van osteoclast differentiatie en resorptie tests is de seeding dichtheid van de RAW 264.7 cellen. Inderdaad, het is aangetoond dat mononucleaire voorloper dichtheid een kritische factor voor osteoclast vorming, waarschijnlijk is omdat de nabijheid van de cel-naar-cel cellulaire fusion gebeurtenissen24 invloeden. Daarom moet bijzondere aandacht worden besteed aan cel tellen, cellulaire schorsing voorbereiding en homogeniteit van het zaaien in elk putje, om te voorkomen dat de verkeerde interpretatie.
De drempelmethode tool is handig voor het automatiseren van de kwantificering van de resorptie. Het de moeite waard erop te wijzen dat deze analyse vereist goed verlichte beelden. Een gemeenschappelijk probleem ongeacht het type van camera en beeld acquisitie-methode is echter ongelijk verlichting aan de randen van de afbeelding. In dat geval kan een methode scriptingregel drempelmethode nodig zijn.
Kortom, hebben we een robuust protocol waardoor de studie van uranium invloed op osteoclast vorming, de levensvatbaarheid en de functie opgericht. Deze procedure is ontwikkeld met behulp van de RAW 264.7 cellijn maar is volledig van toepassing op primaire beenmerg osteoclast precursoren, zoals we hebben van23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
De auteurs bedank Chantal Cros voor nuttige technische bijstand.
Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van het "Commissariat à l'Energie Atomique et aux energieën alternatieven" (URANOs - programma transversale de Toxicology du CEA en CPRR CEA-AREVA), en van de ANR (toxiciteit van URanium: multi-level benadering van biomineralization verwerken in bot, ANR-16-CE34-0003). Dit werk werd ook ondersteund door de University of Nice Sophia-Antipolis en het CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , Atlanta, GA. (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , Oxford University Press. Oxford. (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
