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Developmental Biology

पर प्राकृतिक यूरेनियम के प्रभावों का विश्लेषण करने के तरीके इन विट्रो Osteoclastogenesis

Published: January 30, 2018 doi: 10.3791/56499
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1UMR E-4320 TIRO-MATOs CEA/DRF/BIAM, Université Nice Sophia-Antipolis, 2UMR 7272 Institut de Chimie de Nice CNRS, Université Nice Sophia-Antipolis, 3CEA, Direction de la Recherche Fondamentale (DRF), Biosciences and Biotechnologies Institute (BIAM)

Summary

यूरेनियम अस्थि चयापचय को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है । यहां, हम व्यवहार्यता पर प्राकृतिक यूरेनियम जोखिम के प्रभाव की जांच के उद्देश्य से एक प्रोटोकॉल वर्तमान, भेदभाव, और osteoclasts के समारोह, अस्थि अवशोषण के आरोप में कोशिकाओं ।

Abstract

यूरेनियम को हड्डी शरीर क्रिया विज्ञान के साथ हस्तक्षेप दिखाया गया है और यह अच्छी तरह से स्थापित है कि इस धातु की हड्डी में जमा है । हालांकि, थोड़ा हड्डी कोशिकाओं के व्यवहार पर प्राकृतिक यूरेनियम के प्रभाव के बारे में जाना जाता है । विशेष रूप से, osteoclasts पर यूरेनियम के प्रभाव, अस्थि मैट्रिक्स के अवशोषण के लिए जिंमेदार कोशिकाओं, प्रलेखित नहीं है । इस मुद्दे की जांच करने के लिए, हम एक नया प्राकृतिक यूरेनियम के एक स्रोत के रूप में uranyl एसीटेट का उपयोग कर प्रोटोकॉल की स्थापना की है और murine कच्चे २६४.७ अस्थिशोषक अग्रदूतों के एक मॉडल के रूप में सेल लाइन । इस के साथ साथ, हम सभी को अस्थिशोषक अग्रदूतों पर यूरेनियम cytotoxicity परीक्षण और osteoclastogenesis पर इसके प्रभाव का मूल्यांकन और परिपक्व osteoclasts के resorbing समारोह पर आवश्यक परख विस्तृत । शर्तों हम विकसित किया है, विशेष रूप से uranyl-युक्त संस्कृति मीडिया की तैयारी के लिए और कच्चे २६४.७ कोशिकाओं के बोने के लिए विश्वसनीय और अत्यधिक प्रजनन परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, हम इस तरह के osteoclasts के आकार या resorbed मैट्रिक्स का प्रतिशत के रूप में विभिंन मापदंडों के विश्लेषण की सुविधा के लिए सॉफ्टवेयर उपकरण के उपयोग को अनुकूलित किया है ।

Introduction

यूरेनियम एक स्वाभाविक रूप से उत्पंन रेडियोधर्मी तत्व मिट्टी, हवा और पानी में मौजूद है; जैसे, पशुओं और मनुष्यों को उनके आहार में प्राकृतिक यूरेनियम के संपर्क में हैं । प्राकृतिक स्रोतों के अलावा, यूरेनियम anthropogenic गतिविधियों है, जो पर्यावरण में अपनी बहुतायत बढ़ जाती है से उत्पंन । यूरेनियम रासायनिक और रेडियोलॉजिकल दोनों खतरों बन गया है । हालांकि, क्योंकि प्राकृतिक यूरेनियम (जो एक isotopic ९९.२७% २३८यू युक्त मिश्रण है, ०.७२% २३५यू, और ०.००६% २३४यू) एक कम विशिष्ट गतिविधि है (२५.१०3 Bq. जी-1), स्वास्थ्य पर इसके प्रभावों को जिंमेदार ठहराया है इसके रासायनिक विषाक्तता ।

जो कुछ भी अपने प्रवेश मार्ग (साँस लेना, घूस, या चमड़े का एक्सपोजर), यूरेनियम के सबसे शरीर में प्रवेश मल के साथ समाप्त होता है और केवल एक छोटे से हिस्से प्रणालीगत संचलन तक पहुंचता है । लगभग ६७% यूरेनियम रक्त में गुर्दे द्वारा फ़िल्टर की गई बारी में है और 24 एच1के भीतर मूत्र में शरीर छोड़ देता है । शेष ज्यादातर गुर्दे और हड्डियों में जमा है, यूरेनियम विषाक्तता के दो मुख्य लक्ष्य अंगों2,3,4। क्योंकि कंकाल यूरेनियम की प्राथमिक साइट के रूप में पहचान की गई है दीर्घकालिक प्रतिधारण2,3,4,5,6, कई अध्ययनों का पता लगाने के लिए आयोजित किया गया है अस्थि फिजियोलॉजी7पर यूरेनियम का प्रभाव ।

हड्डी एक खनिज ऊतक है कि लगातार अपने जीवनकाल में remodeled है । एक जटिल प्रक्रिया है कि विशेष सेल प्रकार पर निर्भर करता है और दो चरणों के ज्यादातर होते हैं: पहले से मौजूद पुराने मैट्रिक्स osteoclasts द्वारा de नोवो हड्डी निर्माण द्वारा पीछा किया osteoblasts Osteoclasts बड़े multinuclear टेम मूल के अग्रदूत कोशिकाओं के संलयन से उत्पंन कोशिकाओं रहे है कि याला साइटों के लिए जहां वे हड्डी8संलग्न करने के लिए पलायन । उनका लगाव उनके cytoskeleton9के एक व्यापक पुनर्गठन के साथ एक साथ होता है । इस पुनर्गठन कोशिका और हड्डी की सतह के बीच एक अलग डिब्बे की स्थापना के लिए आवश्यक है, जिसमें अस्थिशोषक स्राव प्रोटॉन, hydroxyapatite के विघटन के लिए अग्रणी है, और के क्षरण में शामिल है । कार्बनिक मैट्रिक्स । परिणामस्वरूप गिरावट उत्पादों endocytosed, हड्डी की सतह के विपरीत झिल्ली क्षेत्र में सेल के माध्यम से ले जाया जाता है और स्रावित, एक प्रक्रिया transcytosis बुलाया10,11।

vivo में से परिणाम और इन विट्रो अध्ययनों से संकेत मिलता है कि यूरेनियम हड्डी गठन को रोकता है और संख्या में परिवर्तन और osteoblasts7,12की गतिविधि । इसके विपरीत अस्थि अवशोषण और osteoclasts पर यूरेनियम के प्रभाव की खराब पड़ताल की गई है. vivo अध्ययनों में कई चूहों या चूहों13,14के लिए uranyl नाइट्रेट के प्रशासन के बाद हड्डी अवशोषण की एक वृद्धि की सूचना दी है । इसके अलावा, एक महामारी विज्ञान की जांच का सुझाव दिया है कि पीने के पानी के माध्यम से यूरेनियम की खपत में वृद्धि के लिए एक हड्डी याला मार्कर के सीरम स्तर में वृद्धि के साथ जुड़े होने की प्रवृत्ति15। एक साथ ले लिया, इन निष्कर्षों निष्कर्ष है कि यूरेनियम, जो हड्डी में जमा अस्थि अवशोषण को बढ़ावा देने सकता है नेतृत्व किया । हालांकि, सेलुलर यूरेनियम के इस संभावित प्रभाव में शामिल तंत्र एक खुला सवाल रहते हैं । इस कारण से, हम resorbing अस्थि कोशिकाओं के व्यवहार पर यूरेनियम के प्रभाव की जांच करने का फैसला किया ।

यहां, हम प्रोटोकॉल हम विशेषताएं और पूर्व osteoclasts व्यवहार्यता पर और osteoclasts भेदभाव और resorptive गतिविधि पर प्राकृतिक यूरेनियम के प्रभाव को मात्राएं स्थापित किया है वर्णन । यहां वर्णित प्रयोगों कच्चे २६४.७ murine के साथ किया गया है macrophage सेल लाइन है, जो आसानी से osteoclasts में अंतर कर सकते है जब 4 या 5 दिनों के लिए cytokine RANKL की उपस्थिति में संस्कृति, और जो शास्त्रीय अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाता है बदल अस्थिशोषक विभेद र कार्य१६। विकसित प्रक्रियाओं विश्वसनीय हैं, उच्च प्रतिलिपि परिणाम दे और प्राथमिक osteoclasts के लिए पूरी तरह से लागू कर रहे हैं । इन सभी कारणों के लिए, हम मानते है कि इस पद्धति आणविक अस्थि में यूरेनियम विषाक्तता में शामिल तंत्र की एक बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए उपयोगी है । इसके अलावा, हमें लगता है कि इस दृष्टिकोण नए यूरेनियम chelating एजेंटों की पहचान के लिए एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. Uranyl एसीटेट समाधान की तैयारी

  1. एक १०० mM uranyl एसीटेट समाधान के 2 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, जोड़ें ८५ uranyl एसीटेट की मिलीग्राम (UO2(OCOCH3)2, 2H2हे; एम = ४२४ g. मॉल-1) ठोस राज्य में एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए ।
  2. प्लास्टिक ट्यूब के लिए आसुत पानी की 2 मिलीलीटर जोड़ें और एक प्लास्टिक डाट के साथ फिट ।
  3. ठोस के कुल विघटन तक ट्यूब जोरदार हिला । घोल को फ्रिज में रख कर 24 ज.
    चेतावनी: uranyl [यू (VI) के हेरफेर] कुछ रासायनिक और रेडियोलॉजिकल खतरों प्रस्तुत करता है । सभी नमूनों को तैयार किया जाना चाहिए और विशिष्ट प्रयोगशालाओं में तदर्थ उपकरणों के साथ विशेषता है । सभी यू (VI)-तरल पदार्थ से युक्त विशेष रूप से सौंपा अपशिष्ट कंटेनरों में एकत्र किया जाना चाहिए और विषाक्त अपशिष्ट के रूप में निपटारा । शुष्क अपशिष्ट (pipets, ट्यूबों, आदि) ०.१ एन िनॉ3 समाधान है, जो solubilize और (VI) को दूर करेगा के साथ धोया जा सकता है ।
  4. एक microelectrode और एक पीएच-मीटर का उपयोग कर समाधान के पीएच सत्यापित करें ।
    नोट: microelectrode पहले वाणिज्यिक बफर समाधान का उपयोग करने पर तुले होना चाहिए (पीएच = 4 और पीएच = 7) ।

2. कच्चे २६४.७ सेल संस्कृति

  1. कोशिकाओं का रखरखाव ।
    1. कच्चे २६४.७ कोशिकाओं की खेती (ATCC, TIB-७१) में ७५ सेमी2 कुप्पी निम्नलिखित विकास माध्यम में: Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) 5% भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक: १०० IU/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2पर मशीन में कोशिकाओं को बनाए रखने ।
    2. मध्यम हर 2 से 3 दिन में बदलें । जब कोशिकाओं 85-90% धाराप्रवाह हैं, यांत्रिक उंहें संस्कृति कुप्पी से हटाने के एक सेल खुरचना का उपयोग कर (के रूप में ATCC द्वारा अनुशंसित) और उंहें 1:6 के अनुपात में विभाजित ।
      नोट: केवल 3 से 10 मार्ग के बीच कोशिकाओं भिंनता प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है ।
  2. प्रयोगों के लिए कक्षों की तैयारी
    1. ऊपर वर्णित है और एक बाँझ ५० एमएल ट्यूब करने के लिए उन्हें हस्तांतरण के रूप में कुप्पी सब्सट्रेट से कोशिकाओं को उखाड़ फेंक । pipetting ऊपर और नीचे के झुरमुट को तोड़ने के लिए कोशिकाओं को मिलाएं । उंहें एक hemocytometer के साथ गिनती । ७५ सेमी2 कुप्पी प्रति 35-40 लाख कोशिकाओं की उम्मीद है ।
    2. प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं के निलंबन की मात्रा का परिकलन निम्नानुसार करें:
      प्रायोगिक शर्तों की संख्या x 3 (triplicates) x 1 मिलीलीटर/अच्छी तरह से + 3-4 मिलीलीटर (pipetting घाटा) ।
      नोट: सभी परख इस प्रोटोकॉल में वर्णित के लिए बीज बोने की सघनता है ५,००० सेल/2। इसलिए, एक 24 के लिए अच्छी तरह से थाली, यह मतलब है १०,००० कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से में 1 मिलीलीटर मध्यम, और कोशिका निलंबन घनत्व इस प्रकार है १०,००० कोशिकाओं/एमएल ।
    3. १०,००० कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा तैयार करें/एमएल सेल निलंबन और बीज 24-अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं । cytotoxicity परख के लिए, सामांय विकास माध्यम का उपयोग करें । भेदभाव और याला परख के लिए, उपयोग अल्फा संशोधित ंयूनतम आवश्यक माध्यम (αMEM) 2 मिमी एल-Glutamine, 5% FBS और ५० के साथ पूरक-GST के एनजी/एमएल-RANKL17।
      नोट:-घर में उत्पादित जीएसटी-RANKL प्रोटीन किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध RANKL cytokine द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है । जब एक नया RANKL बैच के साथ काम कर रहे, यह RANKL एकाग्रता के साथ एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग प्रदर्शन से osteoclastogenesis उत्प्रेरण में अपनी प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए उपयोगी हो सकता है 20 से १५० एनजी/एमएल ।

3. संस्कृति माध्यम में १०० मिमी Uranyl एसीटेट समाधान के कमजोर पड़ने

नोट: Uranyl आयनों [यू (VI)] संस्कृति माध्यम में अन्य मध्यम घटक है कि अपने सेलुलर विषाक्तता18,19,20,21को संशोधित कर सकता है के साथ कई परिसरों । इस कारण से, uranyl-युक्त मीडिया equilibration चरणों को छोड़े या छोटा किए बिना extemporaneously तैयार किया जाना चाहिए ।

  1. चुना uranyl जोखिम सांद्रता और प्रयोग के लिए आवश्यक संस्कृति मीडिया के संस्करणों की गणना (खाते में ले कि प्रत्येक शर्त तपसिल में किया जाता है) ।
  2. बाँझ कोशिका संस्कृति से शुरू परीक्षण ७.५% सोडियम बिकारबोनिट जलीय समाधान ([HCO3-] = ८९३ मिमी), एक १०० मिमी HCO3- पानी में समाधान तैयार है और यह बर्फ पर ठंडा ।
  3. ड्रॉप-बाय-ड्रॉप जोड़ें 1 uranyl एसीटेट १०० mm स्टॉक समाधान के 9 मात्रा के लिए बर्फ ठंडा १०० mm HCO3- समाधान, धीरे मिश्रण ट्यूब मिलाते हुए । इस आपरेशन uranyl एसीटेट शेयर समाधान पतला ([UO22 +] = १०० mm, पीएच 4) 10 mm और 7 के आसपास पीएच लाने के लिए होगा ।
  4. बर्फ ठंडा १०० mm HCO के 9 संस्करणों के लिए बाँझ पानी की 1 मात्रा जोड़ें3- समाधान ९० mm HCO3तक पहुंचने के लिए- (10 मिमी uranyl समाधान में HCO3- एकाग्रता के बराबर), जो करेगा कंट्रोल तैयार करने का काम मध्यम.
  5. equilibration के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 ज के लिए खड़े होने के लिए तैयार समाधान की अनुमति दें ।
  6. इस बीच, बुनियादी जोखिम मध्यम तैयार: αMEM 2 मिमी एल-Glutamine और 5% FBS के साथ ।
    नोट: भिंनता और याला परख के लिए, जीएसटी-RANKL के ५० एनजी/एमएल को बुनियादी जोखिम के माध्यम में जोड़ें ।
  7. 3 एच के बाद, जोखिम माध्यम में ड्रॉप द्वारा 10 मिमी uranyl समाधान ड्रॉप की उचित मात्रा को पतला ताकि वांछित uranyl काम कर सांद्रता प्राप्त करने के लिए । एक साथ नियंत्रण माध्यम तैयार सबसे केंद्रित uranyl-इलाज हालत में इस्तेमाल किया बिकारबोनिट की मात्रा को जोड़ने के द्वारा, जोखिम के माध्यम के लिए ।
  8. equilibration के लिए आरटी पर 3 ज के लिए खड़े करने के लिए तैयार मीडिया की अनुमति दें ।
  9. वेल्स से विकास मीडिया निकालें और इसे नियंत्रण और uranyl युक्त मीडिया के साथ बदलें ।

4. यू (VI) (MTT साइटोटोक्सिक की परख) की उपस्थिति में रॉ २६४.७ पुरोगामी व्यवहार्यता का विश्लेषण

सावधानी: दोनों MTT और DMSO त्वचा और आंखों में जलन पैदा कर सकता है । दस्ताने और आंख संरक्षण पहनते है जब उंहें संभाल । विशेष रूप से आवंटित अपशिष्ट कंटेनरों में अपशिष्ट उत्पादों को इकट्ठा करें ।

  1. 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) का पाउडर पंजाब में 5 मिलीग्राम/एमएल पर एक 10x स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त राशि को भंग । -20 डिग्री सेल्सियस पर एक ०.२२ µm फिल्टर और स्टोर aliquots के साथ निस्पंदन द्वारा यह निष्फल ।
  2. प्लेट 24-well प्लेट्स (प्लेट प्रति प्रायोगिक शर्त प्रति 3 कुओं) पर कोशिकाओं । spectrophotometer रिक्त स्थान के लिए थाली प्रति 3 खाली कुओं आरक्षित करने के लिए मत भूलना ।
  3. 22-24 एच के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन यूरेनियम जोखिम से पहले जाने के लिए कोशिकाओं देते हैं ।
  4. अनुभाग 3 में वर्णित के रूप में uranyl-युक्त मीडिया तैयार करें ।
  5. ग्रोथ मीडियम को सेल-सीड प्लेट्स में uranyl-युक्त मीडिया से बदलें । गर्मी के लिए 24 एच ।
  6. इस प्रकार के रूप में 1x MTT समाधान की आवश्यक मात्रा की गणना:
    (प्रायोगिक शर्तों की संख्या + रिक्त) x 3 (triplicates) x ०.४ मिलीलीटर/अच्छी तरह से + 10% pipetting घाटे के लिए मात्रा ।
  7. phenol रेड के बिना ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (EMEM) में 10x शेयर MTT समाधान कमजोर द्वारा 1x MTT समाधान की आवश्यक मात्रा तैयार करें ।
    नोट: एक सफल वर्णमिति परख के लिए, MTT प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए । यह EMEM में MTT पतला करने के बजाय DMEM क्रम में पृष्ठभूमि संकेत सीमित करने के लिए सिफारिश की है ।
  8. कुओं से uranyl-युक्त मीडिया को हटाएं, उन्हें पंजाबियों से धोएं और MTT सॉल्यूशन के ४०० µ l को एक अच्छी तरह से जोड़ें (रिक्तियों के लिए 3 खाली कुओं सहित) । अंधेरे में ३७ डिग्री सेल्सियस पर २.५ एच मशीन । माइक्रोस्कोप के तहत सत्यापित करें कि डार्क बैंगनी formazan क्रिस्टल व्यवहार्य कोशिकाओं के अंदर का गठन किया है ।
  9. MTT समाधान छोड़ें और dimethyl sulfoxide (DMSO) के प्रति अच्छी तरह से २२० µ l जोड़ें । एल्यूमीनियम पंनी में लपेटें प्लेटें उंहें प्रकाश से बचाने के लिए और धीरे 10 मिनट के लिए formazan क्रिस्टल भंग करने के लिए आंदोलन ।
  10. ५७० एनएम (formazan विशिष्ट) और ६९० एनएम (पृष्ठभूमि) पर ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) का निर्धारण करने के लिए एक microplate स्पेक्ट्रोमीटर रीडर का प्रयोग करें । प्रत्येक अच्छी तरह के लिए, ५७० एनएम आयुध डिपो से ६९० एनएम ओडी घटाना के लिए खरोंच या मैलापन22के कारण संभव गैर विशिष्ट आयुध डिपो मूल्य अस्थिरता के लिए समायोजित करने के लिए ।
  11. पिछले चरण में प्राप्त आयुध डिपो से खाली का मतलब आयुध डिपो से एक अच्छी तरह के लिए खाली-सही आयुध डिपो की गणना । प्रत्येक प्रायोगिक शर्त के लिए माध्य ओडी मान निर्धारित करें ।
  12. सेट नियंत्रण हालत का मतलब आयुध डिपो ([UO22 +] = 0 मिमी) १००% व्यवहार्यता और अंय परीक्षण uranyl सांद्रता के लिए सेल व्यवहार्यता के इसी प्रतिशत की गणना । एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र प्लाट । Cytotoxicity सूचकांक ५० (CI५०) का मूल्यांकन करें, uranyl एकाग्रता के रूप में परिभाषित ५०% सेल मौत के बाद 24 प्रदर्शन के लिए अग्रणी ।

5. यू (VI) की उपस्थिति में अस्थिशोषक विभेद का विश्लेषण

  1. uranyl और जाल (Tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट) धुंधला की उपस्थिति में कच्चे २६४.७ कोशिकाओं का भेदभाव ।
    1. प्लेट रॉ २६४.७ कोशिकाओं पर एक 24-खैर प्लेट, 3 कुओं प्रायोगिक शर्त के अनुसार । लगभग 6 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन, तैयार करने के लिए समय और uranyl युक्त जोखिम मीडिया equilibrate ।
    2. धारा 3 में वर्णित के रूप में वांछित uranyl सांद्रता के साथ भेदभाव मीडिया तैयार (जीएसटी-RANKL मीडिया को जोड़ने के लिए मत भूलना) ।
    3. धीरे uranyl युक्त माध्यम से कुओं में बुनियादी माध्यम की जगह. इस दिन osteoclastic विभेद के दिन 0 के रूप में माना जाता है ।
    4. osteoclastic भेदभाव के दिन 2 या 3 पर मध्यम बदलें 5.1.2 और 5.1.3 कदम दोहरा कर । Multinucleated osteoclasts 3 और 4 दिन के बीच प्रकट होना चाहिए ।
    5. निर्माता के निर्देशों का पालन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ल्युकोसैट एसिड फॉस्फेट किट के साथ धुंधला जाल प्रदर्शन ।
      नोट: Tartrate-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) भी एसिड फॉस्फेट 5 कहा जाता है, Tartrate प्रतिरोधी (ACP5) अत्यधिक परिपक्व osteoclasts में व्यक्त की है और बड़े पैमाने पर अस्थिशोषक भेदभाव के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया । इसलिए, जाल धुंधला osteoclasts कल्पना करने के लिए किया जाता है । प्रयोगात्मक शर्तों और osteoclastogenesis की दर पर निर्भर करता है, यह दिन 4 या भेदभाव की प्रक्रिया के 5 दिन पर किया जा सकता है ।
    6. पंजाब में जाल से सना हुआ कुओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें आगे के विश्लेषण के लिए (वे इन शर्तों में बनाए रखा जा सकता है अप करने के लिए 3 या 4 सप्ताह) ।
  2. अस्थिशोषक आकार/
    1. एक अच्छी तरह से की पूरी सतह की एक छवि का अधिग्रहण । छवि का रिज़ॉल्यूशन कक्ष नाभिक को अलग करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । ट्रैप-सकारात्मक कोशिकाओं के साथ 3 या अधिक नाभिक, osteoclasts के रूप में पर विचार करें ।
    2. ImageJ सॉफ्टवेयर में अच्छी तरह से एक की एक छवि खोलें: "फ़ाइल" → "खुला".
    3. छवि के ऊपरी बाएँ कोने में स्केल इकाइयों की जाँच करें । रिश्तेदार ठहराव के लिए, किसी भी इकाई का उपयोग किया जा सकता है । अस्थिशोषक आकार का निरपेक्ष मूल्य आवश्यक है, तो स्केल इकाइयों µm करने के लिए कन्वर्ट: "छवि" → "गुण". बॉक्स की जाँच करें "वैश्विक" पॉप-अप विंडो में क्रम में नए स्केल सभी छवियों के लिए लागू की गई इकाइयों के लिए बाद में खोला.
      नोट: यदि एक माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया गया था, µm में पिक्सेल आकार इमेजिंग सॉफ्टवेयर में प्रत्येक उद्देश्य के लिए संकेत दिया है.
    4. विश्लेषण किया जा करने के लिए माप मापदंडों निर्दिष्ट करें: "विश्लेषण" → "माप सेट". माप सेट विंडो में, "क्षेत्र" और "प्रदर्शन लेबल" बक्से की जाँच करें और सभी अन्य बक्सों को अनचेक करें ।
    5. ओपन रॉय (ब्याज के क्षेत्र) प्रबंधक: "विश्लेषण" → "उपकरण" → "रॉय प्रबंधक" ।
    6. मुख्य विंडो में, आयताकार चयन उपकरण उठाओ । यह छवि में कहीं भी उपयोग के बारे में १,००० x १,००० µm के एक क्षेत्र रूपरेखा । यह चयन अब उस प्रथम क्षेत्र को परिभाषित करता है जिसमें अस्थिशोषक आकार का विश्लेषण किया जाएगा.
    7. रॉय प्रबंधक विंडो में, "जोड़ें" बटन पर रॉय प्रबंधक के लिए ब्याज के इस क्षेत्र को जोड़ने और इसे "अधिक" → "सहेजें" पर क्लिक करके बचाने के लिए क्लिक करें । बचाया रॉय अब रॉय प्रबंधक को कभी भी पर क्लिक करके पुनः लोड किया जा सकता है "अधिक" → "खोलो" ।
    8. अस्थिशोषक आकार विश्लेषण के लिए 4 अतिरिक्त क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए चरण 5.2.5-5.2.6 दोहराएं (चित्र 2a और 2d) ।
      नोट: परिभाषित क्षेत्रों सभी छवियों में अस्थिशोषक आकार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    9. विश्लेषण करने के लिए 5 क्षेत्रों में से एक की एक प्रतिलिपि बनाएं: मुख्य रॉय प्रबंधक में इस रॉय को चुना (इसी चयन मुख्य छवि पर दिखाई देगा) → चयन के अंदर ठीक क्लिक करें → "डुप्लिकेट" । इस डुप्लिकेट का उपयोग आगे के विश्लेषण के लिए करें ।
    10. रॉय प्रबंधक विंडो में, "दिखाएं Al" l और "लेबल" बक्से चेक करें ।
    11. मुख्य विंडो में, चयन में osteoclasts में से एक को मैंयुअल रूप से बाह्यरेखांकित करने के लिए बहुभुज चयन उपकरण चुनें । roi प्रबंधक विंडो में "जोड़ें" पर क्लिक करके roi प्रबंधक में इस बाह्यरेखा को जोड़ें. चयनित क्षेत्र (चित्र b और 2E) के अंदर पूरी तरह से झूठ बोलने वाले सभी osteoclasts के लिए इसी तरह आगे बढ़ें ।
    12. रॉय प्रबंधक विंडो में, सभी रूपरेखा का चयन करें और "माप" पर क्लिक करके उनकी सतह को मापने । किसी स्प्रेडशीट में नई विंडो (परिणाम विंडो, चित्र 2c और 2F) में दिखाई गई माप को स्थानांतरित करें ।
      नोट: इस बिंदु पर, सभी osteoclasts रूपरेखा के साथ विश्लेषण के क्षेत्र में एक स्वतंत्र छवि के रूप में सहेजा जा सकता है: "फ़ाइल" → "पसंद के स्वरूप के रूप में सहेजें" ।
    13. वर्तमान छवि के विश्लेषण के शेष क्षेत्रों के लिए चरण 5.2.8-5.2.12 दोहराएं । फिर, सभी अंय छवियों के लिए पूरी प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  3. ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ अस्थिशोषक संख्या विश्लेषण ।
    नोट: well में अस्थिशोषक वितरण के रूप में शायद ही कभी समरूप है, पूरी तरह से बजाय कुछ चुनिंदा क्षेत्रों पर गिनती प्रदर्शन करते हैं । यह देखते हुए कि osteoclasts रूप और आकार में विषम हैं, कोई स्वचालित गिनती सेल विधि व्यवहार्य है ।
    1. ImageJ सॉफ़्टवेयर में एक पूरी-अच्छी छवि खोलें (इस विश्लेषण के लिए, पिछले उप-खंड से छवियों का उपयोग करें) ।
    2. सेल काउंटर विंडो खोलें: "प्लगइंस" → "विश्लेषण" → "सेल काउंटर" । पर क्लिक करें "शुरू" और जांच "1 प्रकार" बॉक्स (या जो भी प्रकार की संख्या आप पसंद करते हैं) । सत्यापित करें कि "संख्या दिखाएँ" बॉक्स चेक किया गया है और "मोड हटाएँ" बॉक्स अनचेक किया गया है ।
    3. छवि पर, एक अस्थिशोषक पर क्लिक करें: रंगीन बिंदी और एक नंबर दिखाई देगा जहां क्लिक किया । सभी osteoclasts के लिए इसी तरह आगे बढ़ें । मार्करों सेल काउंटर विंडो में "सहेजें मार्करों" पर क्लिक करके नियमित रूप से सहेजें
      नोट: यदि अंतिम बिंदु को गिनती से निकाल दिया जाए, तो सेल काउंटर विंडो में "डिलीट" पर क्लिक करें । यदि निकालने के लिए एक से अधिक बिंदु हैं, तो "मोड हटाएं" बॉक्स को चेक करें और उन पर क्लिक करके सभी अमान्य बिंदुओं का संकेत दें. फिर गिनती जारी रखने के लिए "मोड हटाएँ" बॉक्स अनचेक करें.
    4. कक्ष काउंटर विंडो में परिणाम पर क्लिक करके गिनती के परिणाम प्रदर्शित करें । अंतिम गणना परिणाम एक स्प्रेडशीट के लिए स्थानांतरण ।

6. यू (VI) की उपस्थिति में अस्थिशोषक फ़ंक्शन का विश्लेषण

  1. खड्डे याला परख होते.
    1. प्लेट एक 24 अच्छी तरह से आस्टियो परख प्लेट पर कच्चे २६४.७ कोशिकाओं है, जो एक सिंथेटिक अकार्बनिक osteomimetic सतह कि osteoclasts द्वारा resorbed जा सकता है प्रदान करता है ।
      नोट: कोशिकाओं biomimetic सतह को संलग्न करने के लिए, यह अक्सर अंतर मध्यम जोड़ने से पहले उन्हें दिन थाली करने के लिए बेहतर है.
    2. खंड 5 में वर्णित के रूप में RAW २४६.७ कक्षों को osteoclasts में अंतरित करना (चरण 5.1.2-5.1.4)
    3. osteoclastogenesis के 5 दिन पर, uranyl-युक्त मध्यम से 10% ब्लीच समाधान की जगह द्वारा अस्थि करनेवाला सतह से osteoclasts निकालें । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । कुओं को दो बार धोकर पानी से धो लें और उंहें हवा-सूखा दें ।
    4. गैर resorbed क्षेत्रों में कैल्शियम लवण दाग करने के लिए कुओं के लिए एक 1% Alizarin लाल एस सोडियम नमक समाधान जोड़ें । 10-15 मशीन के एस के बाद Alizarin समाधान निकालें और धीरे कुओं धो पानी के साथ 3-4 बार । कुएँ को हवा-सूखा दो.
      नोट: धुंधला प्रक्रिया ऊपर वर्णित resorbed और गैर resorbed क्षेत्रों के बीच विपरीत बढ़ाने के क्रम में लगातार विश्लेषण की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया है । इस प्रक्रिया को ध्यान से किया जाना चाहिए, क्योंकि अगर कुओं दाग से पहले पूरी तरह से शुष्क नहीं हैं, शेष अस्थि-करनेवाला सतह के कुछ हिस्सों को गलती से हटाया जा सकता है । इसके अलावा, अगर Alizarin समाधान कुओं में बहुत लंबा छोड़ दिया है, एक लगातार गैर विशिष्ट धुंधला दिखाई देगा । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस खंड में वर्णित परीक्षण दोनों osteoclastic भेदभाव और समारोह पर यूरेनियम के प्रभाव से संबंधित है । अस्थिशोषक गठन के स्वतंत्र रूप से याला पर यूरेनियम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, कच्चे २६४.७ कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए uranyl-युक्त माध्यम से इलाज किया जा सकता है, केवल एक बार परिपक्व osteoclasts (4 दिन में या भेदभाव की प्रक्रिया के 5) का गठन कर रहे हैं 23।
  2. खड्डे याला विश्लेषण.
    1. आस्टियो परख प्लेट की एक अच्छी तरह से की पूरी सतह की एक छवि प्राप्त करते हैं ।
      नोट: छवि प्राप्ति विधियाँ भिन्न हो सकते हैं लेकिन प्रतिकृति प्रयोगों के दौरान संगत होना चाहिए । वे एक निश्चित कैमरा, एक उच्च संकल्प स्कैन या एक मोज़ेक एक स्वचालित उच्च प्रवाह माइक्रोस्कोप के साथ बनाया छवि का एक स्थूल उद्देश्य के साथ लिया चित्र शामिल कर सकते हैं ।
    2. पिछले अनुभाग से 5.2.4 करने के लिए 5.2.2 चरणों को दोहरा कर विश्लेषण प्रारंभ करें ।
    3. एक आरजीबी छवि को एक greyscale 8 बिट प्रारूप में कनवर्ट करें: "छवि" → "प्रकार" → "8 बिट".
    4. मुख्य विंडो में, अंडाकार चयन उपकरण का चयन करें । इसका इस्तेमाल एक सर्कल आकर्षित करने के लिए अच्छी तरह से की सभी सतह रूपरेखा के लिए याला विश्लेषण किया जाएगा ।
    5. इस नए ROI के रूप में चरण 5.2.6 में सहेजें ।
    6. दहलीज चयन की सुविधा के लिए, परिभाषित रॉय के बाहर सभी सुविधाओं को स्पष्ट: "संपादित करें" → "स्पष्ट बाहर".
      नोट: इस बिंदु पर, यह अक्सर छवि की कुछ प्रतियां बनाने के लिए बेहतर है: चयनित क्षेत्र → छवि पर दायां क्लिक करें → "डुप्लिकेट" के बाहर क्लिक करके रॉय का चयन करें । यह क्रिया यदि अगले चरण में चुनी गई सीमा असंतोषजनक है, तो ऊपर वर्णित छवि उपचार की पुनरावृत्ति से बचने में मदद करेगी ।
    7. "छवि" → "समायोजित" → "थ्रेशोल्ड" का चयन करें । थ्रेशोल्ड विंडो में, एक उपयुक्त थ्रेशोल्ड चुनने के लिए स्लाइडर पट्टी का उपयोग करें. सभी resorbed क्षेत्रों दहलीज (सफेद) और गैर resorbed, ऊपर (लाल) के नीचे होना चाहिए । दहलीज चयन को अंतिम रूप देने के लिए, दहलीज विंडो में "लागू करें" पर क्लिक करे ।
    8. अंतिम बाइनरी छवि सहेजें: "फ़ाइल" → "के रूप में सहेजें" → अपनी पसंद का प्रारूप ।
    9. माप को परिभाषित करने के लिए ब्याज के क्षेत्र में लिया जाएगा: "विश्लेषण" → "माप सेट". माप सेट विंडो में, "क्षेत्र", "क्षेत्र भिन्न" और "सीमा करने के लिए थ्रेशोल्ड" बक्से की जाँच करें और सभी अन्य लोगों को अचयनित.
    10. आदेश में सीधे परिणाम विंडो में "resorbed" क्षेत्र के अंश प्राप्त करने के लिए, द्विआधारी छवि उलटा ("संपादित करें" → "उलटा") । सुनिश्चित करें कि मुख्य रॉय अंतिम बाइनरी छवि पर चुना गया है (अन्यथा resorbed क्षेत्र अंश पूरी छवि विंडो की सतह के आधार पर गणना की जाएगी). या तो रॉय प्रबंधक विंडो में "माप" पर क्लिक करके या "विश्लेषण" → "उपाय" पर resorbed क्षेत्र अंश को मापने । परिणाम सहेजें ।

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Representative Results

Tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट धुंधला बड़े बैंगनी 3 या अधिक नाभिक होने कोशिकाओं के रूप में osteoclasts कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । RANKL और uranyl आयनों की उपस्थिति में कल्चरित कच्चे २६४.७ कोशिकाओं से प्राप्त osteoclasts के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 1में दिखाया गया है. संख्या और यूरेनियम के जवाब में osteoclasts के आकार में परिवर्तन आसानी से पूरे कुओं की समग्र छवियों में और बढ़े हुए चित्रों में दिखाई दे रहे हैं ।

osteoclasts का आकार ImageJ सॉफ्टवेयर (चित्रा 2) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था । इस प्रयोजन के लिए, जाल सना हुआ osteoclasts के पूरे अच्छी तरह से छवियों का इस्तेमाल किया गया और एक ही क्षेत्र में प्रत्येक संस्कृति की स्थिति का एक अच्छी तरह से इलाज कर रहे थे (चित्रा 2a और 2d) । प्रत्येक क्षेत्र में उपस्थित सभी osteoclasts (चित्रा 2 बी और 2E) को रेखांकित किया गया जो अपने क्षेत्र के निर्धारण की अनुमति दी (µm२) ( चित्र 2c और 2F) में व्यक्त किए । चित्रा 2 में दिखाया उदाहरण अस्थिशोषक आकार पर यूरेनियम के मजबूत प्रभाव को उदाहरण देकर स्पष्ट करना ।

अस्थिशोषक याला गतिविधि पर यूरेनियम के प्रभाव की जांच करने के लिए, कच्चे २६४.७ कोशिकाओं चढ़ाया और osteomimetic सतह प्लेट पर विभेदित किया गया । अंत में परख कर osteoclasts निकाले गए । तो, एक अच्छी तरह से हड्डी करनेवाला सतह में Alizarin लाल एस सोडियम नमक द्वारा इलाज के लिए गैर दाग-resorbed क्षेत्र और प्रत्येक पूरी तरह से छवियों का अधिग्रहण किया गया था (चित्र 3 ए और 3 डी) । परिणामस्वरूप चित्रों छवि जंमू सॉफ्टवेयर के साथ कार्रवाई की गई । वे 8 बिट greyscale छवियों (चित्र 3 और 3E) में कनवर्ट किए गए थे, जो कि थ्रेशोल्ड (आरेख 4 और 3F) के अधीन हैं और resorbed क्षेत्र (सफेद क्षेत्र) की गणना स्वचालित रूप से की गई थी ।

Figure 1
चित्रा 1: अस्थिशोषक गठन पर यू (VI) के प्रभाव का दृश्य. कच्चे २६४.७ कोशिकाओं uranyl के संकेत एकाग्रता की उपस्थिति में अंतर किया गया । 4 दिन में, tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) धुंधला प्रदर्शन किया गया । प्रतिनिधि पूरी अच्छी तरह से माइक्रोग्राफ (ऊपरी पैनल) दिखाने के जाल-सना हुआ osteoclasts इन परिस्थितियों में प्राप्त की । बॉक्स्ड क्षेत्रों में multinucleated osteoclasts के उदाहरण एक उच्च आवर्धन (नीचे पैनलों में तीर) पर दिखाए जाते हैं । इन चित्रों को अस्थिशोषक गठन पर (VI) यू के खुराक पर निर्भर प्रभाव उदाहरण देकर स्पष्ट करना । काले सिर तीर अस्थिशोषक नाभिक के उदाहरणों का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: अस्थिशोषक आकार पर यू (VI) के प्रभाव का विश्लेषण. (A और D): बॉक्स्ड क्षेत्र जिसमें अस्थिशोषक आकार का विश्लेषण किया गया था करने के लिए इसी के साथ osteoclasts की पूरी-अच्छी तरह से छवियां दिखाया गया है । लाल बक्से क्षेत्र में (ए और डी) (ख) और (ई), क्रमशः में दिखाया उन के अनुरूप हैं । (B और E): दो uranyl में अस्थिशोषक किनारों के मैनुअल ड्राइंग-एकाग्रता की स्थिति में नीले रंग में दिखाया गया है । (सी और एफ): ImageJ सॉफ्टवेयर से (बी और ई) विश्लेषण क्रमशः माप दिखा खिड़कियों से परिणाम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: अस्थिशोषक फ़ंक्शन पर यू (VI) के प्रभाव का विश्लेषण. osteoclastic के बाद Alizarin सना हुआ osteomimetic सतह की छवियां है कि अभाव (एक) में या uranyl (डी) के 25 µ मीटर की उपस्थिति में जगह ले ली । चित्र (A और D) में पहले 8 बिट greyscale छवियों में कनवर्ट किए गए के रूप में (B और E) और, बाद में, एक उपयुक्त थ्रेशोल्ड सेटिंग लागू करके बाइनरी छवियों (C और F) में दिखाया गया है । ये बाइनरी छवियाँ प्रत्येक स्थिति में क्षेत्र resorbed का प्रतिशत परिकलित करने के लिए उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जहां तक हम जानते हैं, यह पहली बार है कि एक विस्तृत करने के लिए अस्थि resorbing कोशिकाओं पर प्राकृतिक यूरेनियम के प्रभाव का अध्ययन लक्ष्य प्रक्रिया वर्णित है । इस दृष्टिकोण के लिए अस्थि शरीर क्रिया विज्ञान पर यूरेनियम प्रभाव की एक बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए उपयोगी हो जाएगा और यूरेनियम chelators की स्क्रीनिंग के लिए एक दिलचस्प नए उपकरण प्रदान कर सकते हैं । इसके अलावा, हमें विश्वास है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल osteoclatogenesis पर अंय भारी धातुओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

यह ज्ञात है कि uranyl संस्कृति मीडिया में अकार्बनिक और कार्बनिक घटकों के साथ जटिल है18,19,20,21। इन जटिलताओं यूरेनियम के speciation प्रभाव और, इस तरह से, अपने cytotoxicity । इस कारण से, प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम यूरेनियम युक्त संस्कृति मीडिया की तैयारी है । हम पहले23 दिखाया गया है कि कच्चे २६४.७ कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम की उपस्थिति uranyl के cytotoxicity पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव जब 0 से ४०० µ एम को लेकर सांद्रता में इस्तेमाल किया था । यह एक महत्वपूर्ण बिंदु है, के रूप में सीरम की उपस्थिति के माध्यम में osteoclastic विभेद की पूरी प्रक्रिया के दौरान यूरेनियम जोखिम के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है । फिर भी, हम जोर देना चाहते है कि लंबे समय दो कदम प्रक्रिया जोखिम मीडिया (6 घंटे) की तैयारी के लिए वर्णित सावधानी से पीछा किया जाना चाहिए । दरअसल, uranyl लवण के प्रत्येक कमजोर पड़ने के बाद 3 घंटे की मशीन कदम संभावित रूप से आगे कमजोर पड़ने या सेल जोखिम से पहले समाधान में गठित uranyl परिसरों के स्थिरीकरण की अनुमति देता है । यह बिल्कुल विश्वसनीय और प्रतिलिपि परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

अस्थिशोषक भेदभाव और याला परख के reproducibility के लिए एक अंय महत्वपूर्ण पैरामीटर कच्चे २६४. 7 कोशिकाओं के बीज घनत्व है । वास्तव में, यह दिखाया गया है कि mononuclear प्रणेता घनत्व अस्थिशोषक गठन के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक है, सबसे शायद इसलिए कि सेल से सेल निकटता सेलुलर संलयन घटनाओं24प्रभावित करता है । इसलिए, एक विशेष ध्यान सेल की गिनती के लिए भुगतान किया जाना चाहिए, सेलुलर निलंबन की तैयारी और एक अच्छी तरह से में बोने की एकरूपता, ताकि अशुद्ध अर्थ से बचने के लिए ।

थ्रेसहोल्ड उपकरण ठहराव के अवशोषण के लिए उपयोगी है । यह मूल्य उस ओर इशारा करते हुए कि इस विश्लेषण अच्छी तरह से प्रबुद्ध छवियों की आवश्यकता है । हालांकि, कैमरे और छवि अधिग्रहण विधि के प्रकार की परवाह किए बिना एक आम समस्या छवि के किनारों पर असमान रोशनी है । उस स्थिति में, एक बहु-चरण थ्रेशोल्ड विधि आवश्यक हो सकता है ।

संक्षेप में, हम एक मजबूत अस्थिशोषक गठन, व्यवहार्यता और समारोह पर यूरेनियम प्रभाव के अध्ययन की अनुमति प्रोटोकॉल की स्थापना की है । इस प्रक्रिया को कच्चे २६४.७ सेल लाइन का उपयोग करके विकसित किया गया है, लेकिन प्राथमिक अस्थि मज्जा अस्थिशोषक के लिए पूरी तरह से लागू है पुरोगामी के रूप में हम23दिखाया गया है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

लेखक सहायक तकनीकी सहायता के लिए नामजप Cros का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
इस अनुसंधान अनुदान द्वारा "Commissariat à l'Energie Atomique एट aux ऊर्जा विकल्प" (URANOs-कार्यक्रम आड़ा de Toxicologie du सीईए और CPRR सीईए-अरेवा) से वित्त पोषित किया गया था, और ANR से (यूरेनियम की विषाक्तता: biomineralization के बहु स्तरीय दृष्टिकोण प्रक्रिया अस्थि, ANR-16-CE34-0003) में । यह काम भी अच्छा सोफिया के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था-sophia और CNRS ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

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References

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