Summary
这篇手稿描述的拷贝数变异分析进行血清或血浆 DNA 使用 real-time PCR 方法。该方法适用于抗去势前列腺癌患者的耐药性预测, 但也可为其他疾病提供信息。
Abstract
血清和血浆细胞游离 DNA (cfDNA) 已被证明是一个信息, 无创的生物标志物的癌症诊断, 预后, 监测和预测的治疗阻力。从雄激素受体 (AR) 基因拷贝数 (CN) 增益是转移性去势抵抗前列腺癌 (mCRPC) 的一个常见事件的假说出发, 我们建议在 cfDNA 中分析这一事件作为一个潜在的预测生物标志物。
我们使用2不同的 real-time PCR 方法和2参考基因 (RNaseP和前1) 在 cfDNA 中评估了AR CN。每种化验组合均使用 60 ng 的 DNA 量。AR利用数字 PCR 技术确定 CN 增益是一种较为准确的方法。CN 变异分析已经被证明在 mCRPC 的设置中对治疗阻力的预测是有帮助的, 但在不同的病人设置中也可以用于其他用途。CN 对 cfDNA 的分析有几个优点: 无创、快速、易于执行, 并从少量的血清或血浆材料开始。
Introduction
血液中的循环细胞游离 DNA (cfDNA) 已被证明是肿瘤诊断、预后、监测和治疗耐药性预测的最理想的生物标志物来源1,2。许多研究表明, 在组织中的 DNA 改变 (突变, 拷贝数变异, 表观修饰) 和对应的血浆样本中发现的1, 证实了循环肿瘤 dna (ctDNA) 的良好一致性初级和转移性肿瘤组织改变的信息3。研究 ctDNA 的可能性因而允许重建基因组重和拷贝数字变异 (cnv) 在具体致癌基因4, 辨认可能的转移的克隆和 subclonal 细胞。CtDNA 已被证明是临床有用的, 特别是癌症治疗监测, 因为它的特定的基因突变和 cnv, 相关的特定靶向治疗5,6。它还克服了组织活检的需要, 并允许在不同的时间在特定的癌症治疗非侵入性的方式获得的结果。
关于前列腺癌, 循环无细胞雄激素受体 (ar) cnv 和治疗反应的阿比特龙和 enzalutamide 的显着相关性已经显示, 表明AR基因复制号 (CN) 在 cfDNA 可能是一个有前途的生物标志物能够预测治疗阻力7,8,9,10,11。利用不同的灵敏度、成本和速度 (e. g、real-time、数字 PCR 和下一代测序), 可以对 ctDNA 中特定基因的 cnv 进行评估。
在这里, 我们描述了一个简单和快速的方法, 基于双相分析的 real-time PCR 技术, 以评估AR CN 在 cfDNA 从血清和血浆样本7,8。我们考虑了两种不同的 PCR 分析设计的两个不同的基因组区域内的内含子5的AR (Xq12) 和其他两个基因, 作为内部标准参考基因已知有一个正常的拷贝数状态在前列腺癌 (RNaseP,位于 14q11;前1, 位于1p34 上。我们选择了两个参考基因, 而不是一个, 以提高精度和灵敏度的结果。每个化验组合 ( AR-assay_1+RNaseP和AR-assay_2+AGO1的组合检测) 的 DNA 数量为 60 ng。三个健康男性的血清或血浆 DNA 样本被汇集并作为校验仪使用。我们考虑了保险丝 #62; 1.5 用于AR增益和 #60; 0.5 用于删除。这种方法的一个主要优点是它是灵活的, 其他基因也可以被评估, 改变标准的内部参考基因, 根据肿瘤类型和特点。
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Protocol
该协议包括从血清或血浆样品中分离出 DNA, 以进行 real-time PCR 进行拷贝数分析。对特定靶点进行 dna 提取、dna 量控制 (分光光度计) 和 real-time PCR。在图 1中, 报告了过程和时间线的摘要。
该议定书遵循红外人类研究伦理委员会的准则。
1. 血清采集与处理
- 在没有抗凝血的血清管中收集大约5毫升全血, 以获得血清。在4° c 时保持血液管直到加工。
- 离心管在 1000 x g 为 15 min 在4° c。
- 小心地将血清转化为2毫升的管子。
- 丢弃收集管, 并立即冻结上清在-80 ° c, 直到使用。
2. 等离子采集与处理
- 在等离子体管中收集大约10毫升全血, 用 EDTA 获得血浆。完全填充管, 然后倒置8次。在4° c 时保持血液管直到加工。
- 离心管在 1800 x g 为15分钟在室温下没有刹车设置在离心机。
- 小心地将血浆的上部转换成2毫升的管子。重复转移, 在白细胞层上方至少留下1毫升的上清液。
注: 上部上清的转移降低了细胞或细胞碎片的污染风险。 - 丢弃收集管, 并立即冻结上清在-80 ° c, 直到使用。
3. 从血清或血浆中分离 DNA
注意: 从血清或血浆中分离出的 DNA 应使用以下步骤中修改的商业协议进行。
- 在室温下解冻一分 (含0.5 至2毫升) 的血清或血浆。
- 涡流和混合的样本和转移0.5 毫升的血清或血浆到一个明确的1.5 毫升管。将其余的材料冷冻在-80 ° c。
- 将50µL 的蛋白酶 k (20 毫克/毫升) 直接添加到样品中。
- 在样品中加入0.5 毫升的裂解缓冲液, 并由移混合均匀。
- 关闭管和孵化样品在56° c 为15分钟的热块。
- 在洗涤缓冲器1和2中添加指示的100% 乙醇, 如制造商的说明所示。
- 将样品带回室温, 加入0.5 毫升的绝对乙醇, 并由移混合均匀。
- 将步骤3.7 中获得的混合物的650µL 加到分离柱上, 并在 6000 x g 处离心1分钟。
- 丢弃包含流经的管道, 并将柱放在新的清洁收集管上。重复步骤3.8 和 3.9, 再一次。
- 添加500µL 洗涤缓冲器 1, 不润湿柱的边缘和离心在 6000 x g 为1分钟。
- 丢弃含有流动的管子, 用新的干净的收集管代替。
- 添加500µL 洗涤缓冲器 2, 不润湿柱的边缘和离心机全速 (2万 x g) 为3分钟。
- 丢弃含有流动的管子, 用新的干净的收集管代替。
- 离心机在全速 (2万 x g) 为3分钟, 以消除任何残留洗涤缓冲区。
- 把柱子放到一个干净的1.5 毫升管子里。添加150µL 的洗脱缓冲器, 并等待7分钟, 以确保缓冲区润湿列。
- 离心机在 8000 x g 为1分钟。
- 将洗从步骤3.16 再次移入同一个柱, 并以全速 (2万 x g) 离心机1分钟, 以确保 DNA 的最大回收率。
4. DNA 的量化和稀释
- 使用分光光度计对 DNA 进行量化。根据制造商的指示, 使用2µL 的样品在台式分光光度计上。
注: 如果 dna 数量不足以进行 real-time PCR (至少 120 ng), 则进行新的 dna 分离过程。 - 将血清或血浆中的 DNA 稀释到 2.5 ng/µL, 最终体积足以用于所有 real-time PCR (约50µL)。
5. 实时 PCR
- 解冻拷贝数化验, 参考基因检测, DNA 稀释样品, 和校验仪汇集在冰。平衡在室温下储存在4° c 的主混合。
- 准备一个混合1µL 的目标化验, 1 µL 的参考基因检测, 和10µL 的主混合3复制的每个样本和校准仪汇集。准备混合包括负控制 (水) 和2额外的样品。
- 在一个96井板, 分12µL 的混合到每一个井。不要吸管或旋转管。
- 添加8µL (浓度 2.5 ng/µL) 的每个 DNA 样本和校准仪汇集到每一个井。不要吸管或旋转管。改变每个井的小费。
注:30 DNA 样品可以用96井板进行实时实验处理:30 x 3 样品 + 1 x 3 校验仪池 + 负控制 = 94。 - 简要地在 1000 x g 旋转盘子。
- 使用以下协议运行板: 举行阶段在95° c 为10分钟, 40 周期在95° c 为十五年代, 和60° c 为 1 min。
6. 数据分析和解释
- 在 "选项" 一节中, 在放大图结果的下面, 将第一个目标基因的 Ct 阈值设置为0.2。为每个目标或参考基因重复该设置。要将 real-time PCR 文件导出为 .txt 扩展名, 请按 "导出" 工具栏。只标记 "结果" 在 "选择要导出的数据" → "选择文件类型" 扩展名. txt →按 "开始导出" →关闭导出工具。
- 打开分析软件并导入文件 .txt (工具栏→导入)。
- 选择要分析的文件名称, 然后按工具栏 ("播放符号") 选择分析设置。
- 指定校准器示例和已知的目标副本数 (例如, 1 副本用于AR基因)。按 "申请"
- 对于每个样品, 省略一井与不同的三角洲 Ct (ΔCt) 与其他井比较。
- 分析实验 (按播放符号)。
- 通过复制数字条形图或表来计算结果。
注意: 结果表包含许多参数, 如置信度、Z 评分和分析的复制, 这对结果解释很有用。
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Representative Results
对所有样品进行分光光度法测定的总 cfDNA 浓度, 显示 6.12 ng/µL (范围: 2.00-23.71 ng/µL) 的血清样品的中位数和 3.21 ng/µL (范围: 2.31-8.49 ng/µL) 血浆样品的中位数。通过 real-time PCR 实验, 我们总共分析了115样品。
对AR的高或低增益患者的混合血清 dna 和健康捐献者的 dna 进行了测试灵敏度评估, 这也被用作拷贝数分析的校验仪样本。如图 2所示, ar CN 在0.375% 的患者 dna 中得到充分检测, 其中ar增益与健康的供体 dna 混合, 以获得可检测到的基因增益 (图 2)。因此, 这种方法检测到的拷贝数增益非常低。计算了每位患者的ΔCt 标准偏差 (中等± SD = 0.1, 范围: 0.00-0.36)。我们使用标准偏差值的中点来选择拷贝数增益截止。
我们分析了使用阿比特龙 (n = 53) 治疗的患者的ar的拷贝数, 发现 16 (30.2%) 患者出现ar增益7。同样, 我们分析了 enzalutamide (n = 59) 治疗的患者的ar基因的拷贝数变化, 在 21 (36%) 患者中发现ar增益8。
此外, 我们使用卡普兰-梅尔方法和对数秩测试对AR CN 与临床结局之间的关联进行了评估, 并发现了一个重要的关联。特别是, 阿比特龙治疗病例系列的AR基因增益显示了2.8 与9.5 月的 non-gained 病例的中位进展自由生存 (PFS) (p和 #60; 0.0001)。在具有AR CN 增益 (p和 #60; 0.0001) 的患者中, 还报告了总体生存率较低的 (OS)。
同样, 对于 enzalutamide 病例系列, 我们发现了一个2.4 与4.0 月的患者的中间 PFS, 对于没有增益的患者 (p = 0.0004), 该值为AR增益。此外, 有AR CN 增益的患者的中位数是6.1 与14.1 月, 对于那些没有增益的人 (p = 0.0003)。使用其他方法 (包括数字 pcr (图 3) 确定了从 real-time pcr 方法获得的所有AR CN 增益结果。
图1。工作流和时间线.方法工作流分为不同的步骤和时间。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.对ar CN 检测方法的灵敏度进行了测试, 使用2不同的池 (样本1和样本 2) 从健康捐献者和从不动产患者获得的 DNA 中提取的ar基因, 混合在不同浓度。患者的 dna 是混合的百分比, 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50, 和 100, 关于总 dna。红线: AR CN 增益 (1.5) 的截止。此图已从 chomiak-salvi et al.中修改7
图 3.AR结果比较了 real-time pcr (qPCR) 和数字 pcr (dPCR) 对几种患者 (x 轴) 的疗效。黑线: AR CN 增益 (1.5) 的截止。此图已从 chomiak-salvi et al.中修改7
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Discussion
AR血清和血浆样品中的 CN 分析是一种新的非侵入性方法, 用于去势抗前列腺癌 (不动产) 患者的分层。最近已经证明, AR CN 能够预测不动产患者治疗阿比特龙和 enzalutamide, 化疗前后的结果7,8,9,10。
我们的方法的主要优点是, 该协议是非常简单的执行, 包括只有一个 DNA 隔离过程, 一个 real-time PCR 分析和简单的数据解释。此外, 该测试可以在1工作日内快速完成, 而且程序也很便宜 (大约每样20美元)。我们已经证明, 这种方法是高度重现性的, 并取得的结果是符合那些来自更昂贵和准确的方法, 包括数字 PCR7,8。此外, 我们发现了一个类似的AR增益频率检测与目标 NGS 方法对等离子体样品处理阿比特龙9,10。另一个重要的优势是, 这种方法是灵活的, 可以适用于其他疾病, 其中AR基因具有重要的作用。此外, 还可以根据感兴趣的疾病选择其他目标和参考基因。
CN 分析血清中的AR基因也有一定的局限性。首先, DNA 分光光度定量方法通常不精确, 可以用其他更精确的荧光方法代替。更精确的量化可以提供更精确的 CN 结果。其次, 一些研究表明, 它可以更好地分析血浆 dna 而不是血清 dna。在血清中, 循环细胞游离 dna 的数量一般高于血浆中的12,13, 这是由于血清中白细胞的凝结, 表明血清可能是肿瘤特异 dna 分析的更坏来源因为可能存在的野生型 DNA。
用 real-time PCR 方法对112例不动产患者进行血清中的AR基因的分析, 然后开始治疗 enzalutamide 或阿比特龙。我们的数据显示, 在 cfDNA 上的AR CN 是一个强大的临床结果和抗阿比特龙和 enzalutamide 的基因生物标志物, 并可用于识别可能有益于先验的抗AR疗法或采用快速、低成本的 PCR 方法进行化疗。这些发现突出了研究血液作为一种微创的方法, 在早期和晚期不动产的治疗阻力的机制的效用。未来, 前瞻性和较大的研究应分层患者的循环AR状态, 鉴于随后的临床结果和治疗反应的差异。
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Disclosures
作者声明没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们感谢 Chiara 莫利纳利和因扎吉 Martignano 在数据分析方面的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
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