Summary
Dit manuscript beschrijft de kopie nummer variatie analyse uitgevoerd in serum of plasma DNA met behulp van real-time PCR-aanpak. Deze methode is geschikt voor de voorspelling van medicamenteuze resistentie bij castratie resistente prostaatkanker patiënten, maar het zou informatief ook voor andere ziekten.
Abstract
Serum en plasma cel gratis DNA (cfDNA) is aangetoond als een informatieve, niet-invasieve bron van biomarkers voor diagnose, prognose, toezicht en voorspelling van behandeling verzet. Vanaf de hypothese dat de androgeen receptor (AR) gene exemplaaraantal (CN) krijgen is een frequente evenement in metastatische castratie weerstand prostaatkanker (mCRPC), wij willen dit evenement in de cfDNA als een potentiële voorspellende biomarker analyseren.
We geëvalueerd AR CN in cfDNA met behulp van 2 verschillende real-time PCR-testen en 2 Referentie genen (RNaseP en geleden1). DNA bedrag van 60 ng werd gebruikt voor elke combinatie van assay. AR CN winst werd bevestigd met behulp van digitale PCR als een nauwkeuriger methode. CN variatie analyse heeft reeds aangetoond informatief voor de voorspelling van behandeling verzet in het kader van mCRPC, maar het kan zinvol zijn ook voor andere doeleinden in verschillende settings van de patiënt. GN-analyse op cfDNA heeft verschillende voordelen: het is niet-invasief, snelle en gemakkelijk uit te voeren, en het begint vanaf een klein volume van serum of plasma materiaal.
Introduction
Cel gratis DNA (cfDNA) in het bloed circuleren heeft aangetoond dat een optimale bron van biomarkers voor diagnose, prognose, toezicht en voorspelling van1,2van de weerstand van de behandeling. Vele studies hebben aangetoond een goede overeenstemming tussen DNA veranderingen (mutaties, kopie aantal variaties, epigenetische aanpassingen in de weefsels) en die gevonden in overeenkomstige plasma monsters1, bevestigt dat de circulerende tumor DNA (ctDNA) is informatief voor primaire en uitgezaaide tumor weefsel wijzigingen3. De mogelijkheid van het bestuderen van ctDNA voorziet dus in de wederopbouw van de genomische herschikkingen en kopie aantal variaties (CNVs) op specifieke oncogenen4, die de potentieel metastatische klonen en subclonal cellen aangeeft. CtDNA is aangetoond dat klinisch nuttig zijn vooral voor kanker behandeling monitoring als het specifieke mutaties en CNVs, aan specifieke gerichte therapieën5,6gerelateerde havens. Het ook overwint de behoefte aan weefsel biopsieën en laat resultaten kunnen worden verkregen op verschillende tijdstippen gedurende een bepaald kankerbehandeling in een niet-invasieve wijze.
Met betrekking tot prostaatkanker, een significante correlatie tussen het circuleren van cel-vrije androgeen receptor (AR) CNVs en behandeling response to abiraterone en enzalutamide is aangetoond, met de vermelding AR gene exemplaaraantal (CN) in cfDNA kan een veelbelovende biomarker kunnen voorspellen behandeling verzet7,8,9,10,11. CNVs van specifieke genen in ctDNA kunnen worden geëvalueerd aan de hand van verschillende benaderingen met verschillende gevoeligheid, kosten en snelheid (bv. real-time, digitale PCR, en Next Generation Sequencing).
Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle aanpak, gebaseerd op dubbelzijdig testen in real-time PCR-technologie, voor de evaluatie van de AR CN in cfDNA van serum en plasma monsters7,8. Wij vonden twee verschillende PCR-tests ontworpen op twee verschillende genomic regio's binnen de intron 5 voor AR (Xq12) en twee andere genen, als interne standaard referentie genen bekend dat een aantal status van normale kopie in prostaatkanker (RNaseP, gelegen op 14q11; AGO1, gelegen op 1 p 34). We kozen twee referentie genen, in plaats van één, de precisie en de gevoeligheid van de resultaten te verhogen. Een hoeveelheid van DNA van 60 ng werd versterkt voor elke combinatie van assay (gecombineerde assay voor AR-assay_1 + RNaseP en voor AR-assay_2 + AGO1). Drie serum of plasma DNA-monsters van gezonde mannen werden samengevoegd en gebruikt als een kalibrator. We hebben overwogen cutoffs van > 1.5 voor AR gewin en < 0,5 voor verwijdering. Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is dat het flexibel is en dat kunnen ook andere genen worden geëvalueerd, veranderen de standaard interne referentie genen, op basis van de tumor type en kenmerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol bestaat uit de isolatie van DNA uit serum of plasma monsters voor het uitvoeren van PCR in real time voor kopie nummer analyse. DNA-extractie, controle van de hoeveelheid DNA (spectrofotometer) en PCR in real time voor specifieke doelstellingen werden uitgevoerd. In Figuur 1wordt een overzicht van de procedures en de tijdlijn worden gemeld.
Het protocol volgt de richtsnoeren van de Commissie van de ethiek van het onderzoek van het eerste het menselijke.
1. serum verzameling en verwerking
- Verzamelen van ongeveer 5 mL bloed in de buis van een serum zonder antistollingsmiddel verkrijgen van serum. Handhaving van bloed buizen bij 4 ° C tot verwerking.
- Centrifuge buizen bij 1.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Breng zorgvuldig serum in 2 mL tubes.
- Negeren van de auteursrechtenorganisaties buis en onmiddellijk bevriezen het supernatant bij-80 ° C tot gebruik.
2. plasma verzameling en verwerking
- Verzamelen van ongeveer 10 mL bloed in de buis van een plasma met EDTA plasma verkrijgen. De buis volledig te vullen en vervolgens het 8 keer omkeren. Handhaving van bloed buizen bij 4 ° C tot verwerking.
- Centrifugeer de buis bij 1800 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met geen instelling van de rem op de centrifuge.
- Breng zorgvuldig het bovenste deel van het plasma in 2 mL tubes. Herhaal de overdracht, ten minste 1 mL van het supernatans dat boven de witte cellaag verlaten.
Opmerking: Overdracht van het bovenste gedeelte van het supernatans dat vermindert het risico van besmetting door cellen of cel puin. - Negeren van de auteursrechtenorganisaties buis en onmiddellijk bevriezen het supernatant bij-80 ° C tot gebruik.
3. DNA isolatie van Serum of Plasma
Opmerking: Isolatie van DNA van serum of plasma moet worden uitgevoerd met behulp van het commerciële protocol bewerkt in de volgende stappen.
- Ontdooi een hoeveelheid (bevat van 0,5 tot 2 mL) serum of plasma bij kamertemperatuur.
- Vortex en mengen van het monster af en breng 0,5 mL serum of plasma in een duidelijk 1.5 mL-buis. Bevriezen van de rest van het materiaal bij-80 ° C.
- Voeg 50 µL van proteïnase k (20 mg/mL) direct aan het monster.
- Voeg 0,5 mL lysisbuffermengsel aan het monster en meng goed door pipetteren.
- Sluit de buizen en incubeer monsters bij 56 ° C gedurende 15 min. in het blok van de warmte.
- De aangegeven hoeveelheid 100% ethanol op was buffer 1 en 2, toevoegen, zoals aangegeven door de instructies van de fabrikant.
- Breng de monsters terug op kamertemperatuur en Voeg 0,5 mL van absolute ethanol en meng goed door pipetteren.
- Voeg 650 µL van het mengsel in stap 3.7 aan de scheiding kolom en centrifuge op 6.000 x g voor 1 min verkregen.
- Negeren van de buis met de stroom door en plaats van de kolom op een nieuwe schone collectie buis. Herhaal stap 3.8 en 3.9 één meer tijd.
- Voeg 500 µL van was buffer 1, zonder de bevochtiging van de rand van de kolom en centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 1 minuut.
- De buis met de stroom door verwijderen en vervangen door een nieuwe schone collectie buis.
- Voeg 500 µL van was buffer 2, zonder de bevochtiging van de rand van de kolom en de centrifuge op volle snelheid (20.000 x g) gedurende 3 minuten.
- De buis met de stroom door verwijderen en vervangen door een nieuwe schone collectie buis.
- Centrifugeer bij volledige snelheid (20.000 x g) voor de 3 min te verwijderen van alle resterende wassen-buffer.
- Plaats de kolom in een schone 1,5 mL-buis. Voeg 150 µL van elutie buffer en wacht 7 min om ervoor te zorgen dat buffer wets de kolom.
- Centrifugeer bij 8.000 x g voor 1 min.
- Pipetteer de elute uit stap 3.16 opnieuw in dezelfde kolom en centrifuge op volle snelheid (20.000 x g) voor 1 min maximale herstel van DNA te waarborgen.
4. DNA kwantificering en verdunning
- Uitvoeren van kwantificering van DNA met een spectrofotometer. Gebruik 2 µL van het monster op een bank-top spectrofotometer per de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Als de hoeveelheid DNA is niet voldoende om door te gaan met PCR in real time (minstens 120 ng), een nieuw DNA isolatie proces uit te voeren. - Verdun DNA uit serum of plasma tot 2,5 ng/µL in een eindvolume voldoende voor alle real-time PCR (ongeveer 50 µL).
5. real-time PCR
- Ontdooi kopie nummer testen, referentie gene assay, verdund DNA-monsters en kalibratoren gebundeld in ijs. Equilibreer bij kamertemperatuur de master mix die is opgeslagen bij 4 ° C.
- Een mix van 1 µL van doel assay, 1 µL van referentie gene bepaling en 10 µL van master mix voorbereiden op 3 wordt gerepliceerd van elk monster en kalibratoren gebundeld. De mix met inbegrip van een negatieve controle (water) en 2 extra monsters te bereiden.
- In een 96 goed plaat, aliquoot 12 µL van het mengsel in elk putje. Doen niet pipet of spin tubes.
- Voeg 8 µL (concentratie van 2,5 ng/µL) van elke steekproef van DNA en kalibratoren gebundeld in elk putje. Doen niet pipet of spin tubes. De tip voor elk putje wijzigen
Opmerking: 30 DNA-monsters kunnen worden verwerkt voor elk Real-time experiment met behulp van de 96-wells-plaat: 30 x 3 monsters + 1 x 3 kalibratoren gepoolde + negatieve controle = 94. - Kort spin down de plaat duikt met 1.000 x g.
- De plaat met behulp van het volgende protocol worden uitgevoerd: Houd fase bij 95 ° C gedurende 10 min, 40 cycli bij 95 ° C voor 15 s, en 60 ° C gedurende 1 minuut.
6. data-analyse en interpretatie
- Stel in de sectie "optie", hieronder de resultaten van de plot versterking, de Ct-drempel op 0,2 voor het eerste doel-gen geanalyseerd. Herhaal de set voor elk doel of verwijzing genen. De real-time PCR om bestand te exporteren in de extensie .txt, drukt u op 'Exporteren' in de werkbalk. Vlag alleen "resultaten" selecteert u in de gegevens exporteren → Kies als bestandstype de extensie .txt → druk op 'start export' → dicht de exporteerfunctie.
- Open de software van de analyse en de .txt is gekoppeld (werkbalk → importeren) importeren.
- Selecteer de naam van het bestand te analyseren en selecteer de instelling die analyse door toolbar (play symbool).
- De kalibrator monster en de bekende aantal exemplaren van het doel (bijvoorbeeld 1 exemplaar voor AR gene) opgeven. Druk op "apply".
- Voor elk monster, weglaten een goed met verschillende delta Ct (ΔCt) in vergelijking met andere wells.
- Opnieuw analyseren het experiment (druk op play symbool).
- Evalueren van de resultaten door de exemplaaraantal bar perceel of de tabel.
Opmerking: De tabel van de resultaten bevat talrijke parameters zoals vertrouwen, de Z-score en replicatieonderzoeken geanalyseerd die nuttig voor interpretatie van de resultaten zijn kunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totale cfDNA concentratie was kwantificeerbare door spectrofotometrie voor alle monsters geanalyseerd, toont een mediaan van 6.12 ng/µL (bereik: 2,00-23.71 ng/µL) voor serummonsters en een mediaan van 3.21 ng/µL (bereik: 2.31-8,49 ng/µL) voor plasma monsters. We een totaal van 115 monsters geanalyseerd door real-time PCR-experimenten.
Test gevoeligheid evalueerden gemengde serum DNA van patiënten met hoge of lage winst voor ARen DNA van gezonde donoren, die ook als kalibrator monsters voor kopie nummer analyse worden gebruikt. Zoals wordt weergegeven in Figuur 2, is AR CN voldoende gedetecteerd in 0.375% van DNA van patiënten met AR winst gemengd met gezonde donor DNA om een gen gain detecteerbare (Figuur 2). Zo ontdekt deze aanpak een zeer lage hoeveelheid kopie nummer krijgen. De standaarddeviatie van ΔCt in CN testen voor elke patiënt werden berekend (mediane ± SD = 0.1, bereik: 0,00 - 0.36). We gebruikten een mediaan van de waarden van de standaarddeviatie voor het kiezen van kopie nummer winst cutoff.
We analyseren de exemplaaraantal van AR bij patiënten behandeld met abiraterone (n = 53), 16 (30.2%) patiënten vinden tentoongesteld AR winnen7. Op dezelfde manier geanalyseerd wij de kopie nummer variatie voor AR gen in patiënten die behandeld werden met enzalutamide (n = 59), AR winst in 21 (36%) van de patiënten8vinden.
Bovendien, we de associatie tussen AR CN en klinische resultaten met behulp van de methode Kaplan-Meier geëvalueerd en log-rank test en vond een significante associatie. In het bijzonder abiraterone case series patiënten behandeld met AR gene krijgen toonde een mediane progressie vrije overleving (PFS) van 2.8 vs. 9,5 maanden van niet-opgedaan gevallen (p < 0.0001). Een lagere totale overleving (OS) werd ook gemeld bij patiënten met AR CN te krijgen (p < 0.0001).
Ook voor enzalutamide case series, vonden we een mediaan PFS voor 2.4 vs. 4.0 maanden voor patiënten met AR winst vs. patiënten met geen winst (p = 0.0004). Bovendien, mediaan OS van patiënten met AR CN winst was 6.1 vs. 14,1 maanden voor degenen zonder winst (p = 0.0003). Alle AR CN winst behaalde resultaten van de real-time PCR-aanpak werden bevestigd met behulp van andere methoden, met inbegrip van digitale PCR (Figuur 3).
Figuur 1. Workflow en tijdlijn. De methode workflow is onderverdeeld in verschillende stappen en tijden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Aanpak gevoeligheid voor AR CN detectie getest met behulp van 2 verschillende zwembaden (voorbeeld 1 en voorbeeld 2) van DNA van gezonde donoren en van CRPC patiënten, opgedaan voor AR gen, gemixt in verschillende concentraties. Patiënt DNA werden gemixt in percentages van 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50 en 100, met betrekking tot de totale DNA. Rode lijn: cutoff voor AR CN gewin (1.5). Dit cijfer is gewijzigd van Salvi et al. 7
Figuur 3. AR CN resultaten vergelijking tussen PCR in real time (qPCR) en digitale PCR (dPCR) voor verschillende patiënten (x-as). Zwarte lijn: cutoff voor AR CN gewin (1.5). Dit cijfer is gewijzigd van Salvi et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AR GN-analyse in serum en plasma monster vormt een nieuwe, niet-invasieve benadering voor de gelaagdheid van castratie resistente prostaatkanker (CRPC) patiënten. Onlangs is gebleken dat de AR GN vermag voorspellen resultaten bij CRPC patiënten behandeld met abiraterone en enzalutamide, vóór en na chemotherapie7,8,9,10.
Het belangrijkste voordeel van onze aanpak is dat het protocol zeer eenvoudig uit te voeren is, bestaande uit slechts een DNA-isolatie-proces, een real-time PCR analyse en gemakkelijk gegevens interpretaties. Bovendien, de test zou snel uitgevoerd in 1 werkdag, en de procedure is goedkoop ($20 USD voor elk monster ongeveer). We hebben aangetoond dat deze methode zeer reproduceerbaar is en de verkregen resultaten in overeenstemming met die afkomstig zijn van duurdere en nauwkeurige methoden zijn, met inbegrip van digitale PCR7,8. Bovendien vonden we een soortgelijk AR krijgen frequentie met gerichte NGS aanpak op plasma degustaties neiging met abiraterone9,10ontdekt. Een ander belangrijk voordeel is dat deze aanpak flexibel is en kan van toepassing zijn op andere ziekten waarin het AR -gen een belangrijke rol heeft. Bovendien kon andere target en verwijzing genen worden gekozen op basis van de ziekte van belang.
GN-analyse van het AR -gen in serum heeft ook enkele beperkingen. Ten eerste, de DNA spectrofotometrische kwantificering methode is vaak onnauwkeurig en kan worden vervangen door andere, meer accurate fluorimetrische benaderingen. Een meer precieze kwantificering kan nauwkeuriger CN resultaten opleveren. Ten tweede, sommige studies hebben gesuggereerd dat het beter voor het analyseren van plasma DNA in plaats van serum DNA kon zijn. De hoeveelheid circulerend gratis DNA van de cel is over het algemeen hoger in het serum dan in plasma12,13, als gevolg van de stolling van witte bloedcellen in het serum, suggereren dat serum potentieel een slechter bron voor tumor-specifieke DNA-analyse is vanwege de mogelijke aanwezigheid van wild-type DNA.
GN-analyse van het AR -gen in serum met behulp van real-time PCR-benaderingen heeft verricht voor 112 CRPC patiënten, voordat ze met een behandeling met enzalutamide of abiraterone begonnen. Onze gegevens is gebleken dat de AR CN op cfDNA een krachtige genetische biomarker van klinische resultaten en weerstand tegen abiraterone en enzalutamide is, en kan worden gebruikt voor het identificeren van mannen die a priori van anti -AR therapieën kunnen profiteren of chemotherapie met behulp van een snelle en goedkope PCR-test. Deze bevindingen benadrukken het nut van het bloed te studeren als een minimaal-invasieve methode voor de raadpleging van de mechanismen van therapeutische resistentie in zowel vroege als geavanceerde CRPC. In de toekomst moeten potentiële en grotere studies patiënten stratificeren door circulerende AR status met het oog op de latere verschillen in klinische resultaten en behandeling reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Chiara Molinari en Filippo Martignano voor steun in data-analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
