Summary
本稿では、血清または血漿 dna のリアルタイム PCR のアプローチを使用して実行されるコピー数変動解析について説明します。去勢抵抗性前立腺癌患者への薬剤耐性予測に適していますが、それはまた他の病気のために有益かもしれない。
Abstract
血清と血漿細胞 DNA (cfDNA) は、がんの診断、予後、監視、および治療抵抗性の予測のためのバイオ マーカーの報知的な非侵襲的なソースとして示されています。頻度の高いイベントは、アンドロゲン受容体 (AR) 遺伝子コピー数 (CN) を得る仮説から始まって転移性去勢抵抗性前立腺癌 (mCRPC)、提案する潜在的な予測バイオ マーカーとしての cfDNA でこのイベントを分析します。
AR CN 2 別のリアルタイム PCR の試金および 2 遺伝子 (RNasePと前1) を使用して cfDNA の評価を行った。60 の DNA 量 ng は、アッセイの組み合わせごとに使用されました。ARCN の利得より正確な方法としてデジタル PCR を使用して確認されました。CN 変動解析はすでに mCRPC の設定で治療抵抗性の予測のために有益であること実証されているが、ことができる役に立つことも異なる患者の設定で他の目的のため。CfDNA CN 分析いくつかの利点があります: それは非侵襲的な迅速かつ簡単に実行、および血清または血漿材料の少量から開始します。
Introduction
循環血液の細胞 DNA (cfDNA) は、がんの診断、予後、監視、および治療抵抗1,2の予測のためのバイオ マーカーの最適なソースであること実証されています。多くの研究は、DNA 変異 (突然変異、コピー数変異組織におけるエピジェネティック修飾) と対応するプラズマ サンプル1、腫瘍 DNA (葉緑体) の循環があることを確認で見つけられるそれらと良い一致を示しています。原発巣と転移腫瘍組織変化3のための情報。葉緑体を勉強の可能性こうしてゲノムの語順換えおよび特定遺伝子4、潜在的転移のクローンと subclonal のセルを識別するコピー数変化 (CNVs) の再構築が可能します。葉緑体は、がん治療のモニタリングとして特定の突然変異および関連の特定の目標とされた療法5,6CNVs を抱いてそれに特に有用であること示されています。また、組織生検の必要性を克服し、非侵襲的な方法で特定のがんの治療の間に異なった時に取得される結果をことができます。
前立腺癌細胞のアンドロゲンを循環の相関について受容体 (AR) CNVs と治療、アビラテロンおよび enzalutamide への応答が示されていることを示すAR遺伝子のコピー数 (CN) cfDNA 可能性があります、有望なバイオ マーカー治療抵抗7,8,9,10,11を予測できます。別の感度、コスト、速さとさまざまなアプローチを使用して緯度における特定遺伝子の CNVs を評価できる (e.g。 リアルタイムでデジタル PCR および次世代シーケンス)。
ここで二重の試金, 血清と血漿サンプル7,8から cfDNA のAR CN を評価するため、リアルタイム PCR の技術に基づいて、シンプルで高速なアプローチについて述べる。前立腺癌 (RNaseP、通常コピー番号ステータスを持っている知られていた内部標準遺伝子としてAR (Xq12) の 5 イントロンと他の 2 つの遺伝子内にある 2 つの異なるゲノム領域に設計された PCR の試金が 2 つと考えてください。14q11; に位置します。前1、1 にある p 34)。精度と結果の感度を高めるためのものではなく、2 つの参照の遺伝子を選びました。60 の DNA 量 ng は、アッセイの組み合わせ (結合アッセイAR assay_1 + RNasePとAR assay_2 + AGO1) ごとに増幅されました。健康な男性から 3 つの血清または血漿 DNA サンプルはプールされ、校正器として使用します。カットオフと考えた > AR利得の 1.5 と < 削除の 0.5。この方法の主な利点の 1 つは、それが柔軟なことと他の遺伝子も評価できるということ、腫瘍の種類と特性に基づいて、内部標準遺伝子の変更です。
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Protocol
コピー数解析のリアルタイム PCR を実行する血清または血漿サンプルからの DNA の隔離のプロトコルの構成します。特定のターゲットのためのリアルタイム PCR、DNA 量制御 (分光光度計) DNA の抽出を行った。図 1手順とタイム ラインの概要について報告する.
プロトコルは、IRST 人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1. 血清の収集と処理
- 血清管血清を取得する抗凝固剤なしで約 5 mL 全血を収集します。処理まで血液チューブ 4 ° c を維持します。
- 4 ° C で 15 分間 1,000 × g で遠心管
- 慎重に 2 mL チューブに血清を転送します。
- 収集の管を破棄し、すぐに使用するまで-80 ° C で上清を凍結します。
2. プラズマの収集と処理
- EDTA 血漿を入手するとプラズマ チューブで約 10 mL の全血を収集します。チューブを完全に記入し、それに 8 回を反転します。処理まで血液チューブ 4 ° c を維持します。
- 1,800 x g 室温で 15 分間遠心でブレーキ設定なしでチューブを遠心します。
- 慎重に 2 mL チューブにプラズマの上部を転送します。白血球層の上清 1 mL 以上を残して転送を繰り返します。
注: 上清の上の部分を転送する細胞または細胞の残骸による汚染のリスクが軽減されます。 - 収集の管を破棄し、すぐに使用するまで-80 ° C で上清を凍結します。
3 血清または血漿から DNA の隔離
注: 血清または血漿からの DNA の分離は、次の手順で変更された商業のプロトコルを使用して実行する必要があります。
- 血清または血漿室温での (0.5 から 2 ml を含む) 1 つの因数分解しなさい。
- 渦とサンプルをミックスし、クリア 1.5 mL チューブに 0.5 mL の血清または血漿を転送します。-80 ° C の材料の残りの部分を凍結します。
- サンプルに直接プロティナーゼ k (20 mg/mL) の 50 μ L を追加します。
- サンプルに 0.5 mL の溶解バッファーを追加し、ピペッティングでよく混ぜます。
- チューブを閉じて熱ブロックで 15 分間 56 ° C でサンプルをインキュベートします。
- 製造元の指示に従って、洗浄バッファー 1 と 2 で 100% エタノールの指示された量を追加します。
- サンプルを室温に戻すとエタノール 0.5 mL を追加し、ピペッティングでよく混ぜます。
- 分離カラムと 6,000 × g で 1 分間遠心するステップ 3.7 で得られた混合物の 650 μ L を追加します。
- 管内流れを破棄し、新しいクリーンなコレクションの管に列を配置します。3.8、3.9 の手順をもう一度繰り返します。
- 列と 6,000 × g で 1 分間遠心の縁を濡らすことがなく洗浄バッファー 1, 500 μ L を追加します。
- 管内流れを破棄し、新しいクリーンなコレクション チューブを置き換えます。
- 列とフルスピード (20,000 x g) で 3 分間遠心の縁を濡らすことがなく洗浄バッファー 2 の 500 μ L を追加します。
- 管内流れを破棄し、新しいクリーンなコレクション チューブを置き換えます。
- フルスピード (20,000 x g) 残留洗浄バッファーを削除する 3 分間遠心します。
- きれいな 1.5 mL チューブに列を配置します。溶出バッファーの 150 μ L を追加し、そのバッファーが列を濡らすように 7 分を待ちます。
- 1 分の 8,000 × g で遠心分離機します。
- DNA の最大回復を確実に 1 分間、同じ列とフルスピード (20,000 x g) 遠心分離機に再度ステップ 3.16 から、想定し, 浸出液をピペットします。
4. DNA の定量化と希釈
- 分光光度計を用いた DNA の定量化を実行します。製造元の指示に従ってベンチトップ分光光度計に 2 μ L のサンプルを使用します。
注: DNA 量がリアルタイム PCR を続行するのに十分ではないかどうか (少なくとも 120 ng)、新しい DNA の分離プロセスを実行します。 - 2.5 ng/μ L (約 50 μ L) 全てのリアルタイム PCR のため十分な最終巻にする血清または血漿から DNA を希釈します。
5. リアルタイム PCR
- コピー数の試金、参照遺伝子アッセイ、希釈した DNA サンプル、および氷のプールのキャリブレータを解凍します。4 ° C で保存されているマスター ミックスを室温で平衡します。
- 各サンプルのプールのキャリブレータ 3 複製のターゲット分析、1 μ L 参照遺伝子アッセイのマスター ミックスの 10 μ L の 1 μ L のミックスを準備します。ネガティブ コントロール (水) および 2 の余分なサンプルを含むミックスを準備します。
- 96 ウェル プレートで、各ウェルにミックスの 12 μ L 分注。ないピペットやスピン チューブを行います。
- 各 DNA のサンプルおよびプールを各ウェルにキャリブレータの 8 μ L (2.5 ng/μ L の濃度) を追加します。ないピペットやスピン チューブを行います。各ウェルのヒントを変更します。
注: 30 の DNA サンプルは、96 ウェル プレート各リアルタイム実験処理できる: 30 x 3 サンプル + 1 × 3 のキャリブレータ プール + マイナス コントロール = 94。 - 1,000 x g でプレートを簡単にスピンします。
- 次のプロトコルを使用してプレートを実行: 15 95 ° C で 40 サイクル 95 ° C 10 分でステージを保持する s、および 60 ° C で 1 分。
6. データの分析と解釈
- 増幅プロット結果の下の「オプション」セクションでには、最初ターゲット遺伝子を分析の 0.2 で Ct のしきい値を設定します。各ターゲットまたは参照の遺伝子のセットを繰り返します。拡張子 .txt でリアルタイム PCR ファイルをエクスポートするには、ツールバーに「エクスポート」を押します。「結果」だけを選択でフラグ → をエクスポートするデータを選択ファイルの種類として、拡張子 .txt プレス」輸出開始」→ すぐエクスポート ツール。
- 解析ソフトウェアを開くし、ファイル .txt (ツールバー → インポート) をインポートします。
- 分析ツールバー (再生記号) によって解析設定を選択してファイル名を選択します。
- 校正サンプルと知られているターゲット (例えば、 1 AR遺伝子のコピー) のコピー数を指定します。「適用」を押す
- 各サンプルは、他の井戸と比較して異なるデルタ Ct (ΔCt) と 1 つの井戸を省略します。
- 実験 (プレス再生シンボル) を再分析します。
- バーのプロットまたはテーブルのコピー数で結果を評価します。
注: 検索結果の表には、自信、Z スコア、および分析結果の解釈に役立つことができる複製のような多数のパラメーターが含まれています。
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Representative Results
合計 cfDNA 濃度は 6.12 ng/μ L の中央値を示すすべてのサンプル分析、吸光光度法による定量 (範囲: 2.00 23.71 ng/μ L) 血清サンプルの 3.21 ng/μ L の中央値 (範囲: 2.31 8.49 ng/μ L) 血漿検体の。リアルタイム PCR 実験による検体の合計を行った。
テスト感度は、コピー数解析の校正サンプルとしても使用されている健康なドナーからAR、および DNA の高または低利得患者から DNA を混合血清を使用して査定されました。図 2で表される、健康なドナー DNA 遺伝子の利得検出 (図 2) を混ぜてAR利得を持つAR CN が十分に患者から DNA の 0.375% で検出されました。したがって、このアプローチは、コピー数増加の非常に低い量を検出しました。CN アッセイ各患者のための ΔCt の標準偏差を算出した (平均 ± SD = 0.1、範囲: 0.00 - 0.36)。コピー番号利得カットオフを選択するための標準偏差値の中央値を使用しました。
Abiraterone 患者におけるARのコピー数解析を行った (n = 53)、 AR利得7を展示した 16 例 (30.2%) を見つけます。同様に、enzalutamide で治療された患者におけるAR遺伝子のコピー数の変動を解析した (n = 59)、患者821 (36%) でAR利得を見つけます。
また、 AR CN とカプラン ・ マイヤー法を用いた臨床転帰の間の関連付けを行い、ログランク テストし有意な関連性を発見しました。特に、abiraterone は、 AR遺伝子ゲイン非得た場合の 9.5 ヶ月対 2.8、中央無増悪生存期間 (PFS) を示したケース シリーズ患者を治療 (p < 0.0001)。低い全生存期間 (OS) もAR CN 利得を持つ患者で報告された (p < 0.0001)。
Enzalutamide ケース シリーズは、同様に、利益無し患者対AR利得を持つ患者のため 4.0 ヶ月対 2.4 の PFS の中央値を見つけた我々 (p = 0.0004)。さらに、 AR CN 利得を持つ患者の OS 中央値はゲインを持たない 14.1 ヶ月対 6.1 (p = 0.0003)。リアルタイム PCR のアプローチから得られたすべてのAR CN 利得結果がデジタル PCR (図 3) を含む他の方法を使用して確認されました。
図 1。ワークフローとタイムライン。メソッドのワークフローは、さまざまなステップと時間に分かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2 。2 個別プール (サンプル 1 ・ サンプル 2) DNA の健常者からは CRPC 患者、 AR遺伝子を得たを使用してテストAR CN 検出感度がアプローチは異なる濃度で混合。患者の DNA は、0.375、0.75、1.5、3、6、12、25、50、および総 DNA の点で 100 の割合で混合しました。赤線: AR CN 利得 (1.5) のカットオフ。この図は、サルヴィらから変更されています。7
図 3.ARリアルタイム PCR (qPCR) とデジタル PCR (dPCR) (x 軸) のいくつかの患者のための CN 結果比較。黒線: AR CN 利得 (1.5) のカットオフ。この図は、サルヴィらから変更されています。7
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Discussion
ARCN における血清と血漿中のサンプルは、去勢抵抗性前立腺癌 (CRPC) 患者の層別化のための新しい非侵襲的アプローチを表します。それは最近AR CN は CRPC 患者アビラテロンおよび enzalutamide、化学療法7,8,9,10前後の結果を予測することが実証されています。
我々 のアプローチの主な利点は、DNA 分離プロセス 1 つのリアルタイム PCR 解析、簡単にデータの解釈から成るプロトコルが実行する非常に単純なことです。また、テストはすぐに実行に 1 営業日、かもしれない、プロシージャは高価な ($20 ドル、各サンプルの約)。我々 は、このメソッドは再現性の高いデジタル PCR7、8を含むより高価な正確な方法から来るものに沿っている得られた結果を実証しました。また、似たようなAR abiraterone9,10で扱われる血漿検体にターゲットを絞った NGS アプローチで検出された周波数を得るためとわかった。もう一つの重要な利点は、このアプローチは柔軟なAR遺伝子が重要な役割を持つ他の病気にも適用できます。さらに、その他のターゲットおよび参照の遺伝子は興味の病気に基づいて選ばれる可能性があります。
CN 血清におけるAR遺伝子の解析もいくつかの制限があります。まず、DNA の吸光光度定量法はしばしば正確ではありません、他より正確な蛍光アプローチで置き換えることができます。正確な定量は、CN のより正確な結果を与えることができます。第二に、いくつかの研究は血清 DNA ではなくプラズマ DNA の分析をことができることを示唆しています。量の循環の細胞 DNA は一般的に高いプラズマ12,13血清、血清が腫瘍特異 DNA 分析のための悪いソースである可能性があることを示唆に白血球細胞の凝固のためにより血清中ために野生型 DNA の存在の可能性。
Enzalutamide または abiraterone で治療を開始する前に 112 CRPC 患者のリアルタイム PCR のアプローチを用いる血清中AR遺伝子の CN 分析を行われています。我々 のデータ, AR CN cfDNA の臨床結果と抵抗アビラテロンおよび enzalutamide、強力な遺伝的マーカーし、事前対策 -AR治療から恩恵を受ける可能性があります人を識別するために使用できますか迅速かつ低コストの PCR 法を用いた化学療法です。これらの調査結果は、早期および進行の CRPC に治療抵抗性の機構を照会するための低侵襲法として血を勉強の効用を強調表示します。将来は、将来、大きな研究は臨床転帰と治療反応の後続の違いの観点からAR状態を循環させることにより患者を分類する必要があります。
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Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
データ解析のサポート、キアラ モリナーリとフィリッポ アングイッラーラに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
