Summary
Dette manuskriptet beskriver kopi nummer variant analyse utført i serum- eller DNA ved hjelp av sanntids PCR tilnærming. Denne metoden er egnet for prediksjon av resistens i kastrering motstandsdyktig prostata cancer pasienter, men det kan være informativ også for andre sykdommer.
Abstract
Serum og plasma celle gratis DNA (cfDNA) har vist som en informativ, ikke-invasiv biomarkers for kreftdiagnose, prognosen, overvåking og prediksjon av behandling motstand. Starter fra hypotesen at androgen reseptoren (AR) genet antall kopier (CN) få en hyppig hendelse i metastatisk kastrering motstand prostatakreft (mCRPC), foreslår vi å analysere denne begivenheten i cfDNA som en potensiell prediktiv biomarkør.
Vi vurdert AR CN i cfDNA bruker 2 forskjellige sanntid PCR analyser og 2 referanse gener (RNaseP og siden1). DNA mengden 60 ng ble brukt for hver kombinasjon av analysen. AR CN gevinst ble bekreftet ved hjelp av Digital PCR som mer nøyaktig. CN variant analyse allerede er vist for å være informativ for prediksjon av behandling motstand i innstillingen for mCRPC, men det kan være nyttig også til andre formål i ulike innstillinger for pasienten. CN analyse på cfDNA har flere fordeler: det er ikke-invasiv, rask og enkel å utføre, og den starter fra en liten mengde serum- eller materiale.
Introduction
Sirkulerende cellen gratis DNA (cfDNA) i blodet har vist seg for å være en optimal biomarkers for kreftdiagnose, prognosen, overvåking og prediksjon av behandling motstand1,2. Mange studier har vist en god samsvar mellom DNA endringer (mutasjoner, kopi nummer variasjoner, epigenetic endringer i vev), og i tilsvarende plasma prøver1, bekrefter at sirkulerende svulst DNA (ctDNA) er informativ for primære og metastatisk tumor vev endringer3. Muligheten for å studere ctDNA dermed lar for gjenoppbyggingen av genomisk rearrangements og kopi nummer varianter (CNVs) på bestemte oncogenes4, identifisere potensielt metastatisk klonal og subclonal celler. CtDNA har vist seg å være klinisk nyttig spesielt for kreft behandling overvåking som havner det spesifikke mutasjoner og CNVs, knyttet til bestemte målrettet terapi5,6. Det også overvinner behov for vev biopsier og lar resultater skal oppnås på ulike tidspunkter i løpet av en bestemt kreftbehandling i en ikke-invasiv måte.
Når det gjelder prostatakreft, en signifikant sammenheng mellom sirkulerende celle-fri androgen reseptoren (AR) CNVs og behandling respons på abiraterone og enzalutamide har vist, som angir AR genet antall kopier (CN) i cfDNA kan være en lovende biomarkør kan forutsi behandling motstand7,8,9,10,11. CNVs av bestemte gener i ctDNA kan evalueres med ulike tilnærminger med forskjellig følsomhet, kostnad og hurtighet (f.eks. sanntid, digitale PCR, og neste generasjons sekvensering).
Her beskriver vi en enkel og rask tilnærming, basert på dobbeltsidig analyser i sanntid PCR-teknologi, for å vurdere AR CN i cfDNA serum og plasma prøver7,8. Vi betraktet to forskjellige PCR analyser utformet på to genomisk regioner intron 5 av AR (Xq12) og to andre gener, som interne standardreferanse gener kjent for å ha statusen normale kopi i prostatakreft (RNaseP, ligger på 14q11; Siden1, ligger på 1 p 34). Vi valgte to referanse gener, snarere enn en, å øke presisjon og følsomhet av resultatene. En DNA mengde 60 ng ble forsterket for hver analysen kombinasjon (kombinert analysen for AR-assay_1 + RNaseP og AR-assay_2 + AGO1). Tre serum- eller DNA-prøver fra friske menn var samlet og brukt som en kalibrator. Vi vurderte konsentrasjon av > 1.5 for AR gevinst og < 0,5 for sletting. En av de viktigste fordelene med denne metoden er at den er fleksibel og at andre gener kan også vurderes, endre standard intern referanse genene, på grunnlag av svulst type og egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen består av isolering av DNA fra serum- eller prøver å utføre sanntid PCR for Kopier nummer analyse. DNA utvinning, DNA antallet kontroll (spektrofotometer) og sanntid PCR for bestemte mål ble utført. I figur 1rapporteres en oppsummering av prosedyrer og tidslinje.
Protokollen følger retningslinjene i første menneskelige forskning etikk.
1. serum samling og bearbeiding
- Samle ca 5 mL fullblod i et serum rør uten antikoagulerende hente serum. Opprettholde blod rør på 4 ° C før behandling.
- Sentrifuger rør på 1000 x g i 15 min på 4 ° C.
- Nøye overføre serum til 2 mL rør.
- Forkaste samle røret og umiddelbart fryse nedbryting ved-80 ° C før bruk.
2. plasma samling og bearbeiding
- Samle ca 10 mL fullblod i et plasma rør med EDTA hente plasma. Fyll røret helt og deretter Inverterer det 8 ganger. Opprettholde blod rør på 4 ° C før behandling.
- Sentrifuge røret 1800 x g i 15 min ved romtemperatur uten brems innstilling på sentrifugen.
- Nøye overføre den øvre delen av plasma inn 2 mL rørene. Gjenta filoverføringen, forlater minst 1 mL av nedbryting over hvite blodlegemer laget.
Merk: Overføre den øvre delen av nedbryting reduserer risikoen for forurensing av celler eller celle rusk. - Forkaste samle røret og umiddelbart fryse nedbryting ved-80 ° C før bruk.
3. DNA isolasjon fra Serum- eller
Merk: Isolering av DNA fra serum- eller skal utføres ved hjelp av kommersielle protokollen endret i fremgangsmåten.
- Tine en aliquot (inneholder fra 0,5 til 2 mL) av serum- eller ved romtemperatur.
- Vortex og bland prøven og overføre 0,5 mL av serum- eller i en klar 1,5 mL tube. Fryse resten av materiale på-80 ° C.
- Legge til 50 µL proteinasen k (20 mg/mL) direkte til prøven.
- Legg til 0,5 mL lyseringsbuffer til prøven og bland godt pipettering.
- Lukk rør og ruge eksempler på 56 ° C i 15 min i varme blokken.
- Legge til det angitte beløpet av 100% etanol på vaskebuffer 1 og 2, som indikert av produsentens instruksjoner.
- Bringe prøvene tilbake til romtemperatur og legge til 0,5 mL av absolutt etanol og bland godt pipettering.
- Legge til 650 µL av blandingen fikk i trinn 3.7 separasjon kolonne og sentrifuge 6000 x g for 1 min.
- Forkaste røret som inneholder flyten gjennom og plasser kolonnen på en ny ren samling rør. Gjenta trinn 3.8 og 3.9 en gang.
- Legge til 500 µL av vaskebuffer 1, uten wetting kanten av kolonnen, og sentrifuge 6000 x g for 1 min.
- Forkast røret som inneholder flyten gjennom og erstatte den med en ny ren samling rør.
- Legge til 500 µL av vaskebuffer 2, uten wetting kanten av kolonnen, og sentrifuge i full fart (20 000 x g) for 3 min.
- Forkast røret som inneholder flyten gjennom og erstatte den med en ny ren samling rør.
- Virvel i full fart (20 000 x g) for 3 min å fjerne eventuelle gjenværende vaske bufferen.
- Plass kolonnen i en ren 1,5 mL tube. Legge til 150 µL av elueringsbufferen og vente 7 min for å sikre at bufferen wets kolonnen.
- Sentrifuge 8000 x g for 1 min.
- Pipetter elute fra trinn 3.16 i samme kolonne og sentrifuger i full fart (20 000 x g) for 1 min å sikre maks gjenoppretting av DNA.
4. DNA kvantifisering og fortynning
- Utføre kvantifisering av DNA som bruker et spektrofotometer. Bruk 2 µL av prøve på en benk toppen spektrofotometer henhold til produsentens anvisninger.
Merk: Hvis DNA antallet ikke er tilstrekkelig til å fortsette med sanntid PCR (minst 120 ng), utføre en ny DNA isolasjon prosess. - Fortynne DNA fra serum- eller til 2,5 ng/µL i et siste volum tilstrekkelig for alle sanntid PCR (ca 50 µL).
5. sanntid PCR
- Tine kopi nummer analyser, referanse genet analysen, DNA utvannet eksempler og kalibratorer samles i isen. Equilibrate ved romtemperatur master mix som er lagret på 4 ° C.
- Forbered en blanding av 1 µL av målet analysen, 1 µL av referanse genet analysen og 10 µL av master mix for 3 gjentak av hver prøve og kalibratorer samlet. Klargjør blandingen inkludert en negativ kontroll (vann) og 2 ekstra prøver.
- I en 96 godt plate, aliquot 12 µL av blandingen i hver brønn. Gjør ikke pipette eller spinn rør.
- Legge til 8 µL (konsentrasjon av 2,5 ng/µL) på DNA-prøve og kalibratorer samles i hver brønn. Gjør ikke pipette eller spinn rør. Endre spissen for hver brønn.
Merk: 30 DNA-prøver kan bli behandlet for hver sanntid eksperimentere med 96-brønns platen: 30 x 3 prøver + 1 x 3 kalibratorer gruppert + negative kontroll = 94. - Kort spinne ned platen på 1000 x g.
- Kjøre platen ved hjelp av følgende protokollen: holde scenen på 95 ° C i 10 min, 40 sykluser på 95 ° C for 15 s og 60 ° C i 1 minutt.
6. data analyse og fortolkning
- I delen "alternativ", under forsterkning tomten resultatene, kan du angi Ct terskelen på 0,2 for første målet genet analysert. Gjenta sekvensen for hvert mål eller referanse gener. Hvis du vil eksportere filen for sanntids PCR i txt-fil, trykk "Export" i verktøylinjen. Flagge bare "resultater" Velg data som skal eksporteres → Velg som filtype den filtype txt → trykk "start eksport" → nær eksportverktøy.
- Åpne analyseprogramvare og importere filen txt (verktøylinjen → import).
- Velg filnavnet for å analysere og velge innstillingen for analyse av verktøylinje (spille symbol).
- Angi kalibrator prøven og kjente antall eksemplarer av målet (f.eks 1 kopi for AR genet). Trykk "gjelder."
- For hver prøve, utelater du en brønn med forskjellige delta Ct (ΔCt) med andre brønner.
- Analyser på nytt eksperimentet (trykk spille symbol).
- Vurdere resultatene av antall kopier bar tomten eller tabellen.
Merk: Resultatene tabellen inneholder mange parametere som tillit og Z-skåre gjentak analysert som kan være nyttig for resultater tolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt cfDNA konsentrasjon var kvantifiserbare av spectrophotometry for alle prøver analysert, viser en median på 6.12 ng/µL (område: 2.00-23.71 ng/µL) for serumprøver og en median på 3,21 ng/µL (område: 2,31-8.49 ng/µL) for plasmaprøver. Vi analyserte totalt 115 prøver av sanntids PCR eksperimenter.
Test følsomhet ble vurdert blandet serum DNA fra pasienter med høy eller lav gevinst for ARog DNA fra sunn givere er også brukt som kalibrator prøver for Kopier nummer analyse. Som vist i figur 2, er AR CN tilstrekkelig oppdaget i 0.375% av DNA fra pasienter med AR gevinst blandet med frisk donor DNA å skaffe et gen gevinst synlig (figur 2). Derfor oppdaget denne tilnærmingen veldig lite kopi nummer gevinst. Standardavviket for ΔCt i CN analyser for hver pasient ble beregnet (gjennomsnittlig ± SD = 0.1, utvalg: 0,00 - 0,36). Vi brukte en median på standardavvik verdiene for å velge Kopier nummer gevinst cutoff.
Vi analyserte kopien antall AR hos pasienter som behandles med abiraterone (n = 53), finne 16 (30.2%) pasienter utstilt AR gevinst7. Tilsvarende vi analyserte kopi nummer variasjonen for AR genet hos pasienter som behandles med enzalutamide (n = 59), finne AR gevinst i 21 (36%) pasienter8.
Videre vi vurdert tilknytningen mellom AR CN og kliniske utfall med metoden Kaplan-Meier og logg-rank test og fant en signifikant sammenheng. Spesielt abiraterone behandlet tilfelle serien pasienter med AR genet gevinst viste en median progresjon overlevelse (PFS) av 2.8 vs 9,5 måneder ikke fått tilfeller (p < 0,0001). En lavere total overlevelse (OS) ble også rapportert hos pasienter med AR CN gevinst (p < 0,0001).
Tilsvarende for enzalutamide tilfelle serien, fant vi en median PFS på 2,4 vs 4.0 måneder for pasienter med AR gevinst vs pasienter med ingen gevinst (p = 0,0004). Videre median OS av pasienter med AR CN gevinst var 6.1 vs 14,1 måneder for dem uten gevinst (p = 0.0003). Alle AR CN gevinst resultatene fra sanntid PCR tilnærming ble bekreftet ved hjelp av andre metoder, inkludert digitale PCR (Figur 3).
Figur 1. Arbeidsflyt og tidslinje. Metoden arbeidsflyten er delt inn i forskjellige trinnene og ganger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Tilnærming følsomhet for AR CN gjenkjenning testet med 2 forskjellige bassenger (prøve 1 og prøve 2) av DNA fra friske blodgivere og CRPC pasienter, fått for AR genet, blandet i ulike konsentrasjoner. Pasienten DNA ble blandet på prosenter av 0.375, 0,75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50 og 100, i forhold til totalt DNA. Rød linje: fristen for AR CN gevinst (1.5). Dette tallet har blitt endret fra Salvi et al. 7
Figur 3. AR CN resultater sammenligning mellom sanntid PCR (qPCR) og digital PCR (dPCR) for flere pasienter (x-aksen). Svart linje: fristen for AR CN gevinst (1.5). Dette tallet har blitt endret fra Salvi et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AR CN analyse i serum og plasma representerer en ny, ikke-invasiv tilnærming for lagdeling av kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) pasienter. Det har vært nylig vist at AR CN er kjøpedyktig forutsi resultatene i CRPC pasienter behandlet med abiraterone og enzalutamide, før og etter kjemoterapi7,8,9,10.
Den største fordelen med vår tilnærming er at protokollen er svært enkel å utføre, bestående av bare en DNA isolasjon prosess, en sanntids PCR analyse og enkle data tolkninger. Videre testen kunne raskt utført i 1 virkedag, og prosedyren er billig ($20 dollar for hver prøve, ca). Vi har vist at denne metoden er svært reproduserbare og resultatene er i tråd med de som kommer fra dyrere og nøyaktige metoder, inkludert digital PCR7,8. Videre fant vi en lignende AR få frekvens oppdaget med målrettede NGS tilnærminger på plasmaprøver behandlet med abiraterone9,10. En annen viktig fordel er at denne tilnærmingen er fleksibel og kan brukes av andre sykdommer som AR genet har en viktig rolle. Videre kan andre mål og referanse gener bli valgt basert på sykdommen av interesse.
CN analyse av AR genet i serum har også noen begrensninger. For det første metoden DNA Spektrofotometri kvantifisering er ofte upresis og kunne erstattes med andre, mer nøyaktig fluorometric tilnærminger. En mer presis kvantifisering kunne gi mer presise CN resultater. For det andre, noen studier har antydet at det kan være bedre å analysere plasma DNA i stedet for serum DNA. Antall sirkulerende cellen gratis DNA er generelt høyere i serum enn i plasma12,13, på grunn av clotting av hvite blodlegemer i serum, antyder at serum er potensielt en verre kilde for svulst-spesifikke DNA-analyse på grunn av mulige tilstedeværelse av vill-type DNA.
CN analyse av AR genet i serum bruke sanntid PCR tilnærminger er utført på 112 CRPC pasienter før de begynte behandling med enten enzalutamide eller abiraterone. Våre data viste at AR CN på cfDNA er en kraftig genetisk biomarkør kliniske utfallet og motstand mot abiraterone og enzalutamide, og kan brukes til å identifisere menn som kan ha nytte en priori fra anti -AR terapi eller kjemoterapi med en rask og rimelig PCR-analysen. Disse funnene markere nytten av studere blod som en minimal invasiv metode for avhør mekanismer for terapeutisk motstand i både tidlig og avanserte CRPC. I fremtiden, bør potensielle og større studier stratify pasienter av sirkulerende AR status i lys av de påfølgende forskjellene i kliniske utfall og behandlingsrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Chiara Molinari og Filippo Martignano for støtte i dataanalyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
