Summary
Este manuscrito descreve a análise de variação número da cópia realizada em DNA de soro ou plasma utilizando a abordagem PCR em tempo real. Este método é adequado para a previsão da resistência a drogas em pacientes com câncer de próstata resistente a castração, mas poderia ser informativo também para outras doenças.
Abstract
Soro e plasma cell DNA gratuito (cfDNA) tem sido demonstrado como fonte informativa, não-invasivo de biomarcadores para diagnóstico de câncer, prognóstico, acompanhamento e previsão da resistência do tratamento. A partir da hipótese de que a ganhar o número de cópia de gene do andrógeno receptores (AR) (CN) é um evento frequente no cancro da próstata de castração metastático resistência (Abiraterona), propomo-na analisar este evento em cfDNA como um potencial biomarcador preditivo.
Nós avaliamos AR CN em cfDNA usando 2 diferentes ensaios PCR em tempo real e 2 genes de referência (RNaseP e AGO1). Quantidade de DNA de 60 ng foi usado para cada combinação de ensaio. AR Ganho de CN foi confirmado usando PCR Digital como um método mais preciso. Análise de variação de CN já foi demonstrado ser informativo para a previsão da resistência do tratamento no cenário do Abiraterona, mas pode ser útil também para outros fins em diferentes configurações de paciente. Análise CN na cfDNA tem várias vantagens: é não-invasiva, rápida e fácil de executar, e começa de um pequeno volume de material de soro ou plasma.
Introduction
Circular célula DNA gratuito (cfDNA) no sangue tem demonstrado para ser uma óptima fonte de biomarcadores para diagnóstico de câncer, prognóstico, acompanhamento e previsão de tratamento resistência1,2. Muitos estudos têm mostrado uma boa concordância entre alterações de DNA (mutações, variações de número de cópia, modificações epigenéticas em tecidos) e aqueles encontrados no correspondente plasma amostras1, confirmando que circulam o DNA do tumor (ctDNA) é informativo para o tumor primário e metastático tecido alterações3. A possibilidade de estudar ctDNA permite, assim, para a reconstrução de rearranjos do genoma e variações de número de cópia (CNVs) em oncogenes específicos4, identificando potencialmente metastáticas células clonais e subclonal. CtDNA tem demonstrado ser clinicamente útil especialmente para câncer tratamento monitoramento à medida que abriga mutações específicas e CNVs, relacionadas com terapias alvo específico5,6. Também supera a necessidade de biópsias do tecido e permite resultados a serem obtidos em diferentes momentos durante um tratamento de câncer específicos, de forma não-invasiva.
No que se refere a câncer de próstata, uma correlação significativa entre a circulação livre de células andrógeno CNVs do receptor (AR) e tratamento demonstrou-se a resposta a abiraterone e enzalutamide, indicando AR gene cópia número (CN) em cfDNA pode ser uma biomarcador promissor capaz de prever tratamento resistência7,8,9,10,11. CNVs de genes específicos no ctDNA podem ser avaliados usando diferentes abordagens com diferente sensibilidade, custo e rapidez (EG. PCR em tempo real, Digital e a próxima geração de sequenciamento).
Aqui nós descrevemos uma abordagem simples e rápida, com base em ensaios de frente e verso em tecnologia PCR em tempo real, para avaliar o AR CN em cfDNA de soro e plasma amostras7,8. Consideramos dois diferentes ensaios PCR concebidos em duas diferentes regiões genômicas dentro intron 5 do AR (Xq12) e dois outros genes, como genes de referência padrão interno, conhecidos por ter um status de número de cópia normal em câncer de próstata (RNaseP, localizado no 14q11; AGO1, localizado no 1 p. 34). Nós selecionamos os genes de duas referência, ao invés, para aumentar a precisão e a sensibilidade dos resultados. Uma quantidade de DNA de 60 ng foi amplificado para cada combinação de ensaio (ensaio combinado para AR-assay_1 + RNaseP e de AR-assay_2 + AGO1). Três amostras de DNA de soro ou plasma de homens saudáveis foram agrupadas e usadas como um calibrador. Consideramos a cortes de > 1.5 para ganho de AR e < 0.5 para exclusão. Uma das principais vantagens deste método é que é flexível e que outros genes podem também ser avaliados, alterando os genes de padrão interno de referência, com base no tipo de tumor e características.
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Protocol
O protocolo consiste o isolamento do DNA de amostras de soro ou plasma para realizar o PCR em tempo real para análise de número de cópia. Extração de DNA, controle de quantidade de DNA (espectrofotômetro) e PCR em tempo real para alvos específicos foram realizados. Na Figura 1, um resumo dos procedimentos e linha do tempo são relatados.
O protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa humana IRST.
1. processamento e coleta de soro
- Colete aproximadamente 5 mL sangue total em um tubo de soro sem anticoagulante para obter o soro. Manter os tubos de sangue a 4 ° C até o processamento.
- Tubos de centrífuga a 1.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.
- Transferi com cuidado o soro para tubos de 2 mL.
- Descartar o tubo de coletando e congelar imediatamente o sobrenadante a-80 ° C até o uso.
2. processamento e coleta de plasma
- Colete aproximadamente 10 mL sangue total em um tubo de plasma com EDTA para obter plasma. Encha o tubo completamente e em seguida invertê-lo 8 vezes. Manter os tubos de sangue a 4 ° C até o processamento.
- Centrifugar o tubo a 1.800 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente com nenhuma configuração de freio na centrífuga.
- Transferi com cuidado a parte superior do plasma para tubos de 2 mL. Repeti a transferência, deixando pelo menos 1 mL do sobrenadante acima da camada de células brancas.
Nota: Transferir a parte superior do líquido sobrenadante reduz o risco de contaminação por células ou fragmentos de célula. - Descartar o tubo de coletando e congelar imediatamente o sobrenadante a-80 ° C até o uso.
3. DNA isolado do soro ou Plasma
Nota: Isolamento do DNA de soro ou plasma deve ser realizado utilizando o protocolo comercial modificado nas etapas a seguir.
- Descongele uma alíquota (que contém de 0,5 a 2 mL) de soro ou plasma à temperatura ambiente.
- Vórtice e misturar a amostra e transferir 0,5 mL de soro ou plasma em um tubo de clara 1,5 mL. Congele o restante do material a-80 ° C.
- Adicione 50 µ l de proteinase k (20 mg/mL) diretamente para a amostra.
- Adicionar 0,5 mL de tampão de Lise para a amostra e misture bem por pipetagem.
- Fechar os tubos e incube as amostras a 56 ° C por 15 min no bloco de calor.
- Adicione a quantidade indicada de etanol 100% em tampão de lavagem 1 e 2, conforme indicado pelas instruções do fabricante.
- Trazer as amostras volta à temperatura ambiente e adicionar 0,5 mL de etanol absoluto e misture bem por pipetagem.
- Adicione 650 µ l da mistura obtida na etapa 3.7 para a coluna de separação e centrifugador a 6.000 x g por 1 min.
- Descartar o tubo contendo o fluxo através de e colocar a coluna em um tubo limpo coleção nova. Repita as etapas de 3.8 e 3.9 mais uma vez.
- Adicione 500 µ l de tampão de lavagem 1, sem molhar a borda da coluna e centrifugar 6.000 x g por 1 min.
- Descartar o tubo contendo o fluxo através de e substituí-lo com um novo tubo de coleta limpa.
- Adicione 500 µ l de tampão de lavagem 2, sem molhar a borda da coluna e centrifugar a velocidade máxima (20.000 x g) por 3 min.
- Descartar o tubo contendo o fluxo através de e substituí-lo com um novo tubo de coleta limpa.
- Centrifugar a velocidade máxima (20.000 x g) por 3 min remover qualquer tampão de lavagem residual.
- Coloca a coluna em um tubo limpo 1,5 mL. Adicionar 150 µ l de tampão de eluição e esperar 7 min para garantir que reserva molha a coluna.
- Centrifugar a 8.000 x g por 1 min.
- Pipete o elute da etapa 3.16 novamente na mesma coluna e centrífuga em alta velocidade (20.000 x g) para 1 min garantir máxima recuperação de ADN.
4. diluição e quantificação de DNA
- Realize a quantificação de DNA utilizando um espectrofotômetro. Use 2 µ l de amostra em um Espectrofotômetro de bancada pelas instruções do fabricante.
Nota: Se a quantidade de DNA não é suficiente para prosseguir com a PCR em tempo real (pelo menos 120 ng), realizar um novo processo de isolamento do DNA. - Dilua o DNA de soro ou plasma até 2,5 ng / µ l em um volume final suficiente para PCR tudo em tempo real (cerca de 50 µ l).
5. real-time PCR
- Degelo cópia números ensaios, ensaio de gene de referência, amostras de DNA diluído e calibradores concentrar-se em gelo. Equilibrar na temperatura de quarto a mistura de mestre que é armazenada em 4 ° C.
- Prepare uma mistura de 1 µ l de ensaio de alvo, 1 µ l de ensaio de referência gene e 10 µ l de mistura de mestre para 3 repetições de cada amostra e calibradores em pool. Prepare a mistura, incluindo um controlo negativo (água) e 2 amostras extras.
- Em um prato bem 96, alíquota µ l 12 da mistura em cada poço. Fazer tubos não pipeta ou spin.
- Adicione 8 µ l (concentração de 2,5 ng / µ l) de cada amostra de DNA e calibradores em pool para cada poço. Fazer tubos não pipeta ou spin. Mude a ponta para cada poço.
Nota: 30 amostras de DNA podem ser processadas para cada experimento em tempo real usando a placa de 96 poços: amostras de 30 x 3 + 1 x 3 calibradores em pool + negativo controle = 94. - Brevemente spin para baixo a placa a 1.000 x g.
- Verifique a placa usando o seguinte protocolo: Segure o palco a 95 ° C por 10 min, 40 ciclos a 95 ° C por 15 s e 60 ° C por 1 min.
6. interpretação e análise de dados
- Na seção "opção", abaixo os resultados de trama de amplificação, defina o limite de Ct em 0,2 para o primeiro gene alvo analisado. Repeti o conjunto para cada genes alvo ou referência. Para exportar o arquivo PCR em tempo real na extensão. txt, pressione "Exportar" na barra de ferramentas. Bandeira apenas "resultados" em selecionar dados para exportar → escolhem como tipo de arquivo "a extensão. txt → prima Iniciar exportação" → fechar a ferramenta de exportação.
- Abra o software de análise e importar o arquivo. txt (importação → barra de ferramentas).
- Selecione o nome do arquivo para analisar e selecionar a configuração de análise pela barra de ferramentas (símbolo do jogo).
- Especifica a amostra de Calibrador e o número conhecido de cópias do alvo (por exemplo, 1 cópia do gene AR ). Pressione "aplicar".
- Para cada amostra, omita um poço com diferente delta Ct (ΔCt) em comparação com outros poços.
- Reanalisar o experimento (peça símbolo).
- Avalie os resultados pelo número cópia bar plot ou a tabela.
Nota: A tabela de resultados contém numerosos parâmetros como confiança, Pontuação Z e repetições analisadas que poderiam ser útil para a interpretação de resultados.
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Representative Results
CfDNA total concentração era quantificável por espectrofotometria para todas as amostras analisadas, apresentando uma mediana de 6,12 ng / µ l (intervalo: 2,00-23.71 ng / µ l) para amostras de soro e uma mediana de 3,21 ng / µ l (intervalo: 2.31-8.49 ng / µ l) para as amostras de plasma. Foram analisados um total de 115 amostras por experimentos PCR em tempo real.
Teste de sensibilidade foi avaliada utilizando DNA misto de soro de pacientes com alto ou baixo ganho para o ARe o DNA de doadores saudáveis, que também são usados como amostras de Calibrador para análise de número de cópia. Conforme representado na Figura 2, AR CN é suficientemente detectado em 0.375% do DNA de pacientes com ganho de AR misturado com o doador saudável DNA para obter um ganho de gene detectável (Figura 2). Assim, esta abordagem detectou uma quantidade muito baixa de ganho número de cópia. O desvio padrão de ΔCt em ensaios CN para cada paciente foram calculados (média ± DP = 0.1, escala: 0.00 - 0,36). Usamos uma mediana dos valores de desvio padrão para escolher o número limite de ganho de cópia.
Analisou-se o número de cópia de AR em pacientes tratados com abiraterone (n = 53), encontrando a 16 pacientes (30,2%) exibiu AR ganho7. Da mesma forma, analisamos a variação de número de cópia de gene de AR em pacientes tratados com enzalutamide (n = 59), encontrando AR ganho em 21 (36%) dos pacientes8.
Além disso, avaliaram a associação entre AR CN e os resultados clínicos usando o método de Kaplan-Meier e log-rank test e encontrou uma associação significativa. Em particular, abiraterone série de casos de pacientes tratados com ganho de gene AR mostrou uma sobrevida livre de progressão mediana (PFS) de 2.8 vs 9,5 meses de casos não-adquirida (p < 0,0001). Uma menor sobrevida global (OS) também foi relatada em pacientes com ganho de AR CN (p < 0,0001).
Da mesma forma, para uma série de casos de enzalutamide, encontramos uma mediana PFS de 2.4 vs 4,0 meses para pacientes com ganho de AR vs pacientes com nenhum ganho (p = 0,0004). Além disso, a mediana OS de pacientes com ganho de AR CN era 6.1 vs 14,1 meses para aqueles sem ganho (p = 0.0003). Todos os resultados de ganho de AR CN obtidos a partir da abordagem PCR em tempo real foram confirmados usando outros métodos, incluindo PCR digital (Figura 3).
Figura 1. Fluxo de trabalho e cronograma. O fluxo de trabalho do método é dividido em tempos e etapas diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Sensibilidade de abordagem para a deteção de AR CN testada utilizando 2 distintas piscinas (exemplo 1 e exemplo 2) do DNA de doadores saudáveis e de pacientes CRPC, adquiridos por gene AR , misturado em diferentes concentrações. Paciente DNA foram misturadas em percentagens de 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50 e 100, em respeito ao DNA total. Linha vermelha: corte para ganho de AR CN (1.5). Esta figura foi modificada de Salvi et al 7
Figura 3. AR Comparação de resultados CN entre PCR em tempo real (qPCR) e PCR digital (dPCR) para vários pacientes (eixo x). Linha de preto: corte para ganho de AR CN (1.5). Esta figura foi modificada de Salvi et al 7
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Discussion
AR Análise CN em amostra de soro e plasma representa uma abordagem nova, não-invasivo para a estratificação de pacientes com câncer de próstata resistente a castração (CRPC). Foi recentemente demonstrado que a CN AR é capaz de prever os resultados no CRPC pacientes tratados com abiraterone e enzalutamide, antes e depois da quimioterapia7,8,9,10.
A principal vantagem de nossa abordagem é que o protocolo é muito simples de executar, consistindo de apenas um processo de isolamento do DNA, uma análise PCR em tempo real e interpretações de dados fácil. Além disso, o teste pode ser rapidamente realizada em 1 dia de trabalho, e o procedimento é barato ($20 USD para cada amostra, aproximadamente). Nós demonstramos que esse método é altamente reprodutível e os resultados obtidos estão de acordo com aqueles que vêm mais caros e mais precisos métodos, incluindo digital PCR7,8. Além disso, encontramos um semelhante AR ganhar frequência detectada com alvo NGS abordagens em amostras de plasma tratadas com abiraterone9,10. Outra vantagem importante é que esta abordagem é flexível e pode ser aplicável a outras doenças em que o gene de AR tem um papel importante. Além disso, outros genes alvo e referência poderiam ser escolhidos com base na doença de interesse.
Análise CN do gene AR no soro tem também algumas limitações. Em primeiro lugar, o método de quantificação espectrofotométrica do DNA é muitas vezes impreciso e poderia ser substituído por outras, mais precisas fluorométrica abordagens. Uma quantificação mais precisa poderia dar resultados mais precisos do CN. Em segundo lugar, alguns estudos têm sugerido que poderia ser melhor analisar o DNA de plasma em vez de soro DNA. A quantidade de DNA grátis de célula de circulação é geralmente mais elevada no soro do que em plasma12,13, devido a coagulação das células brancas do sangue no soro, sugerindo que o soro é potencialmente uma fonte pior para análise de DNA do tumor-específicos por causa da possível presença de DNA do tipo selvagem.
NC análise do gene AR no soro utilizando abordagens PCR em tempo real tem sido executada em 112 pacientes CRPC antes de começarem o tratamento com enzalutamide ou abiraterone. Nossos dados mostraram que NC AR na cfDNA é um poderoso biomarcador genético de resultados clínicos e resistência a abiraterone e enzalutamide e pode ser usado para identificar os homens que podem se beneficiar um priori de anti -AR terapias ou quimioterapia usando um ensaio PCR rápido e baixo custo. Esses achados destacam a utilidade de se estudar o sangue como um método minimamente invasivo para interrogar os mecanismos de resistência terapêutica no CRPC precoce e avançado. No futuro, estudos prospectivos e de maiores devem estratificar pacientes por status e tendo em conta as diferenças subsequentes em desfechos clínicos e resposta de tratamento de AR de circulação.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos a Chiara Molinari e Filippo Martignano para apoio na análise de dados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
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