Summary
Detta manuskript beskriver kopia nummer variation analysen utförs i serum eller plasma DNA med hjälp av realtids PCR-metod. Denna metod är lämplig för förutsägelse av läkemedelsresistens patienter med kastrationsresistent prostatacancer, men det kan vara informativ också för andra sjukdomar.
Abstract
Serum och plasma cell gratis DNA (cfDNA) har visat som en informativ, icke-invasiv källa av biomarkörer för diagnos, prognos, övervakning och Prediktion av behandlingsresistens. Start från hypotesen att androgen receptor (AR) gen kopia nummer (CN) få är en återkommande händelse i metastaserande kastrering motstånd prostatacancer (mCRPC), föreslår vi att analysera denna händelse i cfDNA som en potentiell Prediktiva biomarkörer.
Vi utvärderade AR CN i cfDNA med 2 olika realtids PCR-analyser och 2 referens gener (RNaseP och sedan1). DNA mängden 60 ng användes för varje kombination av assay. AR CN vinst bekräftades med Digital PCR som en mer exakt metod. CN variation analys har redan visat sig vara informativ för förutsägelse av behandling motstånd i fastställandet av mCRPC, men det kan vara användbart även för andra ändamål i olika inställningar för patienten. CN analys på cfDNA har flera fördelar: det är icke-invasiv, snabbt och enkelt att utföra, och det börjar från en liten volym av serum eller plasma material.
Introduction
Cirkulerande cell gratis DNA (cfDNA) i blod har visat sig vara en optimal källa av biomarkörer för diagnos, prognos, övervakning och Prediktion av behandling motstånd1,2. Många studier har visat en god överensstämmelse mellan DNA förändringar (mutationer, kopiera antal variationer, epigenetiska förändringar i vävnader) och de som finns i motsvarande plasma prover1, bekräftar att cirkulerande tumör DNA (ctDNA) är informativ för primär och metastaserande tumör vävnad förändringar3. Möjligheten att studera ctDNA tillåter således för återuppbyggnaden av genomisk rearrangements och kopiera antal variationer (CNVs) på specifika onkogener4, identifiera potentiellt metastaserande klonal och subclonal celler. CtDNA har visat sig vara kliniskt nyttig särskilt för cancer behandling övervakning som det hamnar specifika mutationer och CNVs, relaterad till specifika riktade terapier5,6. Det också övervinner behovet vävnadsbiopsier och ger resultat som kan uppnås vid olika tidpunkter under en specifik cancerbehandling på ett icke-invasivt sätt.
När det gäller prostatacancer, en signifikant korrelation mellan cirkulerande cellfria androgen receptor (AR) CNVs och behandling svar till abirateron och enzalutamid visats, indikerande AR gen kopia nummer (CN) i cfDNA kan vara en lovande biomarkör kan förutsäga behandling motstånd7,8,9,10,11. CNVs av specifika gener i ctDNA kan utvärderas med hjälp av olika strategier med olika känslighet, kostnad och snabbhet (t.ex. realtid, Digital PCR, och nästa generations sekvensering).
Här beskriver vi en enkel och snabb metod, baserat på duplex analyser i realtid PCR-teknik för att utvärdera AR CN i cfDNA från serum och plasma prover7,8. Vi övervägde två olika PCR-analyser utformas på två olika genomisk regioner inom intron 5 AR (Xq12) och två andra gener, som intern standard referens gener kända för att ha en normal kopia nummer status i prostatacancer (RNaseP, ligger på 14q11; Sedan1, ligger på 1 p 34). Vi valde två referens gener, i stället för att öka precision och känslighet av resultaten. En DNA mängd 60 ng förstärktes för varje analys kombination (kombinerad analys för AR-assay_1 + RNaseP och AR-assay_2 + AGO1). Tre serum eller plasma DNA-prover från friska män var poolade och används som en kalibrator. Vi ansåg cutoffs av > 1,5 för AR vinning och < 0,5 för borttagning. En av de främsta fördelarna med denna metod är att den är flexibel och att andra gener också kan utvärderas, ändra standard intern referens generna, på grundval av tumör typ och egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet består av isolering av DNA från serum eller plasma prover att utföra realtids-PCR för Kopiera nummer analys. Realtids-PCR för specifika mål, DNA-extraktion och DNA kvantitet kontroll (spektrofotometer) utfördes. I figur 1redovisas en sammanfattning av de förfaranden och tidslinje.
Protokollet följer riktlinjerna i örsta mänskliga forskningsetisk kommitté.
1. serum insamling och bearbetning
- Samla cirka 5 mL helblod i ett serum tube utan antikoagulans få serum. Upprätthålla blod rören vid 4 ° C fram till bearbetning.
- Centrifugrör vid 1 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Noggrant överföra serum i 2 mL rör.
- Kassera samlande röret och genast frysa supernatanten vid-80 ° C fram till användning.
2. plasma insamling och bearbetning
- Samla cirka 10 mL helblod i ett plasma rör med EDTA att erhålla plasma. Fyll röret helt och sedan Invertera det 8 gånger. Upprätthålla blod rören vid 4 ° C fram till bearbetning.
- Centrifugera röret vid 1.800 x g i 15 min i rumstemperatur med ingen broms inställning på centrifugen.
- Noggrant överföra den övre delen av plasman i 2 mL rör. Upprepa överföringen, lämnar minst 1 mL av supernatanten ovanför det vita lagret.
Obs: Överföra den övre delen av supernatanten minskar risken för kontaminering av celler eller cellfragment. - Kassera samlande röret och genast frysa supernatanten vid-80 ° C fram till användning.
3. DNA isolering från Serum eller Plasma
Obs: Isolering av DNA från serum eller plasma bör utföras med kommersiella protokollet ändras i följande steg.
- Tina en alikvot (innehållande från 0,5 till 2 mL) av serum eller plasma vid rumstemperatur.
- Vortex och blanda provet och överför 0,5 mL serum eller plasma till en tydlig 1,5 mL tub. Frysa resten av materialet vid-80 ° C.
- Tillsätt 50 µL proteinas k (20 mg/mL) direkt i provet.
- Tillsätt 0,5 mL lyseringsbuffert och blanda väl genom pipettering.
- Stäng rören och inkubera prover vid 56 ° C i 15 min i blocket värme.
- Lägg till den angivna mängden 100% etanol på tvättbuffert 1 och 2, enligt tillverkarens instruktioner.
- Ta proverna tillbaka till rumstemperatur och tillsätt 0,5 mL absolut etanol och blanda väl genom pipettering.
- Tillsätt 650 µL av den blandning som erhölls i steg 3,7 till separation kolumn och centrifugera vid 6000 x g i 1 min.
- Kassera tuben som innehåller flödet genom och placera kolumnen på en ny ren samling tub. Upprepa steg 3.8 och 3.9 en gång.
- Tillsätt 500 µL av tvättbuffert 1, utan vätning kanten av kolumnen och centrifugera vid 6000 x g i 1 min.
- Kassera tuben som innehåller flödet genom och ersätta den med en ny ren samling tub.
- Tillsätt 500 µL av tvättbuffert 2, utan vätning kanten av kolumnen och centrifugera vid full fart (20 000 x g) under 3 minuter.
- Kassera tuben som innehåller flödet genom och ersätta den med en ny ren samling tub.
- Centrifugera vid full fart (20 000 x g) under 3 minuter att ta bort eventuella kvarvarande tvätt buffert.
- Placera kolumnen i en ren 1,5 mL tub. Tillsätt 150 µL eluering buffert och vänta 7 min för att säkerställa att buffert kissar kolumnen.
- Centrifugera vid 8000 x g i 1 min.
- Överför med pipett till elute från steg 3.16 igen in i samma kolumn och centrifugera vid full fart (20 000 x g) för 1 min att säkerställa maximal återhämtning av DNA.
4. DNA kvantifiering och utspädning
- Utföra kvantifiering av DNA med en spektrofotometer. Använd 2 µL prov på en bänk spektrofotometer per tillverkarens anvisningar.
Obs: Om kvantiteten som DNA inte är tillräcklig för att fortsätta med realtids-PCR (minst 120 ng), utföra en ny DNA isolering process. - Späd DNA från serum eller plasma till 2,5 ng/µL i en slutlig volym som är tillräcklig för alla realtids-PCR (ca 50 µL).
5. realtids-PCR
- Tina kopia antalet analyser, referens gen assay, DNA utspädda prover och kalibratorer poolade i is. Jämvikta vid rumstemperatur huvudmixen som lagras vid 4 ° C.
- Förbered en blandning av 1 µL mål assay, 1 µL referens gen analys och 10 µL av master mix för 3 replikat för varje prov och kalibratorer poolade. Förbered blandningen inklusive en negativ kontroll (vatten) och 2 extra prover.
- I en 96 väl plattan, alikvotens 12 µL av blandningen i varje brunn. Gör inte pipett eller snurra rören.
- Tillsätt 8 µL (koncentration av 2,5 ng/µL) av varje DNA-prov och kalibratorer poolade i varje brunn. Gör inte pipett eller snurra rören. Ändra tipset för varje brunn.
Obs: 30 DNA-prover kan bearbetas för varje realtid experiment med hjälp av plattan med 96 brunnar: 30 x 3 prover + 1 x 3 kalibratorer poolade + negativ kontroll = 94. - Kort snurra ner plattan på 1 000 x g.
- Kör plattan med följande protokoll: Håll scenen vid 95 ° C i 10 min, 40 cykler vid 95 ° C under 15 s, och 60 ° C i 1 min.
6. data analys och tolkning
- I avsnittet ”alternativ”, nedan amplification plot resultaten, ange tröskelvärdet Ct på 0,2 för första målgenen analyseras. Upprepa uppsättningen för varje mål eller referens gener. Tryck på ”Exportera” i verktygsfältet om du vill exportera filen realtids PCR i .txt utsträckande. Flagga endast ”resultat” i Välj data du vill exportera → Välj som filtyp i tillägget .txt → tryck på ”starta export” → nära Exportverktyget.
- Öppna programvaran analys och importera den filen .txt (verktygsfält → importera).
- Välj filnamnet för att analysera och välja inställningen analys av verktygsfält (spela symbol).
- Ange kalibrator provet och kända antalet kopior av målet (t.ex. 1 kopia för AR gen). Tryck på ”tillämpas”.
- För varje prov, utelämna en brunn med olika delta Ct (ΔCt) i jämförelse med andra brunnar.
- Analysera igen experimentet (tryck på play-symbolen).
- Utvärdera resultaten av kopienumret bar tomt eller tabellen.
Obs: Resultattabellen innehåller många parametrar som förtroende, Z-score och replikat analyseras som kan vara användbara för resultat tolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totala cfDNA koncentration var kvantifierbara av spektrofotometri för alla prover analyseras, medianvärde 6.12 ng/µL (intervall: 2,00-23,71 ng/µL) för serumprover och en median på 3,21 ng/µL (sortiment: 2,31-8,49 ng/µL) för plasmaprover. Vi analyserade totalt 115 prover av realtids PCR-experiment.
Testkänslighet bedömdes med hjälp av blandade serum DNA från patienter med hög eller låg vinst för ARoch DNA från friska donatorer, som också används som kalibrator prover för Kopiera nummer analys. Som representerade i figur 2, upptäcks tillräckligt AR CN i 0,375% av DNA från patienter med AR vinst blandat med friska givare DNA för att skapa en gen gain detekterbar (figur 2). Således identifieras denna strategi en mycket låg mängd exemplar nummer vinst. Standardavvikelsen för ΔCt i CN analyser för varje patient beräknades (median ± SD = 0,1, utbud: 0,00 - 0,36). Vi använde en median på standardavvikelsen värdena för att välja Kopiera antal vinst cutoff.
Vi analyserade kopia antalet AR hos patienter behandlade med abirateron (n = 53), att hitta 16 (30,2%) patienter uppvisade AR vinst7. Likaså vi analyserade exemplar nummer variationen för AR -genen hos patienter behandlade med enzalutamid (n = 59), att hitta AR vinst i 21 (36%) av patienter8.
Övrigt vi utvärderat sambandet mellan AR CN och kliniska resultat med Kaplan-Meiermetoden och log-rank test och fann ett signifikant samband. I synnerhet abirateron behandlade fall serien patienter med AR gen vinst visade en median progressionsfri överlevnad (PFS) av 2.8 vs 9,5 månader av icke-fick fall (p < 0,0001). En lägre total överlevnad (OS) har också rapporterats hos patienter med AR CN vinst (p < 0,0001).
Likaså för enzalutamid fall serien, Vi hittade en median-PFS för 2.4 vs 4,0 månader för patienter med AR vinst vs. patienter med ingen vinst (p = 0,0004). Median OS på patienter med AR CN vinst var dessutom 6.1 vs. 14,1 månader för dem utan vinst (p = 0.0003). Alla AR CN vinst resultat från metoden med realtids PCR bekräftades med andra metoder, inklusive digital PCR (figur 3).
Figur 1. Arbetsflöde och tidslinje. Metoden arbetsflödet är indelad i olika steg och tider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tillvägagångssätt känslighet för AR CN upptäckt testats med 2 distinkta pooler (urval 1 och urval 2) av DNA från friska donatorer och från CRPC patienter, fick för AR gen, blandat med olika koncentrationer. Patientens DNA blandades till procentsatser av 0,375, 0,75, 1,5, 3, 6, 12, 25, 50 och 100, med avseende på totala DNA. Röda linjen: cutoff för AR CN vinning (1,5). Denna siffra har ändrats från Salvi o.a. 7
Figur 3. AR CN resultat jämförelse mellan realtids-PCR (qPCR) och digital PCR (dPCR) för flera patienter (x-axeln). Svart linje: cutoff för AR CN vinning (1,5). Denna siffra har ändrats från Salvi o.a. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AR CN analys i serum och plasma prov representerar en ny, icke-invasiv strategi för stratifiering av patienter med kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Det har nyligen visats att AR KN skall kunna förutsäga utfall i CRPC patienter behandlade med abirateron och enzalutamid, före och efter kemoterapi7,8,9,10.
Den största fördelen med vår strategi är att protokollet är mycket enkel att utföra, bestående av endast en DNA isolering process, ett realtids PCR-analys och lätt data tolkningar. Dessutom testet kunde vara snabbt utförda i 1 arbetsdag, och förfarandet är billig ($20 USD för varje prov, ungefär). Vi har visat att denna metod är mycket reproducerbara och resultaten är i linje med de som kommer från dyrare och korrekta metoder, inklusive digital PCR-7,8. Dessutom hittade vi en liknande AR få frekvensen upptäckt med målinriktade NGS strategier på plasmaprover som behandlades med abirateronacetat9,10. En annan viktig fördel är att detta tillvägagångssätt är flexibel och kunna tillämpas för andra sjukdomar där AR genen har en viktig roll. Dessutom kunde andra mål och referens gener väljas utifrån sjukdomen av intresse.
CN analys av genen AR i serum har också vissa begränsningar. För det första metoden DNA spektrofotometrisk kvantifiering är ofta otydliga och kunde ersättas med andra, mer exakt fluorometric metoder. En mer exakt kvantifiering kan ge mer exakta CN resultat. För det andra tyder vissa studier på att det kunde vara bättre att analysera plasma DNA i stället för serum DNA. Mängden cirkulerande cell gratis DNA är generellt högre i serum än i plasma12,13, på grund av koagulering av vita blodkroppar i serum, tyder på att serum är potentiellt en sämre källa för tumör-specifika DNA-analys på grund av eventuell förekomst av vildtyps-DNA.
CN analys av genen AR i serum med realtids PCR-metoder har utförts på 112 CRPC patienter innan de påbörjade behandling med antingen enzalutamid eller abirateron. Våra data visade att AR CN på cfDNA är en kraftfull genetisk biomarkör av kliniska resultat och motstånd mot abirateron och enzalutamid, och kan användas för att identifiera män som kan gynna en priori från anti -AR terapier eller kemoterapi med en snabb och billig PCR-analys. Dessa fynd belysa nyttan av studera blod som en minimalt invasiv metod för förhör terapeutiska resistensmekanismer i både tidig och avancerad CRPC. I framtiden, bör prospektiva och större studier stratifiera patienter av cirkulerande AR status med tanke på de efterföljande skillnaderna i kliniska resultat och behandlingssvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Chiara Molinari och Filippo Martignano för stöd i dataanalys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
