Summary
Dette manuskript beskriver kopi nummer variation analyse udført i serum eller plasma DNA ved hjælp af real-time PCR tilgang. Denne metode er velegnet til forudsigelse af resistens i kastration resistente prostata cancerpatienter, men det kunne være informativ også for andre sygdomme.
Abstract
Serum og plasma celle gratis DNA (cfDNA) har vist sig som en informativ, ikke-invasive biomarkører for kræftdiagnose, prognose, overvågning og forudsigelse af behandling modstand. Med udgangspunkt i den hypotese, at androgen receptor (AR) gen kopi nummer (KN) vinde er en hyppig begivenhed i metastatisk kastration modstand prostatakræft (mCRPC), foreslår vi, at analysere denne begivenhed i cfDNA som en potentiel prædiktive biomarkør.
Vi vurderede AR CN i cfDNA ved hjælp af 2 forskellige real-time PCR assays og 2 reference gener (RNaseP og siden1). DNA beløb af 60 ng blev brugt til hvert assay kombination. AR KN-gevinst blev bekræftet ved hjælp af Digital PCR som en mere præcis metode. KN-variation analyse har allerede påvist for at være informativ for forudsigelse af behandling modstand i fastsættelsen af mCRPC, men det kunne også være nyttigt til andre formål i forskellige patient indstillinger. KN-analyse på cfDNA har flere fordele: det er non-invasiv, hurtig og nem at udføre, og det starter fra en lille mængde af serum eller plasma materiale.
Introduction
Cirkulerende celle gratis DNA (cfDNA) i blodet har vist sig for at være en optimal kilde til biomarkører for kræftdiagnose, prognose, overvågning og forudsigelse af behandling modstand1,2. Mange undersøgelser har vist en god overensstemmelse mellem DNA ændringer (mutationer, kopi nummer variationer, epigenetiske ændringer i væv) og dem, der findes i tilsvarende plasma prøver1, bekræfter, at cirkulerende tumor DNA (ctDNA) er informativ for primær og metastatisk tumor væv ændringer3. Muligheden for at studere ctDNA giver således mulighed for genopbygningen af genomisk rearrangementer og kopi nummer variationer (CNVs) på specifikke onkogener4, at identificere potentielt metastatisk klonede og subclonal celler. CtDNA har vist sig at være klinisk nyttigt især for kræft behandling overvågning som det havne specifikke mutationer og CNVs, relateret til specifikke målrettede behandlinger5,6. Det også overvinder behovet for væv biopsier og giver resultater, der opnås på forskellige tidspunkter i løbet af en bestemt kræftbehandling i en ikke-invasiv måde.
For så vidt angår prostatakræft, en betydelig korrelation mellem cirkulerende celler-fri androgen receptor (AR) CNVs og behandling svar på abiraterone og enzalutamide har været vist, der angiver AR genet kopi nummer (CN) i cfDNA kan være en lovende biomarkør i stand til at forudsige behandling modstand7,8,9,10,11. CNVs af specifikke gener i ctDNA kan evalueres ved hjælp af forskellige metoder med forskellige følsomhed, omkostninger og hurtighed (fx. real-time, Digital PCR, og næste Generation Sequencing).
Her beskriver vi en enkel og hurtig tilgang, baseret på dupleks assays i real-time PCR teknologi, for at vurdere AR CN i cfDNA fra serum og plasma prøver7,8. Vi fandt to forskellige PCR assays designet på to forskellige genomisk regioner i intron 5 af AR (Xq12) og to andre gener, som intern standard reference gener kendt for at have en normal kopi nummer status i prostata cancer (RNaseP, beliggende på 14q11; Siden1, beliggende på 1 p 34). Vi har valgt to reference gener, snarere end en, at øge præcision og følsomhed af resultaterne. En DNA beløb af 60 ng blev forstærket for hvert assay kombination (kombinerede assay for AR-assay_1 + RNaseP og AR-assay_2 + AGO1). Tre serum eller plasma DNA-prøver fra raske mænd blev samlet og brugt som en kalibrator. Vi anså cutoffs af > 1,5 for AR vinding og < 0,5 til sletning. En af de vigtigste fordele ved denne metode er at den er fleksibel og at andre gener kan også vurderes, ændre standard intern reference gener, på grundlag af tumor type og karakteristik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen består af isolering af DNA fra serum eller plasma prøver at udføre real-time PCR for kopi nummer analyse. DNA-ekstraktion, DNA mængde kontrol (Spektrofotometer) og real-time PCR for specifikke mål blev udført. I figur 1, en oversigt over de procedurer og den tid linjen er rapporteret.
Protokollen følger retningslinjerne i IRST menneskelige videnskabsetisk Komité.
1. serum indsamling og behandling
- Indsamle ca 5 mL fuldblod i serum rør uden antikoagulans at få serum. Opretholde blodet rør ved 4 ° C indtil behandling.
- Centrifugeglas på 1.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Omhyggeligt overføre serum til 2 mL rør.
- Kassér den indsamling rør og straks fryse supernatanten ved-80 ° C indtil brug.
2. plasma indsamling og behandling
- Indsamle ca 10 mL fuldblod i en plasma tube med EDTA at få plasma. Fyld slangen helt og derefter vendes det 8 gange. Opretholde blodet rør ved 4 ° C indtil behandling.
- Der centrifugeres tube på 1.800 x g i 15 min. ved stuetemperatur med ingen bremse indstilling på centrifugen.
- Omhyggeligt overføre den øverste del af plasmaet til 2 mL rør. Gentag overførsel, forlader mindst 1 mL af supernatanten ovenfor hvid cellelag.
Bemærk: Overførsel af den øverste del af supernatanten reducerer risikoen for kontaminering af celler eller celle debris. - Kassér den indsamling rør og straks fryse supernatanten ved-80 ° C indtil brug.
3. DNA isoleret fra Serum eller Plasma
Bemærk: Isolering af DNA fra serum eller plasma bør udføres ved hjælp af kommercielle protokollen ændret i følgende trin.
- Tø en alikvot del (indeholdende fra 0,5 til 2 mL) serum eller plasma ved stuetemperatur.
- Vortex og bland prøven og overføres 0,5 mL serum eller plasma til en klar 1,5 mL tube. Fryse resten af materiale ved-80 ° C.
- Tilsæt 50 µL proteinase k (20 mg/mL) direkte til prøven.
- Tilsæt 0,5 mL af lysisbuffer til prøven og bland godt af pipettering.
- Luk rør og inkuberes prøver ved 56 ° C i 15 min i den varme blok.
- Tilføje den angivne mængde af 100% ethanol på vaskebuffer 1 og 2, som angivet af producentens anvisninger.
- Bringe prøverne tilbage til stuetemperatur og der tilsættes 0,5 mL af absolut ethanol og bland godt af pipettering.
- Tilføje 650 µL af blandingen opnået i trin 3.7 adskillelse kolonnen og centrifugeres ved 6.000 x g i 1 min.
- Kassér rør indeholdende flow gennem og placere kolonnen på en ny ren collection tube. Gentag trin 3.8 og 3.9 endnu en gang.
- Tilføje 500 µL af wash buffer 1, uden befugtning rand af kolonnen og centrifugeres ved 6.000 x g i 1 min.
- Kassér rør indeholdende flow gennem og erstatte det med en ny ren collection tube.
- Tilføje 500 µL af vaskebuffer 2, uden befugtning rand af kolonnen og centrifugeres ved fuld hastighed (20.000 x g) i 3 min.
- Kassér rør indeholdende flow gennem og erstatte det med en ny ren collection tube.
- Der centrifugeres ved fuld hastighed (20.000 x g) i 3 min. til at fjerne enhver resterende vask buffer.
- Sæt kolonnen i en ren 1,5 mL tube. Tilsæt 150 µL af eluering buffer og vente 7 min for at sikre, at buffer tisser kolonnen.
- Der centrifugeres ved 8.000 x g i 1 min.
- Der afpipetteres elute fra trin 3.16 igen til den samme kolonne og centrifugeres ved fuld hastighed (20.000 x g) for 1 min til at sikre maksimal nyttiggørelse af DNA.
4. DNA kvantificering og fortynding
- Udføre kvantificering af DNA ved hjælp af et spektrofotometer. Bruge 2 µL af prøven på en bænk-top Spektrofotometer pr fabrikantens anvisninger.
Bemærk: Hvis DNA-mængde ikke er tilstrækkeligt til at fortsætte med real-time PCR (mindst 120 ng), udføre en ny DNA isoleret proces. - Fortyndes DNA fra serum eller plasma til 2.5 ng/µL i en endelige rumfang tilstrækkelig for alle real-time PCR (ca. 50 µL).
5. real-time PCR
- Tø kopi nummer assays, reference gen assay, DNA fortyndede prøver og kalibratorer samles i isen. Blandingen henstår ved stuetemperatur i master mix, der opbevares ved 4 ° C.
- Forbered en blanding af 1 µL af target assay, 1 µL af reference gen assay og 10 µL af master mix for 3 replikater af hver prøve og kalibratorer samles. Forberede den blanding, herunder en negativ kontrol (vand) og 2 ekstra prøver.
- I en 96 godt plade, alikvot 12 µL af blandingen i hver brønd. Gør ikke pipette eller spin rør.
- Tilføje 8 µL (koncentration af 2,5 ng/µL) af hver DNA-prøve og kalibratorer samles i hver brønd. Gør ikke pipette eller spin rør. Ændre tip til hver brønd.
Bemærk: 30 DNA-prøver kan behandles for hver Real-time eksperiment ved hjælp af 96-brønd plade: 30 x 3 prøver + 1 x 3 kalibratorer poolede + negative kontrol = 94. - Kort spin ned plade på 1.000 x g.
- Køre pladen ved hjælp af følgende protokol: hold fase ved 95 ° C i 10 min, 40 cyklusser ved 95 ° C til 15 s og 60 ° C i 1 min.
6. data analyse og fortolkning
- I afsnittet "løsning", under forstærkning plot resultaterne, skal du indstille Ct tærskel på 0,2 for det første mål Gen analyseret. Gentag sæt for hvert mål eller reference gener. For at eksportere filen real-time PCR i filtypenavnet .txt, skal du trykke på "Eksport" i værktøjslinjen. Flag kun "resultater" Vælg data til at eksportere → Vælg som filtype filtypenavnet .txt → tryk "start eksport" → tæt værktøjet eksport.
- Åbn analyse software og importere filen .txt (værktøjslinjen → import).
- Vælg filnavn til at analysere og vælge indstillingen analyse af værktøjslinjen (play symbol).
- Angive kalibrator prøven og den kendte antal kopier af mål (f.eks. 1 kopi til AR genet). Tryk på "Anvend".
- For hver prøve, udelade et godt med forskellige delta Ct (ΔCt) i forhold til andre brønde.
- Genanalyse eksperiment (press play symbol).
- Evaluere resultaterne af eksemplarnummer bar plot eller tabellen.
Bemærk: Resultattabellen indeholder mange parametre som tillid, Z-score og replikater analyseret, som kunne være nyttige for resultater fortolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samlede cfDNA koncentration var kvantificerbare ved spektrofotometri for alle prøver analyseret, viser en median af 6,12 ng/µL (range: 2,00-23.71 ng/µL) for serumprøver og en median af 3,21 ng/µL (range: 2,31-8,49 ng/µL) for plasmaprøver. Vi analyseret i alt 115 prøver af real-time PCR eksperimenter.
Test følsomhed blev vurderet ved hjælp af blandet serum DNA fra patienter med høj eller lav gevinst for AR, og DNA fra raske donorer, der også anvendes som kalibrator prøver for kopi nummer analyse. Som vist i figur 2, er AR CN tilstrækkelig påvist i 0.375% af DNA fra patienter med AR gevinst blandet med sunde donor DNA til at få et gen gevinst påviselige (figur 2). Således, denne tilgang opdaget et meget lavt beløb af kopi nummer gevinst. Standardafvigelsen af ΔCt i KN-assays til hver enkelt patient blev beregnet (median ± SD = 0,1, rækkevidde: 0,00 - 0,36). Vi brugte en median værdifællesskab standardafvigelse for at vælge kopi nummer gevinst cutoff.
Vi analyserede kopi antallet af AR hos patienter behandlet med abiraterone (n = 53), at finde 16 (30.2%) patienter udstillet AR gevinst7. Ligeledes, vi analyseret kopi nummer variation i AR genet hos patienter behandlet med enzalutamide (n = 59), at finde AR gevinst i 21 (36%) af patienterne8.
Desuden vi evalueret tilknytningen mellem AR CN og kliniske resultater ved hjælp af metoden Kaplan-Meier og log-rank test og fandt en signifikant sammenhæng. Især abiraterone behandlet sag serie patienter med AR gen gevinst viste en median progression gratis overlevelse (PFS) af 2.8 vs. 9,5 måneder af ikke-opnået tilfælde (p < 0,0001). En lavere samlet overlevelse (OS) blev også rapporteret hos patienter med AR KN-gevinst (p < 0,0001).
På samme måde for enzalutamide case serie, vi fandt en median PFS 2.4 vs 4.0 måneder for patienter med AR gevinst vs patienter med ingen gevinst (p = 0,0004). Derudover median OS af patienter med AR KN-gevinst var 6.1 vs 14,1 måneder for dem uden gevinst (p = 0,0003). Alle AR KN-gevinst resultaterne fra de real-time PCR tilgang blev bekræftet ved hjælp af andre metoder, herunder digital PCR (figur 3).
Figur 1. Arbejdsproces og tidslinjen. Arbejdsprocessen metode er opdelt i forskellige trin og gange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Tilgang følsomhed for AR KN-påvisning testet ved hjælp af 2 adskilte puljer (prøve 1 og prøve 2) af DNA fra raske donorer og fra CRPC patienter, fik for AR genet, blandet i forskellige koncentrationer. Patienternes DNA blev blandet på procenter af 0.375, 0,75, 1,5, 3, 6, 12, 25, 50 og 100, i henseende til samlede DNA. Rød linje: cutoff for AR KN-gevinst (1,5). Dette tal er blevet ændret fra Salvi et al. 7
Figur 3. AR KN-resultater sammenligning mellem real-time PCR (qPCR) og digital PCR (dPCR) til flere patienter (x-akse). Sort linje: cutoff for AR KN-gevinst (1,5). Dette tal er blevet ændret fra Salvi et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AR KN-analyse i serum og plasma stikprøven repræsenterer en ny, ikke-invasiv metode for stratificering af kastration resistente prostatakræft (CRPC) patienter. Det har været for nylig påvist, at AR KN er i stand til at forudsige resultater i CRPC patienter behandlet med abiraterone og enzalutamide, før og efter kemoterapi7,8,9,10.
Den største fordel ved vores tilgang er, at protokollen er meget enkel at udføre, bestående af kun en DNA isoleret proces, en real-time PCR analyse og let data fortolkninger. Derudover testen kunne hurtigt udføres i 1 arbejdsdag, og proceduren er billig ($20 USD for hver prøve, ca). Vi har vist, at denne metode er meget reproducerbare og de opnåede resultater er i overensstemmelse med dem, der kommer fra dyrere og mere nøjagtige metoder, herunder digital PCR7,8. Derudover fandt vi en lignende AR få frekvens opdaget med målrettede NGS strategier på plasmaprøver behandlet med abiraterone9,10. En anden vigtig fordel er, at denne tilgang er fleksibel og kunne gælde for andre sygdomme, hvor AR gen har en vigtig rolle. Derudover kunne andre mål og reference gener vælges baseret på sygdom af interesse.
KN-analyse af AR genet i serum har også nogle begrænsninger. For det første DNA spektrofotometriske kvantificering metode er ofte upræcise og kan erstattes med andre, mere nøjagtige fluorometriske metoder. En mere nøjagtig kvantificering kunne give mere præcise KN-resultater. For det andet, nogle undersøgelser har antydet, at det kunne være bedre til at analysere plasma DNA i stedet for serum DNA. Mængden af cirkulerende celle gratis DNA er generelt højere i serum end i plasma12,13, på grund af koagulation af hvide blodlegemer i serum, tyder på, at serum er potentielt en værre kilde for tumor-specifik DNA analyse på grund af den mulige tilstedeværelse af vildtype DNA.
KN-analyse af AR genet i serum ved hjælp af real-time PCR metoder er udført på 112 CRPC patienter, før de startede behandling med enten enzalutamide eller abiraterone. Vores data viste at AR KN på cfDNA er en kraftfuld genetiske biomarkør af kliniske resultater og modstand mod abiraterone og enzalutamide, og kan bruges til at identificere mænd, der kan gavne apriori fra anti -AR behandlinger eller kemoterapi ved hjælp af en hurtig og billig PCR assay. Disse resultater understreger nytten af at studere blod som en minimalt invasiv metode til spørgekriterierne mekanismer af terapeutiske modstand i både tidlige og avancerede CRPC. I fremtiden, bør potentielle og større undersøgelser stratificere patienterne af cirkulerende AR status efterfølgende forskelle i kliniske resultater og behandlingsrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Chiara Molinari og Filippo Martignano for støtte i dataanalyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
