Summary
Un nouveau protocole pour la préparation de la chromatine du muscle squelettique de souris adultes adapté à l’étude de la régulation génique dans les fibres musculaires par immunoprécipitation de la chromatine est présenté.
Abstract
Les auteurs décrivent un protocole efficace et reproductible pour la préparation de la chromatine du muscle squelettique de souris adultes, un tissu résistant physiquement avec une teneur élevée en protéines structurales. Disséqué les muscles de souris adultes sont physiquement perturbés par homogénéisation mécanique, ou une combinaison de hacher et de douncing, dans un tampon hypotonique avant la fixation de formaldéhyde du lysat cellulaire. Les noyaux fixes sont purifiés par des cycles supplémentaires d’homogénéisation mécanique ou douncing et filtrations séquentielles pour éliminer les débris cellulaires. Les noyaux purifiés peuvent être sonication immédiatement ou ultérieurement après congélation. La chromatine peut être efficacement sonication et est approprié pour les expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, comme le montrent les profils obtenu pour des facteurs de transcription, l’ARN polymérase II et modifications d’histone covalente. Les liaison des événements détectés à l’aide de la chromatine, établie par le présent protocole sont principalement ceux qui se produisent dans le noyau de la fibre musculaire malgré la présence de la chromatine des autres satellites associés aux fibres et les cellules endothéliales. Ce protocole est donc adapté pour étudier la régulation génique dans le muscle squelettique de souris adulte.
Introduction
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) couplée à la PCR quantitative (qPCR) et séquençage à haut débit (ChIP-seq) sont devenues les méthodes de choix pour étudier la transcription et de la régulation épigénétique de l’expression génique dans divers tissus et types de cellules1. Cette technique permet de tout le génome de profilage de modifications de la chromatine covalent, occupation variant d’histone et transcription factor binding2,3.
Interprétant des puces de cellules cultivées est bien établie, une puce de tissus de mammifères reste plus difficile. Préparer la chromatine ChIP implique plusieurs étapes essentielles qui doivent être optimisées pour chaque type de tissus et de cellules. Chromatine peut être préparée à partir les lysats cellulaires des cellules cultivées ou purification suivante de leurs noyaux. Dans le cas de tissus de mammifères, lyse efficace, fixation de formaldéhyde et de purification des noyaux sont essentiels pour assurer un recouvrement optimal de la chromatine. En outre, le choix s’il convient de fixer les noyaux avant ou après leur purification doit être déterminée expérimentalement. Malgré ces obstacles, ChIP a été effectué avec succès des tissus tels que le foie, testicules ou cerveau4,5,6. Dans le cas du muscle squelettique, perturbation d’un tissu résistant physiquement, qui présente une teneur élevée en protéines de structure et l’isolation de ses noyaux est particulièrement difficile. Compte tenu de cette spécificité, protocoles optimisés pour les autres tissus ne donnent pas des résultats satisfaisants pour les muscles squelettiques.
Nous décrivons ici un protocole afin d’isoler la chromatine ChIP-grade du tissu de muscle squelettique de souris qui consiste à perturber physiquement le tissu, la fixation de formaldéhyde et puis l’isolement des noyaux et sonication. L’efficacité de cette méthode pour préparer la chromatine convenant à la puce de ce tissu a été démontrée en effectuant la puce-qPCR et ChIP-seq pour divers facteurs de transcription, l’ARN polymérase II et covalents histone modifications7.
Cette nouvelle technique est beaucoup plus rapide qu’un protocole a déjà été indiqué8 comprenant depuis longtemps des mesures de digestion de collagénase au cours de laquelle, les changements dans la localisation génomique des facteurs de transcription et les altérations de l’expression des gènes peuvent avoir lieu. La rapidité avec laquelle les noyaux sont isolées et fixe rend la méthode décrite ici particulièrement attractif pour préparer la chromatine qui capte plus fidèlement l’état d’occupation génomique native. En outre, bien que les autres méthodes pour l’extraction de la chromatine isolement ou des protéines de tissu musculaire ont ont été décrit8,9,10 et utilisés pour des expériences de puce-qPCR sur certains gènes, aucun ChIP-seq données a été signalées à les utiliser. La méthode rapportée ici convient pour transcription factor et histone modification ChIP-seq et par conséquent doit être également adaptée aux 3 / 4C ou les applications de capture conformation de la chromatine HiC.
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Protocol
souris ont été conservés conformément aux orientations institutionnelles concernant le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et conformément à des directives nationales de soins des animaux (Commission européenne directive 86/609/CEE ; Français le décret n° 87-848). Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique national Français.
1. isolement des tissus musculaires
souris- Sacrifice un adulte 6 à 8 semaines par dislocation cervicale. Sterlise le membre en le rinçant avec l’éthanol à 70 % et disséquer les muscles de la patte arrière (muscle gastrocnémien, muscle jambier antérieur, Quadriceps) à l’aide de ciseaux de la pointe fine et forceps.
Remarque : Une souris devrait produire environ 500 mg de tissu. - Hachez les muscles dans un tube à essai 2 mL contenant 1 mL de tampon hypotonique glacée d’une préparation homogène des petits (< 2-3 mm 3) morceaux à l’aide de fins ciseaux et laisser le tube tremblaient sur un agitateur de dessus de banc à 4 ° C pendant 5-10 min.
2. La lyse des tissus
Remarque : veuillez vous reporter au tableau 1 pour toutes les compositions de tampon.
- Transférer l’homogénat dans un tube de fond rond de 14 mL et remettre en suspension dans 5 mL de tampon hypotonique froid (sans EDTA inhibiteur de protéase cocktail et PMSF).
- Homogenise le tissu de muscle hachées à l’aide d’un lâche dounce (20-30 coups de moins de 3 min) ou un homogénéisateur tissu mécanique pour 15-30 s en tubes fond rond 14 mL.
Remarque : L’efficacité de la lyse peut être évaluée à ce stade en microscopie photonique, et le cas échéant, des perturbations supplémentaires peuvent être effectuées.
- Homogenise le tissu de muscle hachées à l’aide d’un lâche dounce (20-30 coups de moins de 3 min) ou un homogénéisateur tissu mécanique pour 15-30 s en tubes fond rond 14 mL.
- Transférer l’homogénat pour tubes de 15 mL et remplir le volume à 10 mL à l’aide du tampon hypotonique froid. Difficulté de l’homogénat tel que décrit ci-dessous avant de procéder à la prochaine souris.
3. Fixation
- Ajoutez le formaldéhyde à concentration finale de 1 % et agiter pendant 10 min à température ambiante.
- Ajouter glycine à une concentration finale de 0,125 M dans chaque tube pour arrêter la fixation et agiter pendant 5-10 min à température ambiante.
4. Préparation des noyaux
Remarque : veuillez vous reporter au tableau 1 pour toutes les compositions de tampon.
- Homogenise le lysat fixe utilisant un dounce lâche (5 à 10 fois).
- Transfert à un tube de 15 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir des noyaux et des débris cellulaires.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans tampon hypotonique frais 5 mL. Filtrer le lysat à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube de 50 mL. Re-filtrer le filtrat à travers un tamis de cellule de 40 µm.
- Transvaser le filtrat dans un tube de 15 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 minutes à 4 ° C pour obtenir le culot nucléaire.
Remarque : À ce stade, les noyaux peuvent être immédiatement sonication ou snap gelé comme une pastille sèche dans l’azote liquide et conservé à -80 ° C.
5. Sonication
- évaluer le volume du culot nucléaire (environ 50 µL d’homogénéisation mécanique tant dounce) et il remettre en suspension dans un tampon de sonication jusqu'à 3 à 4 fois de volume nucléaire emballé et laisser agir pendant 10-15 min à 4 ° C en utilisant un sonicateur .
Remarque : La chromatine peut être analysée immédiatement comme décrit ci-dessous (6) ou congelée et conservée à -80 ° C.
6. Évaluer la taille de Fragment de chromatine après Sonication
Remarque : veuillez vous reporter au tableau 1 pour toutes les compositions de tampon.
- De-crosslink, prendre 30 µL de la chromatine dans une éprouvette de 1,5 mL et ajouter 20 µL 5 M NaCl. Compléter le volume à 500 µL et incuber à 65 ° C pendant la nuit.
- Le lendemain, effectuer un traitement avec de protéinase K 1 µL (stock de 20 mg/mL), 10 µL 2 M Tris pH 6,8 et 10 µL d’EDTA 0,5 M pendant 1 h à 42 C. effectuer un phénol-chloroforme/chloroforme extraction et précipiter l’ADN avec 1 volume de sodium acetat e (3 M) et 2 volumes d’éthanol à 100 % pour 1 heure à-80 ° C ou une nuit entre -20 ° C.
- L’ADN de granule par centrifugation à 13 500 g pendant 15 min. décanter le liquide surnageant et laver le culot soigneusement avec l’éthanol 70 % froid et centrifuger à nouveau pendant 5 min. décanter le liquide surnageant et sécher le culot.
- Resuspendre le culot dans le volume original (30 µL) de tampon TE. Mesurer la concentration d’ADN dans un spectrophotomètre par absorption à 260 nm/280 nm. Pipeter 500-1 000 ng d’ADN avec une échelle de taille d’ADN sur des voies séparées d’un gel d’agarose de 1,5 % et effectuer l’électrophorèse pour évaluer la taille des fragments de chromatine.
Remarque : Taille du Fragment doit être comprise entre 200 à 500 paires de bases et il ne devrait y avoir aucun fragment détectable de haut poids moléculaire correspondant au non - ou mal-fragmentation ADN. Si nécessaire, la solution de la chromatine (étape 5) peut être re-sonication pendant un certain temps et puis analysée de nouveau comme décrit ci-dessus, jusqu'à obtention de la taille optimale.
7. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
Remarque : veuillez vous reporter au tableau 1 pour toutes les compositions de tampon.
- Sépharose perles de bloquer la protéine G par aliquotage 1 mL de la boue de 50 % dans l’éthanol. Pellet les perles par centrifugation à 400 g pendant 1 min dans une table de travail centrifuger et laver avec 1 mL de centrifugeuse tampon TE à 400 x g et répéter le Wash.
- Après que la seconde centrifugation, de remettre en suspension dans 1 mL de tampon de dilution de puce avec 25 µL de BSA (stock 20 mg/mL) et de 20 µL tRNA (stock 10 mg/mL) de levure. Bloquer les perles au moins 2 h avant son utilisation en rotation (40-60 t/mn) à 4 ° C.
- Diluer 50 µg de chromatine (étape 5) 8 à 10 fois en utilisant le tampon de dilution de puce. Ajouter 50 µL de lisier perle bloqués et incuber pendant 2 h rotation (40-60 t/mn) à 4 ° C. Centrifuger à 400 x g à 4 ° C pour obtenir la chromatine préapprouvée et le transférer dans un nouveau tube.
- Pour l’immunoprécipitation, ajouter la quantité appropriée d’anticorps primaire (p. ex., 1 à 2 µg / 10 µg de chromatine) et incuber pendant la nuit avec rotation à 4 ° C.
NOTE : La quantité optimale d’anticorps peut être recommandée par le fournisseur ou peut être déterminée empiriquement en effectuant la puce-qPCR avec différentes quantités d’anticorps jusqu'à ce que l’enrichissement optimum est observée. Aussi G protéine Sépharose peut être remplacé par protéine A Sépharose selon le sous-type de l’anticorps utilisé. - Ajouter les perles bloqués le lendemain et incuber pendant 1 heure avec rotation (40-60 t/mn) à 4 ° C. Centrifuger à 400 x g pendant 20-30 s pour les perles de granule, éliminer le surnageant et commencer la puce se lave.
- ChIP lavages : effectuer les lavages suivants avec les tampons : une fois avec le tampon salin faible, puis deux fois avec le tampon salin haute, deux fois avec le tampon de LiCl et enfin deux fois avec le tampon TE.
- Effectuer chaque lavage pendant 10 min avec rotation (40-60 t/mn) à 4 ° C et -pellet les perles entre chaque lavage par centrifugation à 400 x g pendant 20-30 s dans une centrifugeuse de paillasse.
- Pour l’élution, enlever le dernier lavage et remettre en suspension les perles dans 250 µL de tampon d’élution (fraîchement préparé) pendant 15 min à température ambiante en agitant.
- Centrifugeuse à 400 x g et recueillir l’éluat dans un nouveau tube. Effectuez cette étape deux fois, puis de-crosslink l’éluat du jour au lendemain avec 20 µL NaCl 5 M et 1 µL RNase A (10 mg/mL), traiter avec la protéinase K et phénol-chloroforme/chloroforme extragir comme dans l’étape 6.
- Remettre en suspension dans 50 µL de tampon TE et utiliser des aliquotes pour puce-qPCR selon les protocoles standard 15 pour vérifier la qualité de la puce.
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Representative Results
Pour isoler les noyaux, nous avons effectué homogénéisation mécanique du tissu musculaire disséqués et hachée pour 15 ou 45 s, à 18 000 et 22 000 tr/min (voir Table des matières). Dans toutes les conditions, les noyaux pouvaient être séparés des débris tissulaires, mais le rendement est optimal à l’aide de la vitesse inférieure (Figure 1 a-B). Noyaux pourraient aussi être préparés par douncing pendant 3-5 min (Figure 1 aet les données non présentées), mais l’homogénéisation mécanique est la méthode de choix, des rendements optimaux des noyaux peuvent être atteints en moins de 15 s, ce qui permet un important gain de temps, surtout si plusieurs échantillons doivent être traitées (Figure 1 b). Utilisant ce protocole, jusqu'à 2,7 x 107 noyaux de 500 mg de tissu (équivalent au tissu de 1 souris) peuvent être isolés pour générer 100 µg de chromatine.
Pour optimiser la fragmentation de la chromatine du noyau fixe, nous soniqué pendant 5 à 20 min. Sous les paramètres (voir la Table des matières), une sonication 10 min était optimale pour générer la chromatine avec une taille moyenne de fragment de 250 bp (Figure 2). Cette étape doit être optimisée expérimentalement en tenant compte du type de sonicateur utilisé.
Pour évaluer la qualité de la chromatine de muscle établie par le protocole décrit ci-dessus, ChIP-qPCR et ChIP-seq expériences ont été effectuées contre des facteurs de transcription, une modification des histones ou de l’ARN polymérase II (Pol II). Puce-qPCR contre le récepteur des glucocorticoïdes (GR) en présence ou en absence de traitement à la dexaméthasone (Dex) révéla fort enrichissement de Dex-dépendante GR à éléments régulateurs des gènes Redd1 et Murf1 qui sont connus pour être de Dex et GR réglementée dans les fibres musculaires11, même si aucun signal n’a été observée lors du promoteur de testicule Prm1 spécifique utilisé comme contrôle négatif (Figure 3 a).
Puce-qPCR contre acétylé lysine 27 de l’histone H3 (H3K27ac), une modification covalente à exhausteurs de l’actifs et des promoteurs, a montré fort enrichissement à la desmine (Des) promoteur qui est actif dans les fibres musculaires, par rapport à un négatif intergénique région de contrôle (Figure 3 b). H3K27ac ChIP-seq a révélé un niveau élevé de cette marque dans le locus Des , typique d’un « super-enhancer » tissu réglementé identité gène12 (Figure 4 a). De même, la Pol II ChIP-seq démontraient des niveaux élevés de transcription Pol II à ce locus.
Puce-qPCR de facteur de transcription Tead4, qui joue un rôle important dans la différenciation myogénique13,7, révéla son enrichissement sur les sites de liaison décrites précédemment au Ccnd1 et (gènes) Ifrd1 La figure 3). Ce qui est important, l’enrichissement a été réduite à l’aide de la chromatine, préparée à partir de souris où Tead4 a été inactivé sélectivement dans les fibres musculaires (Tead4skm-/-)7 (Figure 3). Analyses des données de ChIP-seq pour Tead1 et Tead4 ont montré leur liaison à un site dans le promoteur du gène Kdm5a à l’aide de la chromatine du muscle de type sauvage, alors que le signal de Tead4, mais pas celui de Tead1, H3K27ac ou Pol II, a été perdu à l’aide de la chromatine de muscles de la Tead4skm-/- souris (Figure 4 b). De même, Tead1 et Tead4 la liaison à un élément régulateur en aval du gène Adssl1 est vu avec la chromatine du muscle de type sauvage, alors que Tead4 liaison disparaissait sélectivement à l’aide de la chromatine de la Tead4skm-/- musculaire () La figure 4). Ces observations démontrent que le signal de Tead4 vu dans les données de ChIP-seq est venu de se lier dans la fibre musculaire.
Pour déterminer la contribution des autres types de cellules associées à la fibre musculaire aux résultats ChIP-seq, nous avons évalué les signaux H3K27ac et Pol II dans le gène Vcam1 qui est actif dans les cellules satellites musculaires et Pecam1, un marqueur de cellules endothéliales des vaisseaux sanguins irriguant les muscles. Par rapport aux niveaux élevés observés dans les gènes Des ou Adssl1 , les niveaux de H3K27ac et Pol II vu à gènes le Vcam1 et le Pecam1 étaient beaucoup plus faible (Figure 4 a et Figure 4). Les grandes différences de signal pour des gènes de fibre musculaire exprimée par rapport à ceux exprimés dans des tissus attenants ont indiqué que le signal vu dans la puce de la chromatine préparée selon le protocole décrit ci-dessus vient principalement de liaison d’événements dans le fibres musculaires.
Figure 1 : Purification des noyaux de muscle de souris adultes. (A) les lysats de tissus obtient par homogénéisation mécanique (18 000 tr/min, 45 s) et homogénéisation dounce (30 coups/3 min) ont été colorées au bleu de trypan et observés au microscope numérique et images ont été capturées à un grossissement de 20 X. Echelle = 100 µm. (B) le nombre de noyaux obtenue par 500 mg de tissu (l’équivalent de 1 souris) après préparation sous les conditions indiquées, 18 000 et 22 000 tr/min à 15 et 45 s ou 3 min de douncing. Barres d’erreur représentent la moyenne ± S.E.M. pour n = 3 souris pour homogénéisation mécanique et n = 3 souris pour douncing. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : vérification de la taille du fragment chromatine. Des noyaux isolés étaient sonication pour 5, 10, 15 ou 20 min comme indiqué. Après de-réticulation et la purification, la taille de fragment d’ADN a été évaluée par électrophorèse sur gel d’agarose en présence de bromure d’éthidium. M est le marqueur de taille d’ADN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : utilisation de la chromatine pour puce-qPCR. (A) la souris ont été soumis à des injections intra péritonéales de véhicule ou la dexaméthasone (10 mg/kg) et après 1,5 h, chromatine préparait des muscles des membres postérieurs. L’enrichissement en puce à gènes cibles GR Redd1 et Murf1, par rapport au promoteur de protamine contrôle négatif (Prm1), est indiquée en % de l’entrée précipitée. (B) ChIP a été faite H3K27ac et IgG anticorps de contrôle et analysé dans le promoteur de la desmine et par rapport à une région intergénique contrôle négatif. (C) Tead4 ChIP a été réalisée sur la chromatine musculaires provenant de type sauvage et chez des souris knockout spécifiques du muscle Tead4 (Tead4skm-/-) et analysés au Tead4 des sites de fixation dans les promoteurs Ccnd1 et Ifrd1 , par rapport à la région intergénique contrôle. Dans toutes les expériences, la chromatine de 3 souris a été mis en commun et barres d’erreur représentent la moyenne ± S.E.M dans un test de Student T-pour trois répétitions techniques. Valeur P < 0.001* *, < 0,0001 *** ; NS, non significative. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : profils génomiques de la fibre musculaire chromatine. Captures d’écran (A) de l’University de Californie à Santa Cruz navigateur de génome des loci indiqué illustrant les niveaux beaucoup plus élevés H3K27ac et Pol II du gène de la desmine, fortement exprimée dans les fibres musculaires, par rapport aux gènes Vcam1 et Pecam1 exprimés dans les cellules satellites et endothélial cellules, respectivement. (B) l’UCSC captures d’écran des loci indiqué illustrant la liaison de la Tead1 et Tead4, ainsi que H3K27ac et Pol II, à la chromatine de type sauvage (WT) muscle comparée à celle de Tead4skm-/- musculaire (MT), correspondant à une perte sélective de liaison Tead4 observée. Les données de ChIP-seq illustrées sont disponibles comme GSE82193 dans la base de données GEO. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom de la mémoire tampon | Composition | ||
| Tampon hypotonique | 10 mM HEPES-KOH (pH 7,3) | ||
| 10 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0,1 % NP-40 | |||
| 0,1 mM PMSF (fraîchement ajouté) | |||
| Cocktail d’inhibiteur de protéase (PIC) 1 x (fraîchement ajouté) | |||
| Tampon de sonication | 1 % SDS | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 millimètres Tris-HCl pH 8 | |||
| NaCl 150 mM | |||
| 0,1 désoxycholate de sodium % | |||
| 1 % Triton X-100 | |||
| Fraîchement ajouté PMSF à 0,1 mM | |||
| PIC 1 x | |||
| Tampon de Dilution de puce | 0,01 % SDS | ||
| 1,1 % Triton X-100 | |||
| 1,2 mM EDTA | |||
| 16,7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| Fraîchement ajouté PMSF à 0,1 mM | |||
| PIC 1 x | |||
| Tampon salin faible | 0,1 SDS % | ||
| 1 % Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| NaCl 150 mM | |||
| Haute tampon salin | 0,1 SDS % | ||
| 1 % Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl tampon | LiCl 250 mM | ||
| 1 % NP-40 | |||
| EDTA 1 mM | |||
| 10 mM Tris HCl, pH 8 | |||
| Tampon d’élution | 1 % SDS | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| Tampon Tris-EDTA (TE) | 50 mM Tris HCl, pH 8 | ||
| EDTA 1 mM | |||
Tableau 1 : Compositions de tampon.
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Discussion
Nous décrivons ici un nouveau protocole pour la préparation de la chromatine des muscles squelettiques des souris adultes et montrent que cette chromatine est appropriée pour les expériences de puce détectant les liaison de facteur de transcription et des modifications d’histone covalente dans les noyaux des fibres musculaires. Ce protocole implique plusieurs étapes cruciales. La première est la perturbation de tissus qui peut être effectuée soit par dounce par cisaillement mécanique. Tonte mécanique est plus rapide et plus reproductible et est donc la méthode de choix. Néanmoins, si aucun appareillage n’est disponible, perturbation peut également être réalisée par douncing, où l’évaluation de l’efficacité de la lyse au microscope est recommandée avant de passer à l’étape de fixation. Fixation des lysats de tissus ensemble, plutôt que la fixation des noyaux isolés, permis plus reproductible sonication en petites quantités et pour de courtes durées. Nous avons choisi également de fixer les lysats après interruption plutôt que de Difficulté les tissus avant perturbation, telle que décrite par Thomas et al. 10 préfixation des taux le tissu a une efficacité réduite d’homogénéisation. Ce protocole basé sur cisaillement mécanique est également plus rapide que les autres solutions proposées, telles que la digestion de collagénase, qui impliquent une incubation prolongée du tissu découpé à 37 ° C8. Durant cette période, les changements dans la liaison de gene expression et transcription factor peuvent se produire. Il est donc essentiel de capturer plus fidèlement l’état physiologique normal de fixation les noyaux aussi vite que possible.
Une deuxième étape essentielle est la purification des noyaux de la fixe lysats. Pour ce faire, le filtrage séquentiel de la solution de lysate fixe, tout d’abord à travers un tamis de cellule de 70 µm pour éliminer les débris plus gros, puis à travers un tamis de cellule de 40 µm pour éliminer les débris fins, évite le colmatage des crépines et maximise le rendement des noyaux obtenus. Une fois purifiée par filtration, les noyaux sont sonication et la taille de fragment d’ADN déterminé après de-réticulation. Une préparation typique de deux membres postérieurs d’un souris donne 100 µg de chromatine. Mettre en commun les lysats de jusqu'à 3 souris peut améliorer le rendement en réduisant les pertes au cours de la préparation. Cette procédure est efficace car il permet la récupération jusqu'à 75 % de l’ADN génomique comme la chromatine (données non présentées).
Expériences de puce visant à évaluer la liaison de facteur de transcription et les modifications épigénétiques ont démontré la pertinence de ce protocole pour l’étude de la régulation génique dans les noyaux des fibres musculaires. Forts et solides des signaux de ChIP-seq pour Pol II et H3K27ac ont été générés de la chromatine, permettant d’identifier des fibres musculaires identité des gènes par leurs profils distinctifs H3K27ac et Pol II7. Les niveaux beaucoup plus élevés de H3K27ac et Pol II sur gènes fortement exprimés dans les noyaux de fibre, par rapport aux gènes exprimés dans des satellites ou des cellules endothéliales, a montré que le signal est venu principalement dans les noyaux de la fibre. Cela a également été confirmée par la perte du signal de puce Tead4 à l’aide de la chromatine de souris où elle a été spécifiquement inactivée dans les fibres musculaires. Néanmoins, plus faibles, mais clairement au-dessus des signaux de fond, des marqueurs de cellules satellites tels que Vcam1, Pax7 (données non présentées) peuvent être détectés montrant que la chromatine de ces cellules est également présent. Nous prévoyons que notre protocole devrait être adapté aux autres techniques qui utilisent la chromatine formaldéhyde-correction comme 3C/4c et HiC chromatine conformation capture. Utilisation de notre protocole pour combiner que Chip-seq pour les facteurs de transcription et les modifications de la chromatine avec capture de conformation de la chromatine devrait permettre à l’avenir une compréhension détaillée des gènes des mécanismes de régulation dans les fibres musculaires et comment elles peuvent être réglementées bouleversé par les stimuli physiologiques, tels que l’exercice, le jeûne, un régime riche en graisses, dénervation, ou dans la maladie, à l’aide de la chromatine, préparée à partir d’organismes génétiquement modifiés souris reproduisant des maladies telles que X-linked centronuclear myopathy14.
En résumé, ce protocole temps-efficace et peu coûteuse permet l’isolement des noyaux de fibres musculaires qui peuvent être sonication immédiatement ou congelé à-80 ° C pour une utilisation ultérieure. L’utilisation de la chromatine, établie par le présent protocole a fourni les premières données ChIP-seq larges de génome de fibre musculaire7 et facilitera les études futures sur la régulation génique dans ce tissu.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions tout le personnel de l’installation de séquençage à haut débit IGBMC, membre du consortium « France Génomique » (ANR10-INBS-09-08) et tous les services généraux de l’IGBMC, en particulier le personnel de l’animalerie de l’IGBMC. Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le CNRS, l’INSERM, l’AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, les Français l’état des fonds par le biais de l’ANR au titre du programme Investissements d’avenir étiquetés ANR-10-IDEX-0002-02, le Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 et la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. S.J a été appuyée par la Ligue Nationale contre le Cancer et le ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 et V.U par le Ministère de l’enseignement et de la Recherche. ID est une « équipe labellisée » de la Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
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