Summary
Eine neuartige Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur zur Erforschung der Genregulation in Muskelfasern von Chromatin Immunopräzipitation angepasst präsentiert.
Abstract
Wir beschreiben eine effiziente und reproduzierbare Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur, eine physisch resistent Gewebe mit einem hohen Gehalt von Strukturproteinen. Sezierten Gliedmaßen Muskeln von Erwachsenen Mäusen sind physisch durch mechanische Homogenisierung oder eine Kombination von hacken und Douncing in einem hypotonischen Puffer vor Formaldehyd Fixierung der Zelle lysate gestört. Die feste Kerne werden gereinigt, durch weitere Zyklen von mechanischer Homogenisierung oder Douncing und sequentielle Filtrationen, Zelle Ablagerungen zu entfernen. Die gereinigte Kerne können sofort oder zu einem späteren Zeitpunkt nach dem Einfrieren beschallt werden. Das Chromatin kann effizient beschallt und ist geeignet für Chromatin Immunopräzipitation Experimente, wie durch die Profile für Transkriptionsfaktoren, RNA-Polymerase II und kovalente Histon Änderungen erhalten. Die verbindliche Ereignisse mit Chromatin vorbereitet durch dieses Protokoll nachgewiesen sind überwiegend in die Muskelfaser Kerne trotz der Anwesenheit von Chromatin von anderen Faser-assoziierten Satelliten- und Endothelzellen stattfindet. Dieses Protokoll ist daher angepasst, Genregulation in der Skelettmuskulatur erwachsener Mäuse zu studieren.
Introduction
Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gekoppelt und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-Seq) geworden, die Methoden der Wahl Transkription zu studieren und epigenetischen Regulation der Genexpression in verschiedenen Geweben und Zelltypen1. Diese Technik erlaubt es genomweiten Profilierung der kovalente Chromatin Änderungen, Histon Variante Belegung und Transkription Faktor Bindung2,3.
ChIP von kultivierten Zellen gut etabliert ist, bleibt ChIP von Säugetier-Gewebe schwieriger. Die Vorbereitung von Chromatin für ChIP umfasst mehrere wichtige Schritte, die für jede Art von Gewebe und Zellen optimiert werden müssen. Chromatin kann aus der zellulären Lysates kultivierten Zellen oder folgende Reinigung des ihre Kerne hergestellt werden. Im Falle von Säugetier-Gewebe sind effiziente lyse, Formaldehyd Fixierung und Reinigung der Kerne kritisch, um optimale Erholung des Chromatins zu gewährleisten. Darüber hinaus hat die Wahl, ob die Kerne vor oder nach ihrer Reinigung beheben experimentell zu ermitteln. Trotz dieser Hürden hat ChIP aus dem Gewebe wie Leber, Hoden oder Gehirn4,5,6erfolgreich durchgeführt. Im Falle der Skelettmuskulatur ist Störung der physisch resistent Gewebe, die einen hohen Gehalt an Strukturproteinen und Isolation von seinen Kernen Exponate besonders anspruchsvoll. Angesichts dieser Besonderheit, geben Protokolle, optimiert für andere Gewebe nicht zufriedenstellende Ergebnisse für skelettartigen Muskeln.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur ChIP-Grade Chromatin von Maus Skelettmuskelgewebe zu isolieren, die physisch stören das Gewebe, Formaldehyd Fixierung und die Isolation der Kerne und Beschallung beinhaltet. Die Effizienz dieser Methode Chromatin geeignet für ChIP aus diesem Gewebe vorzubereiten zeigte sich durch ChIP-qPCR und ChIP-Seq für verschiedene Transkriptionsfaktoren, RNA-Polymerase II und kovalente Histon-Modifikationen-7.
Diese neue Technik ist wesentlich schneller als ein zuvor gemeldeten Protokoll8 bestehend aus lange Kollagenase Verdauung Schritte während dieser Zeit, Änderungen bei genomischen Lokalisierung von Transkriptionsfaktoren und Veränderungen in der Genexpression erfolgen können. Die Schnelligkeit, mit der die Kerne isoliert und fixiert sind, macht die hier beschriebene Methode besonders attraktiv, Chromatin vorzubereiten, die mehr treu den nativen genomische Belegung Zustand erfasst. Außerdem, obwohl andere Methoden für Chromatin Isolierung oder Protein-Extraktion aus Muskelgewebe haben beschrieben8,9,10 und verwendet wurden für ChIP-qPCR Experimente auf ausgewählte Gene, kein ChIP-seq Daten wurde über sie berichtet. Die Methode hier berichtet eignet sich für Transkription Faktor und Histon Modifikation ChIP-Seq, und daher sollte auch für 3 / 4C oder HiC Chromatin Konformation Erfassung Anwendungen geeignet.
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Protocol
Mäuse gehalten wurden, im Einklang mit den institutionellen Richtlinien zur Pflege und Verwendung von Labortieren und nationale Tier-Pflege-Richtlinien (Europäische Kommission Richtlinie 86/609/EWG; Französischen Dekret Nr. 87-848). Alle Verfahren wurden von der französischen nationalen Ethikkommission genehmigt.
1. Isolation von Muskelgewebe
- Opfer eines Erwachsenen 6 bis 8 Wochen altes Baby Maus durch zervikale Dislokation. Sterlise der Extremität durch Spülen mit 70 % Ethanol und sezieren die hinteren Gliedmaßen Muskeln (Gastrocnemius, m. Tibialis Anterior, Quadrizeps) mit feinen Spitze Schere und Zange.
Hinweis: Sollte eine Maus etwa 500 mg des Gewebes ergeben. - Hackfleisch die Muskeln in einem 2 mL Reagenzglas mit 1 mL eiskaltes hypotone Puffer, um eine homogene Zubereitung von kleinen (< ca. 2-3 mm 3) Stücke mit feinen Schere und verlassen das Rohr schütteln auf einer Bank Top Rührwerk bei 4 ° C für ca. 5-10 min.
2. Gewebe-Lyse
Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.
- Das Homogenat in einem 14 mL Rundboden Röhrchen zu übertragen und in 5 mL kalte hypotone Puffer (EDTA-freie Protease-Inhibitor cocktail und PMSF) Aufschwemmen.
- Homogenise das Hackfleisch / Muskelgewebe mit einer lockeren Dounce (20-30 Schläge innerhalb von 3 Minuten) oder eine mechanische Gewebe-Homogenisator für 15-30 s in 14 mL Rundboden Röhrchen.
Hinweis: Die Effizienz der Lyse in diesem Stadium durch Lichtmikroskopie beurteilt werden kann und bei Bedarf zusätzliche Störungen durchgeführt werden kann.
- Homogenise das Hackfleisch / Muskelgewebe mit einer lockeren Dounce (20-30 Schläge innerhalb von 3 Minuten) oder eine mechanische Gewebe-Homogenisator für 15-30 s in 14 mL Rundboden Röhrchen.
- Das Homogenat in 15 mL-Tuben und Lautstärke auf 10 mL mit kalten hypotone Puffer zu füllen. Das Homogenat zu beheben, wie unten beschrieben, bevor Sie mit der nächsten Maus.
3. Befestigung
- 1 % Endkonzentration Formaldehyd hinzu und schütteln Sie für 10 min bei Raumtemperatur.
- In jedem Röhrchen, Fixierung und schütteln für 5-10 min bei Raumtemperatur zu stoppen eine Endkonzentration von 0,125 M Glycin hinzufügen.
4. Kerne Vorbereitung
Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.
- Homogenise die feste lysate mit einem losen Dounce (5-10 Schläge).
- Übertragung eine 15 mL Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C, Kerne und Zelltrümmer zu erhalten.
- Den Überstand zu entfernen und das Pellet in frischen 5 mL Hypotonische Puffer aufzuwirbeln. Filtern der lysate durch ein Sieb 70 µm Zelle in ein 50 mL-Tube. Filtern Sie erneut das Filtrat durch ein Sieb 40 µm Zelle.
- Transfer das Filtrat eine 15 mL Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 Minuten bei 4 ° C, das nukleare Pellet zu erhalten.
Hinweis: In diesem Stadium die Kerne können sofort beschallt oder fangen, als eine trockene Pellets in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 gelagert ° C.
5. Ultraschall
- das Volumen des nuklearen Geschosses (rund 50 µL für Maschinen- und Dounce Homogenisierung) zu bewerten und in Beschallung Puffer bis zu 3 bis 4 Mal von nuklearen Packvolumen Aufschwemmen und beschallen für 10-15 min bei 4 ° C mit einem Sonikator .
Hinweis: Das Chromatin kann sofort analysiert, wie unten (6) beschrieben oder eingefroren und bei-80 ° c
6. Beurteilung der Chromatin-Fragmentgröße nach Beschallung
Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.
- , De-Crosslink, 30 µL des Chromatins im Reagenzglas 1,5 mL und fügen 20 µL 5 M NaCl. Füllen Sie das Volume 500 µL und über Nacht bei 65 ° C inkubieren.
- Am nächsten Tag, führen Sie eine Behandlung mit 1 µL Proteinase K (20 mg/mL Brühe), 10 µL 2 M Tris pH 6,8 und 10 µL 0,5 M EDTA für 1 h bei 42 ° c führen eine Phenol-Chloroform/Chloroform Extraktion und überstürzen sich die DNA mit 1 Volumen von Natrium-acetat e (3 M) und 2 Bände von 100 % Ethanol für 1 h bei-80 ° C oder über Nacht bei-20 ° c
- Pellet-DNA durch Zentrifugation bei 13.500 x g für 15 min. Dekantieren des Überstandes, waschen das Pellet gründlich mit kaltem 70 % igem Ethanol und Zentrifuge wieder für 5 min. Dekantieren des Überstandes und an der Luft trocknen die Pellet.
- Aufschwemmen der Pellets in das ursprüngliche Volume (30 µL) von TE-Puffer. Die DNA-Konzentration in einem Spektralphotometer durch Absorption bei 260 nm/280 nm zu messen. Pipette 500-1.000 ng DNA zusammen mit einem DNA-Größe Leiter auf getrennten Bahnen eine 1,5 % Agarose-Gel und Elektrophorese zur Beurteilung der Fragmentgröße des Chromatins führen.
Hinweis: Fragmentgröße sollte zwischen 200-500 Basenpaaren, und es darf keine nachweisbaren hochmolekularen Fragmente entspricht, nicht oder schlecht-fragmentierten DNA. Bei Bedarf kann die Chromatin-Lösung (Schritt 5) wieder für eine längere Zeit beschallt und analysiert dann erneut wie oben beschrieben, bis die optimale Größe erreicht ist.
7. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)
Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.
- Block Eiweiß G Sepharose Perlen durch Aliquotierung 1 mL 50 % Gülle in Ethanol. Pellets die Perlen durch Zentrifugation bei 400 X g für 1 min in einem Benchtop Zentrifugieren und waschen mit 1 mL TE-Puffer-Zentrifuge bei 400 X g und wiederholen Sie die Wash
- , Nachdem der zweite Zentrifugation, neu in 1 mL der ChIP Verdünnungspuffer mit 25 µL der BSA (Lager 20 mg/mL) und 20 µL tRNA (Lager 10 mg/mL Hefe). Blockieren Sie die Perlen für mindestens 2 Stunden vor der Verwendung durch Rotation (40-60 u/min) bei 4 ° c
- Verdünnen 50 µg des Chromatins (Schritt 5) 8 bis 10 Mal mit ChIP Verdünnungspuffer. Fügen Sie 50 µL blockierte Wulst Gülle und inkubieren 2 h drehen (40-60 u/min) bei 4 ° C. Zentrifuge bei 400 X g bei 4 ° C zu erhalten bereits geräumten Chromatin und überträgt es auf ein frisches Tubus.
- Für Immunopräzipitation, fügen Sie die entsprechende Menge an primären Antikörper (z. B. 1-2 µg pro 10 µg von Chromatin) und inkubieren Sie über Nacht mit Rotation bei 4 ° c
Hinweis: Die optimale Menge des Antikörpers kann vom Lieferanten empfohlen werden oder kann durch ChIP-qPCR mit unterschiedlichen Mengen von Antikörpern durchführen, bis optimale Bereicherung beobachtet wird empirisch ermittelt werden. Auch Eiweiß G Sepharose durch Protein A Sepharose je nach Subtyp des Antikörpers verwendet ersetzt werden kann. - Fügen Sie die gesperrten Perlen am nächsten Tag und inkubieren Sie für 1 h mit Drehung (40-60 u/min) bei 4 ° C. Zentrifuge bei 400 X g für 20-30 s pellet-die Perlen, überstand zu entfernen, und starten den ChIP wäscht.
- ChIP Wäschen: führen Sie die folgenden Waschungen mit dem Puffer: einmal mit niedrig-Salz-Puffer, und dann zweimal mit hohen Salz Puffer, zweimal mit LiCl Puffer, und schließlich zweimal mit TE-Puffer.
- Jedem Waschgang für 10 min mit Drehung (40-60 u/min) bei 4 ° C durchführen und die Perlen zwischen jedem Waschgang durch Zentrifugation bei 400 X g für 20-30 s in einer Zentrifuge Benchtop-pellet.
- Für Elution, entfernen die letzten Wäsche und die Perlen in 250 µL Elution Buffer (frisch zubereitet) für 15 min bei Raumtemperatur unter Schütteln Aufschwemmen.
- Zentrifuge bei 400 x g und sammeln das Eluat in einem frischen Rohr. Führen Sie diesen Schritt zweimal und dann de-Crosslink das Eluat über Nacht mit 20 µL NaCl 5 M und 1 µL RNase A (10 mg/mL), Proteinase K und Phenol-Chloroform/Chloroform Extr behandelnhandeln wie in Schritt 6.
- In 50 µL TE-Puffer Aufschwemmen und Aliquote für ChIP-qPCR nach Standardprotokollen 15 um die Qualität des Chips.
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Representative Results
Um die Kerne zu isolieren, führten wir mechanische Homogenisierung des Muskelgewebes seziert und Hackfleisch für entweder 15 oder 45 s, bei 18.000 und 22.000 u/min (siehe Tabelle der Materialien). Unter allen Bedingungen Kerne aus den Trümmern Gewebe getrennt werden könnte, aber die Ausbeute war optimal mit der niedrigeren Drehzahl (Abbildung 1A-B). Kerne könnten auch durch Douncing für 3-5 min (Abbildung 1Aund Daten nicht gezeigt) vorbereitet werden, aber mechanische Homogenisierung ist die Methode der Wahl, wie optimale Erträge der Kerne in weniger als 15 erreicht werden können s, ermöglicht einen wichtigen Zeitgewinn, vor allem, wenn mehrere Proben müssen sein (Abbildung 1 b) verarbeitet. Mithilfe dieses Protokolls bis zu 2,7 x 10 absperrbar7 Kerne von 500 mg des Gewebes (entspricht 1 Maus Gewebe) 100 µg des Chromatins generieren.
Zur Optimierung der Chromatin-Fragmentierung von festen Kernen sonorisiert wir für 5 bis 20 Minuten. Unter den Einstellungen (siehe Tabelle der Materialien), ein 10 min Beschallung war optimal, Chromatin mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 250 zu generieren bp (Abbildung 2). Dieser Schritt sollte experimentell unter Berücksichtigung der Art der verwendeten Sonikator optimiert werden.
Zur Beurteilung der Qualität des Muskels Chromatins vorbereitet durch das oben beschriebene Protokoll wurden gegen Transkriptionsfaktoren, Histon Modifikation oder RNA-Polymerase II (Pol II) ChIP-qPCR und ChIP-Seq Experimente durchgeführt. ChIP-qPCR gegen den Glukokortikoid-Rezeptor (GR) in das Vorhandensein oder Fehlen von Dexamethason (Dex) Behandlung zeigte starke Dex-abhängige GR Bereicherung an regulatorischen Elemente der Redd1 und Murf1 Gene, die als bekannt sind Dex und GR in den Muskelfasern11, geregelt, während kein Signal an den Hoden spezifischen Prm1 Promotor verwendet als Negativkontrolle (Abbildung 3A) gesehen wurde.
ChIP-qPCR gegen acetyliert Lysin 27 von Histon H3 (H3K27ac), eine kovalente Modifikation finden Sie unter aktive Enhancer und Promotoren, zeigte starke Bereicherung bei der Desmin (Des)-Projektträger, der aktiv in Muskelfasern, im Vergleich zu einer negativen intergenetischer ist Kontrollfeld (Abb. 3 b). H3K27ac ChIP-Seq offenbart ein hohes Maß an dieser Marke in der Des Locus, typisch für ein "Super-Enhancer" geregelten Gewebe Identität gen12 (Abb. 4A). In ähnlicher Weise zeigte Pol II ChIP-Seq ein hohes Maß der Transkription Pol II an diesem Ort.
ChIP-qPCR für Transkriptionsfaktor Tead4, die eine wichtige Rolle in myogen Differenzierung13,7 spielt, offenbart seine Anreicherung auf zuvor beschriebenen Bindungsstellen an der Ccnd1 und Ifrd1 Gene ( Abbildung 3). Wichtig ist, wurde Anreicherung mit Chromatin vorbereitet von Mäusen wo war Tead4 in Muskelfasern selektiv inaktivierten gesenkt (Tead4Skm-/-)7 (Abbildung 3). Analysen von ChIP-Seq-Daten für Tead1 und Tead4 zeigten ihre Bindung zu einer Site in der Promoter des Gens Kdm5a mit Chromatin von Wildtyp Muskel, lag das Tead4 Signal, aber nicht den Tead1, H3K27ac oder Pol II verloren mit dem Chromatin aus Muskeln des Tead4Skm-/- Mäuse (Abbildung 4 b). Ebenso wird Tead1 und Tead4 Bindung an ein regulatorisches Element unterhalb des Adssl1 -Gens mit Chromatin von Wildtyp Muskel gesehen, während Tead4 Bindung selektiv verloren mit Chromatin von Tead4warSkm-/- Muskel () Abbildung 4). Diese Beobachtungen zeigen, dass das Tead4 Signal gesehen in den ChIP-Seq-Daten aus der Bindung in der Muskelfaser kam.
Um den Beitrag der anderen Zelltypen zugeordnet der Muskelfaser, die ChIP-Seq-Ergebnisse zu bestimmen, untersuchten wir die H3K27ac und Pol II Signale an das Vcam1 -gen, das in Muskelzellen Satelliten- und Pecam1, ein Marker für tätig ist Endothelzellen von Blutgefäßen, die die Muskeln zu bewässern. Im Vergleich zu dem hohen Niveau bei den Genen Des oder Adssl1 gesehen, das Niveau der H3K27ac und Pol II gesehen an die Vcam1 und Pecam1 Genen waren viel niedriger (Abb. 4A und Abbildung 4). Die großen Unterschiede im Signal für Muskelfaser ausgedrückt Gene im Vergleich zu denen in den damit verbundenen Geweben ausgedrückt darauf hingewiesen, dass das Signal gesehen in ChIP aus dem Chromatin vorbereitet, mit dem oben beschriebenen Protokoll überwiegend stammt aus binden von Ereignissen in der Muskelfaser.
Abbildung 1: Reinigung der Kerne von Erwachsenen Maus Muskel. (A) Gewebe Lysates erzielten mechanische Homogenisierung (18.000 u/min, 45 s) und Dounce Homogenisierung (30 Striche/3 min) waren fleckig mit Trypan blau und ein digitales Mikroskop beobachtet und die Bilder wurden aufgenommen bei 20 X Vergrößerung. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) Anzahl der Nukleonen gewonnenen 500 mg des Gewebes (Äquivalent von 1 Maus) nach der Zubereitung unter den angegebenen Bedingungen, 18.000 und 22.000 u/min für 15 und 45 s oder 3 min Douncing. Fehlerbalken darzustellen Mittelwert ± S.E.M für n = 3 Mäuse für mechanische Homogenisierung und n = 3 Mäuse für Douncing. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Überprüfung der Chromatin Fragmentgröße. Isolierte Kerne wurden für 5, 10, 15 oder 20 min beschallt, wie angegeben. Nach de-Vernetzung und Reinigung wurde die DNA Fragmentgröße von Agarose-Gelelektrophorese in Anwesenheit von Interkalation Bromid bewertet. M ist DNA Größe Marker. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Verwendung von Chromatin für ChIP-qPCR. (A) Mäuse Intra peritoneale Injektionen des Fahrzeugs oder Dexamethason (10 mg/kg) und nach 1,5 h ausgesetzt waren, Chromatin aus Hind Gliedmaßen Muskeln vorbereitet wurde. Die Anreicherung im ChIP bei GR Zielgene Redd1 und Murf1, im Vergleich zu der Negativkontrolle Protamin Projektträger (Prm1), wird ein % Input ausgefällt angegeben. (B) ChIP wurde für H3K27ac und IgG Antikörper der Kontrolle durchgeführt und analysiert die Desmin-Promotor und im Vergleich zu einer intergenetischer Negativkontrolle Region. (C) Tead4-ChIP wurde am Muskel Chromatin gewonnenen Wildtyp und Muskel-spezifische Tead4-Knockout-Mäusen durchgeführt (Tead4Skm-/-) und analysierten bei Tead4 Bindungsstellen in der Ccnd1 und Ifrd1 Promotoren, im Vergleich zu den Kontrolle intergenetischer Region. In allen versuchen Chromatin von 3 Mäuse wurde gebündelt und Fehlerbalken darzustellen Mittelwert ± S.E.M in ein Student T-Test für drei technische repliziert. P-Wert < 0.001* *, < 0,0001 ***; NS, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: genomische Profile der Muskelfaser Chromatin. (A) -Screenshots aus der University der California in Santa Cruz Genom Browser der angegebenen Loci illustrieren die viel höhere H3K27ac und Pol II Niveaus an die Desmin-gen, hoch in Muskelfaser, im Vergleich zu den Vcam1 und Pecam1 Gene in Satellitenzellen ausgedrückt und endothelial Zellen, beziehungsweise. (B) UCSC Screenshots von den angegebenen Loci illustrieren Bindung von Tead1 und Tead4, sowie H3K27ac und Pol-II in Chromatin vom Wildtyp (WT) Muskel im Vergleich dazu aus Tead4Skm-/- (MT) Muskel, wo selektiven Verlust der Tead4 Bindung ist beobachtet. Die ChIP-Seq-Daten dargestellt werden als GSE82193 in der GEO-Datenbank zur Verfügung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Puffer-Name | Zusammensetzung | ||
| Hypotone Puffer | 10 mM HEPES-KOH (pH 7,3) | ||
| 10 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0,1 % NP-40 | |||
| 0,1 mM PMSF (frisch hinzugefügt) | |||
| Protease-Inhibitor-Cocktail (Bild) 1 X (frisch hinzugefügt) | |||
| Beschallung-Puffer | 1 % SDS | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl pH 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 0,1 % Natrium Deoxycholate | |||
| 1 % Triton x-100 | |||
| 0,1 mM PMSF frisch hinzugefügt | |||
| Bild 1 X | |||
| ChIP-Verdünnungspuffer | 0,01 % SDS | ||
| 1,1 % Triton x-100 | |||
| 1,2 mM EDTA | |||
| 16,7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| 0,1 mM PMSF frisch hinzugefügt | |||
| Bild 1 X | |||
| Niedrig-Salz-Puffer | 0,1 % SDS | ||
| 1 % Triton x-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| Hohen Salz Puffer | 0,1 % SDS | ||
| 1 % Triton x-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl-Puffer | 250 mM LiCI | ||
| 1 % NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris HCl pH 8 | |||
| Elution buffer | 1 % SDS | ||
| 100 mM Nahco33 | |||
| Tris-EDTA (TE)-Puffer | 50 mM Tris HCl pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
Tabelle 1: Puffer Kompositionen.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll für die Zubereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskeln und zeigen, dass das Chromatin für ChIP Experimente geeignet ist, die Transkription Faktor Bindung und kovalente Histon-Modifikationen in den Muskelfaser-Kernen zu erkennen. Dieses Protokoll beinhaltet mehrere kritische Schritte. Die erste ist Gewebe Störungen, die durch Dounce oder durch mechanische Scherung erfolgen kann. Mechanische Scherung ist schneller und mehr reproduzierbar, und ist daher die Methode der Wahl. Dennoch, wenn keine geeigneten Geräte verfügbar ist, Störungen auch Douncing, erfolgt durch wo Bewertung der Effizienz der Lyse unter die Lupe genommen, bevor Sie fortfahren mit dem Fixierung Schritt empfohlen wird. Fixierung des gesamten Gewebes Lysates, anstatt Fixierung von isolierten Kernen, erlaubt mehr reproduzierbare Beschallung in kleineren Mengen und für kurze Dauer. Wir haben auch die Lysates nach Störungen zu beheben, anstatt das Gewebe vor Störungen zu beheben, wie von Thomas Et Al. beschrieben 10 Vorfixierung des Gewebes führte zu reduzierter Leistungsfähigkeit der Homogenisierung. Dieses Protokoll basiert auf mechanische Scherung ist auch schneller als andere Lösungsvorschläge, wie Kollagenase Verdauung, die längeren Inkubation des sezierten Gewebes bei 37 ° C8beinhalten. Während dieses Zeitraums können Veränderungen im gen Ausdruck und Transkription Faktor verbindlich auftreten. Die Kerne so schnell wie möglich beheben deshalb unbedingt mehr treu die normalen physiologische Zustand zu erfassen.
Ein zweiter wichtiger Schritt ist die Reinigung der Kerne aus den festen lysate. Hierzu sequentielle Filterung der festen lysate Lösung, zuerst durch ein 70 µm Zelle Sieb, die größere Trümmer zu beseitigen und dann durch ein 40 µm Zelle Sieb zu den feinen Schmutz vermeidet die Siebe verstopfen und maximiert die Erträge der Kerne erhalten. Sobald durch Filtration gereinigt, werden Zellkerne beschallt und die DNA-Fragmentgröße bestimmt nach de-Vernetzung. Eine typische Zubereitung aus zwei hinteren Gliedmaßen eine Maus ergibt 100 µg des Chromatins. Bündelung von Lysaten von bis zu 3 Mäuse kann den Ertrag verbessern durch die Reduzierung der Verluste während der Zubereitung. Dieses Verfahren ist effizient, da es die Wiederherstellung von bis zu 75 % der genomischen DNA als Chromatin (Daten nicht gezeigt ermöglicht).
ChIP-Experimente entwickelt, um die Transkription Faktor verbindlich beurteilen und epigenetische Modifikationen demonstriert die Eignung dieses Protokolls für das Studium der Genregulation in den Muskelfaser-Kernen. Starke und robuste ChIP-Seq-Signale für Pol II und H3K27ac wurden von Chromatin, zur Identifizierung der Muskelfaser Identität Gene durch ihren markanten H3K27ac und Pol II Profile7erzeugt. Die viel höhere Niveaus der H3K27ac und Pol II auf Gene stark in Faser Kernen, im Vergleich zu Gene in Satelliten- oder Endothelzellen, zeigte, dass das Signal überwiegend aus der Faser-Kernen kamen. Dies wurde auch bestätigt durch den Verlust des Tead4 ChIP-Signals mit Chromatin von Mäusen, wo es speziell bei den Muskelfasern inaktiviert. Allerdings schwächer, aber deutlich über dem Hintergrund Signale für Satelliten-Zell-Marker wie Vcam1, Pax7 (Daten nicht gezeigt) erkannt werden können zeigt das Chromatin aus diesen Zellen ist auch vorhanden. Wir erwarten, dass unser Protokoll für andere Techniken, mit denen Formaldehyd fixiert Chromatin wie 3 C/4 C und HiC Chromatin Konformation Erfassung Techniken geeignet sein sollte. Nutzung unseres Protokolls für die Kombination von ChIP-Seq für Transkriptionsfaktoren und Chromatin Modifikationen mit Chromatin Konformation Capture künftig ein detailliertes Verständnis des Gens ermöglichen sollte Regulationsmechanismen in Muskelfaser und wie diese geregelt werden kann oder durch physiologische Reize, wie Bewegung, Fasten, eine fettreiche Diät, Denervierung, gestört oder bei Krankheit, mithilfe von Chromatin hergestellt aus genetisch geändert Mäuse Krankheiten wie X-chromosomale zentronukleären Myopathie14zu reproduzieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen ermöglicht diese kostengünstige und zeitsparende Protokoll die Isolation der Muskelfaser-Kerne, die sofort beschallt oder bei-80 ° C für anderweitige Verwendung eingefroren werden können. Verwendung von Chromatin durch dieses Protokoll vorbereitet lieferte die erste große ChIP-Seq Genomdaten von Muskelfaser7 und erleichtert die zukünftige Studien zur Genregulation in diesem Gewebe.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei allen Mitarbeitern des IGBMC Hochdurchsatz-Sequenzierung Anlage, ein Mitglied des Konsortiums "Frankreich-Génomique" (ANR10-INBS-09-08) und alle IGBMC allgemeine Dienstleistungen insbesondere das Personal der IGBMC Tierhaltung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem CNRS, INSERM, AFM, der Ligue Nationale Contre le Cancer, die französische staatliche Fonds durch die ANR im Rahmen des Programms Investissements Avenir gekennzeichnet ANR-10-IDEX-0002-02, die Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 und die ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. S.J wurde unterstützt von der Ligue Nationale Contre le Cancer und die ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 und V.U durch das Ministère de nannte et De La Recherche. ID ist ein 'Équipe Labellisée' der Ligue Nationale Contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
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