Summary
Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.
Abstract
Descriviamo un protocollo efficiente e riproducibile per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico di topo adulto, un tessuto fisicamente resistente con un alto contenuto di proteine strutturali. Muscoli degli arti sezionati da topi adulti fisicamente sono interrotte da omogeneizzazione meccanica, o una combinazione di macinazione e douncing, in un buffer ipotonico prima della fissazione della formaldeide del lysate delle cellule. I nuclei fissi sono purificati da ulteriori cicli di omogeneizzazione meccanica o douncing e filtrazioni sequenziale per rimuovere i detriti cellulari. I nuclei purificati possono essere sonicati immediatamente o in una fase successiva dopo il congelamento. La cromatina può essere sonicata in modo efficiente ed è adatto per esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina, come illustrato dai profili ottenuto per fattori di trascrizione, la RNA polimerasi II e modificazioni istoniche covalente. L'associazione di eventi rilevati utilizzando la cromatina preparata dal presente protocollo è principalmente quelli che si svolgono nei nuclei della fibra di muscolo nonostante la presenza di cromatina da altro satellite fibra-collegato e cellule endoteliali. Questo protocollo è pertanto adattato per studiare la regolazione genica in muscolo scheletrico del topo adulto.
Introduction
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e sequenziamento ad alta (ChIP-seq) sono diventati i metodi di scelta per lo studio di trascrizione e regolazione epigenetica dell'espressione genica in vari tessuti e tipi di cellule1. Questa tecnica permette di genoma profilatura di modificazioni covalenti della cromatina, occupazione variante dell'istone e fattore di trascrizione associazione2,3.
Mentre l'esecuzione di ChIP da cellule coltivate è ben consolidata, ChIP da tessuti di mammiferi rimane più impegnativo. Preparazione della cromatina per ChIP prevede diversi passaggi critici che devono essere ottimizzate per ogni tipo di tessuti e cellule. Cromatina può essere preparata da lisati cellulari delle cellule coltivate o seguente purificazione dei loro nuclei. Nel caso di tessuti di mammiferi, efficiente Lisi, fissazione di formaldeide e purificazione dei nuclei sono fondamentali al fine di garantire un recupero ottimale della cromatina. Inoltre, la scelta se risolvere i nuclei prima o dopo la loro purificazione deve essere determinato sperimentalmente. Nonostante questi ostacoli, il ChIP è stato eseguito con successo da tessuti quali fegato, testicolo o cervello4,5,6. Nel caso del muscolo scheletrico, la rottura di un tessuto resistente fisicamente, che esibisce un alto contenuto di proteine strutturali e l'isolamento dei suoi nuclei è particolarmente impegnativa. Data questa specificità, protocolli ottimizzati per altri tessuti non danno risultati soddisfacenti per i muscoli scheletrici.
Qui descriviamo un protocollo per isolare la cromatina ChIP-grado da tessuto muscolare scheletrico del mouse che coinvolge fisicamente interrompendo il tessuto, fissazione di formaldeide e quindi l'isolamento dei nuclei e sonicazione. L'efficienza di questo metodo per preparare cromatina adatta per ChIP da questo tessuto è stato dimostrato eseguendo ChIP-qPCR e ChIP-seq per vari fattori di trascrizione, RNA polimerasi II e istone covalente modifiche7.
Questa nuova tecnica è molto più veloce di un protocollo precedentemente segnalati8 composto da lunghi passaggi di digestione della collagenosi durante i quali, cambiamenti nella localizzazione genomica dei fattori di trascrizione e le alterazioni nell'espressione genica possono aver luogo. La rapidità con cui i nuclei sono isolati e fissa rende particolarmente attraente per preparare della cromatina che cattura più fedelmente lo stato nativo occupazione genomico il metodo qui descritto. Inoltre, anche se hanno altri metodi per l'estrazione di isolamento o proteine della cromatina da tessuto muscolare sono stato descritto8,9,10 e utilizzato per esperimenti di ChIP-qPCR su geni selezionati, nessun ChIP-seq dati sono stati segnalati li utilizzano. Il metodo segnalato qui è adatto per la modifica di fattore e istone trascrizione ChIP-seq e quindi dovrebbe anche essere adatto per 3 / 4C o applicazioni di acquisizione di HiC cromatina conformazione.
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Protocol
topi sono stati mantenuti in conformità con le linee guida istituzionali per quanto riguarda la cura e l'uso degli animali da laboratorio e conformemente alle linee guida nazionali di cura degli animali (Commissione europea direttiva 86/609/CEE; Decreto francese n. 87-848). Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico nazionale francese.
1. isolamento del tessuto muscolare
- sacrificio un adulto 6 a 8-settimana-vecchio mouse da dislocazione cervicale. Sterlise l'arto sciacquandolo con etanolo al 70% e sezionare i muscoli dell'arto (Gastrocnemius, Tibialis Anterior, quadricipiti) utilizzando forbici punta fine e forcipe.
Nota: Un mouse dovrebbe produrre circa 500 mg di tessuto. - Tritare i muscoli in una provetta da 2 mL contenente 1 mL di tampone ipotonico ghiacciata ad una preparazione omogenea di piccoli (< 2-3 mm 3) pezzi utilizzando bene le forbici e lasciare il tubo agitazione su un agitatore di panca superiore a 4 ° C per 5-10 min
2. Lisi del tessuto
Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
- Trasferire l'omogeneizzato in una provetta di turno-fondo 14 mL e risospendere in 5 mL di tampone ipotonico freddo (inibitore della proteasi EDTA-free cocktail e PMSF).
- Homogenise tessuto muscolare macinate utilizzando un lisata sciolto (20-30 colpi entro 3 min) o un omogeneizzatore meccanica del tessuto per 15-30 s in tubi di turno-fondo 14 mL.
Nota: L'efficienza di lisi può essere valutato in questa fase da microscopia chiara, e se necessario, possono essere eseguite ulteriori disagi.
- Homogenise tessuto muscolare macinate utilizzando un lisata sciolto (20-30 colpi entro 3 min) o un omogeneizzatore meccanica del tessuto per 15-30 s in tubi di turno-fondo 14 mL.
- Trasferire l'omogeneizzato per provette da 15 mL e riempire il volume a 10 mL utilizzando buffer ipotonico freddo. Difficoltà l'omogeneizzato come descritto di seguito prima di procedere con il prossima mouse.
3. Fissazione
- aggiungere formaldeide all'1% di concentrazione finale e agitare per 10 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M in ogni tubo per fermare la fissazione e agitare per 5-10 min a temperatura ambiente.
4. Preparazione di nuclei
Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
- Homogenise la fissa lisato utilizzando un lisata sciolto (5-10 colpi).
- Trasferimento a un tubo da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C per ottenere nuclei e detriti cellulari.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in fresco 5 mL di tampone ipotonico. Filtrare il lisato attraverso un colino di cella di 70 µm in una provetta da 50 mL. Filtrare nuovamente il filtrato attraverso un colino di cella di 40 µm.
- Trasferire il filtrato in una provetta da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 ° C per ottenere la pallina nucleare.
Nota: In questa fase, i nuclei possono essere immediatamente sonicati o snap congelato come un pellet asciutto in azoto liquido e conservato a -80 ° C.
5. Sonicazione
- valutare il volume del pellet nucleare (circa 50 µ l per meccanici e lisata omogeneizzazione) e risospendere esso in tampone di sonicazione fino a 3 o 4 volte di volume nucleare ricco e trattare con ultrasuoni per 10-15 min a 4 ° C, utilizzando un sonicatore .
Nota: La cromatina può essere analizzata immediatamente come descritto di seguito (6) o congelata e conservata a -80 ° C.
6. Valutare la dimensione del frammento di cromatina dopo sonicazione
Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
- a de-reticolare, prendere 30 µ l di cromatina in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 20 µ l 5m NaCl. Completano il volume a 500 µ l e incubare a 65 ° C durante la notte.
- Il giorno successivo, eseguire un trattamento con proteinasi K di 1 µ l (20 mg/mL di brodo), 10 µ l 2 M Tris pH 6,8 e 10 µ l di EDTA 0.5 M per 1 h a estrazione di eseguire un fenolo-cloroformio/cloroformio 42 ° C. e precipitare il DNA con 1 volume di sodio acetato e (3 M) e 2 volumi di etanolo al 100% per una h a-80 ° C, o a -20 ° C.
- Pellet il DNA mediante centrifugazione a 13.500 x g per 15 min. decantare il supernatante e lavare la pallina accuratamente con etanolo 70% freddo e centrifugare nuovamente per 5 min, decantare il supernatante e asciugare all'aria il pellet.
- Risospendere il pellet in volume originale (30 µ l) di buffer di TE. Misurare la concentrazione di DNA allo spettrofotometro di assorbanza a 260 nm/280 nm. Pipettare 500-1.000 ng di DNA con una scaletta di formato di DNA su corsie separate di un gel di agarosio 1.5% ed eseguire l'elettroforesi per valutare la dimensione del frammento della cromatina.
Nota: Dimensione del frammento deve essere compresa tra 200-500 paia di basi e non ci dovrebbe essere nessun frammento rilevabile ad alto peso molecolare corrispondente a non o mal-frammentato DNA. Se necessario, la soluzione della cromatina (passo 5) può essere ri-sonicata per un tempo più lungo e quindi analizzata nuovamente come descritto sopra, fino ad ottenuta la dimensione ottimale.
7. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)
Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
- Perle di sepharose blocco della proteina G di aliquotare 1 mL del liquame 50% in etanolo. Pellet i branelli mediante centrifugazione a 400 x g per 1 min in un benchtop centrifugare e lavare con 1 mL di TE buffer centrifuga a 400 x g e ripetere il wash.
- Dopo la seconda centrifugazione, risospendere in 1 mL di tampone di diluizione di ChIP con 25 µ l di BSA (stock 20 mg/mL) e 20 µ l lievito tRNA (stock 10 mg/mL). Bloccare le perline per almeno 2 h prima dell'uso di rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C.
- Diluire 50 µ g di cromatina (passo 5) 8-10 volte con tampone di diluizione dei ChIP. Aggiungere 50 µ l di liquami tallone bloccato e incubare per 2 h rotante (40-60 rpm) a 4 ° C. centrifuga a 400 x g a 4 ° C per ottenere pre-sgomberata cromatina e trasferirlo in una nuova provetta.
- Per immunoprecipitazione, aggiungere la quantità appropriata di anticorpo primario (ad es., 1-2 µ g / 10 µ g di cromatina) e incubare per una notte con rotazione a 4 ° C.
Nota: La quantità ottimale di anticorpo può essere raccomandata dal fornitore o può essere determinata empiricamente eseguendo ChIP-qPCR con diverse quantità di anticorpo fino ad arricchimento ottima è osservare. Anche proteine G sepharose può essere sostituita da proteina A sepharose a seconda del sottotipo di anticorpo usato. - Aggiungere le perline bloccate il giorno successivo e incubare per 1 h con rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C. centrifuga a 400 x g per 20-30 s a pellet le perline, rimuovere il supernatante e avviare il ChIP lava.
- ChIP lavaggi: eseguire i seguenti lavaggi con i buffer: una volta con tampone salino di basso e poi due volte con tampone salino elevato, due volte con tampone di LiCl e infine due volte con il tampone TE.
- Eseguire ogni lavaggio per 10 min con rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C e pellet le perline tra ogni lavaggio mediante centrifugazione a 400 x g per 20-30 secondi in una centrifuga da banco.
- Per eluizione, rimuovere l'ultimo lavaggio e risospendere le perle in 250 µ l di tampone di eluizione (preparata) per 15 min a temperatura ambiente agitando.
- Centrifuga a 400 x g e raccogliere l'eluato in una nuova provetta. Eseguire questo passaggio due volte e quindi de-crosslink l'eluato durante la notte con 20 µ l NaCl 5 M e 1 µ l della RNasi A (10 mg/mL), trattare con proteinasi K e cloroformio/del fenolo-cloroformio extragire come nel passaggio 6.
- Risospendere in 50 µ l di buffer di TE e utilizzare le aliquote per ChIP-qPCR secondo protocolli standard 15 per controllare la qualità del ChIP.
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Representative Results
Per isolare i nuclei, abbiamo effettuato omogeneizzazione meccanica del tessuto del muscolo dissecato e macinate per s o 15 o 45, a 18.000 e 22.000 giri/min (Vedi Tabella materiali). In tutte le condizioni, i nuclei hanno potevano essere separati dai detriti dei tessuti, ma la resa è stata ottima usando la velocità più bassa (Figura 1A-B). I nuclei potrebbero anche essere preparati da douncing per 3-5 min (Figura 1Ae dati non indicati), ma l'omogeneizzazione meccanica è il metodo di scelta, come rendimenti ottimali dei nuclei possono essere raggiunto in appena 15 s, permettendo un importante guadagno di tempo, soprattutto se campioni multipli devono essere elaborate (Figura 1B). Usando questo protocollo, fino a 2,7 x 107 nuclei da 500 mg di tessuto (equivalente al tessuto del 1 mouse) possono essere isolati per generare 100 µ g di cromatina.
Per ottimizzare la frammentazione della cromatina dai nuclei fissi, abbiamo sonicato per 5 a 20 min. Sotto le impostazioni (Vedi Tabella materiali), un 10 min sonicazione era ottimo per generare della cromatina con una dimensione media frammento di 250 bp (Figura 2). Questo passaggio dovrebbe essere ottimizzato sperimentalmente tenendo conto del tipo di sonicatore utilizzato.
Per valutare la qualità della cromatina muscolo preparata dal protocollo sopra descritto, sono stati effettuati esperimenti ChIP-qPCR e ChIP-seq contro fattori di trascrizione, una modifica dell'istone o dalla RNA polimerasi II (Pol II). ChIP-qPCR contro il recettore dei glucocorticoidi (GR) in presenza o in assenza di trattamento di desametasone (Dex) ha rivelato la forte arricchimento di Dex-dipendente GR a elementi regolatori dei geni Redd1 e Murf1 che sono noti per essere Dex e GR regolata in fibre muscolari11, mentre nessun segnale è stato visto al promotore Prm1 testicolo specifico utilizzato come controllo negativo (Figura 3A).
ChIP-qPCR contro acetilato lisina 27 dell'istone H3 (H3K27ac), una modificazione covalente trovato presso esaltatori di attivi e promotori, ha mostrati forte arricchimento al promotore Desmin (Des) che è attivo nelle fibre muscolari, rispetto ad un negativo intergenico regione di controllo (Figura 3B). H3K27ac ChIP-seq ha rivelato un alto livello di questo marchio in tutto il locus Des , tipico di un tessuto regolamentato 'super-enhancer' identità gene12 (Figura 4A). Similmente, Pol II ChIP-seq ha mostrato alti livelli di trascrizione Pol II a questo luogo.
ChIP-qPCR per il fattore di trascrizione Tead4, che svolge un ruolo importante nel differenziamento miogenico13,7, ha rivelato il suo arricchimento su siti di legame descritto in precedenza presso la Ccnd1 e Ifrd1 geni ( Figura 3). D'importanza, arricchimento è stato ridotto utilizzando la cromatina preparata da topi dove Tead4 era selettivamente inattivato nelle fibre muscolari (Tead4skm-/-)7 (Figura 3). Analisi dei dati di ChIP-seq per Tead1 e Tead4 hanno mostrato loro associazione a un sito nel promotore del gene di Kdm5a utilizzando la cromatina dal selvaggio-tipo muscolo, mentre il segnale di Tead4, ma non quello di Tead1, H3K27ac o Pol II, è stato perso utilizzando la cromatina da muscoli di Tead4skm-/- topi (Figura 4B). Allo stesso modo, Tead1 e Tead4 associazione a un elemento regolatore a valle del gene Adssl1 è visto con cromatina dal selvaggio-tipo muscolo, mentre Tead4 associazione perse in modo selettivo utilizzando la cromatina da Tead4skm-/- (del muscolo Figura 4). Queste osservazioni dimostrano che il segnale di Tead4 visto nei dati ChIP-seq è venuto dall'associazione nella fibra muscolare.
Per determinare il contributo di altri tipi di cellulari associati con la fibra del muscolo per i risultati di ChIP-seq, abbiamo valutato i segnali H3K27ac e Pol II al gene Vcam1 che è attivo in cellule satelliti muscolari e Pecam1, un indicatore di cellule endoteliali dei vasi sanguigni che irrigano i muscoli. Rispetto ai livelli elevati visti presso i geni Des o Adssl1 , i livelli di H3K27ac e Pol II visto il Vcam1 e Pecam1 geni erano molto più bassi (Figura 4A e Figura 4). Le grandi differenze di segnale per fibra muscolare espressa geni rispetto a quelle espresse in tessuti associati indicato che il segnale visto nel ChIP dalla cromatina preparata utilizzando il protocollo sopra descritto viene principalmente dall'associazione eventi nella fibra muscolare.
Figura 1: purificazione dei nuclei dal muscolo di topo adulto. (A) tessuto lisati ottenuti da omogeneizzazione meccanica (18.000 giri/min, 45 s) e omogeneizzazione lisata (30 colpi/3 min) erano macchiate con trypan blue e osservato sotto un microscopio digitale e immagini sono state catturate a 20 ingrandimenti. Barra della scala = 100 µm. (B) numero di nuclei ottenuti da 500 mg di tessuto (equivalente di 1 mouse) dopo la preparazione sotto condizioni specificate, 18.000 e 22.000 giri/min per 15 e 45 s o 3 min di douncing. Barre di errore rappresentano la media ± s.e.m. per n = 3 topi per omogeneizzazione meccanica e n = 3 topi per douncing. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: verifica della dimensione del frammento di cromatina. Nuclei isolati sono stati sonicati per 5, 10, 15 o 20 min come indicato. Dopo de-reticolazione e purificazione, la dimensione del frammento di DNA è stata valutata tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi in presenza di bromuro di etidio. M è il marcatore di DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: uso della cromatina per ChIP-qPCR. (A) topi sono stati sottoposti a iniezioni intra-peritoneale di veicolo o desametasone (10 mg/kg) e dopo 1,5 h, cromatina è stata preparata dai muscoli dell'arto. L'arricchimento in ChIP a geni bersaglio GR Redd1 e Murf1, rispetto al promotore di protamina di controllo negativo (Prm1), è indicata come una % di input precipitato. (B) ChIP era eseguita per H3K27ac e IgG anticorpi di controllo e analizzati presso il promotore di desmina e rispetto ad una regione intergenica controllo negativo. (C) Tead4 ChIP è stato effettuato sulla cromatina muscolo ottenuta da wild type e topi knockout di muscolo-specific Tead4 (Tead4skm-/-) e analizzati presso siti di legame di Tead4 nei promotori Ccnd1 e Ifrd1 , rispetto alla regione intergenica di controllo. In tutti gli esperimenti, cromatina da 3 topi era riunita e barre di errore rappresentano la media ± Sangiorgi in un test di Student T-per tre replicati tecnici. Valore P < 0.001* *, < 0,0001 * * *; NS, non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: profili genomici della fibra muscolare cromatina. (A) Screenshots dall'University della California a Santa Cruz browser di genoma dei loci indicati che illustra i livelli molto più alti H3K27ac e Pol II al gene di Desmin, altamente espresso in fibra del muscolo, rispetto ai geni Vcam1 e Pecam1 espressi in cellule satelliti e endothelial cellule, rispettivamente. (B) UCSC screenshots dei loci indicati che illustrano associazione di Tead1 e Tead4, così come H3K27ac e Pol II, nella cromatina da wild type (WT) muscolare rispetto a quello da Tead4skm-/- muscolare (MT), dove si trova la perdita selettiva di Tead4 associazione osservato. I dati di ChIP-seq illustrati sono disponibili come GSE82193 nel database GEO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del buffer | Composizione | ||
| Buffer ipotonico | 10 mM HEPES-KOH (pH 7,3) | ||
| 10 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0,1% NP-40 | |||
| 0,1 mM PMSF (appena aggiunto) | |||
| Cocktail di inibitore della proteasi (PIC) 1 x (appena aggiunto) | |||
| Tampone di sonicazione | 1% SDS | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl a pH 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 0.1% sodio desossicolato | |||
| 1% Triton X-100 | |||
| Appena aggiunto 0,1 mM PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| Tampone di diluizione di chIP | 0,01% SDS | ||
| 1.1% Triton X-100 | |||
| 1.2 mM EDTA | |||
| 16,7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| Appena aggiunto 0,1 mM PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| Tampone basso salino | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| Alta tampone salino | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl Buffer | 250 mM LiCl | ||
| 1% NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8 | |||
| Tampone di eluizione | 1% SDS | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| Tampone Tris-EDTA (TE) | 50 mM Tris-HCl pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
Tabella 1: Le composizioni di Buffer.
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Discussion
Qui descriviamo un romanzo protocollo per la preparazione della cromatina da muscoli scheletrici topo adulto e dimostrano che la cromatina è adatta per gli esperimenti di ChIP che rilevano associazione di fattore di trascrizione e modificazioni istoniche covalente nei nuclei della fibra di muscolo. Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la rottura del tessuto che possa essere eseguita mediante lisata o tosatura meccanica. Cesoia meccanica è più veloce e più riproducibile e pertanto è il metodo di scelta. Tuttavia, se nessun apparato adatto è disponibile, rottura può essere eseguita anche da douncing, dove si raccomanda la valutazione dell'efficienza di Lisi sotto il microscopio prima di procedere con il passaggio di fissazione. Fissazione dell'intero tessuto lisati, piuttosto che la fissazione di nuclei isolati, ammessi più riproducibili sonicazione in volumi più piccoli e per brevi durate. Abbiamo scelto anche per correggere i lisati dopo rottura piuttosto che fissare il tessuto prima di rottura, come descritto da Thomas et al. 10 pre-fissaggio del tessuto provocato da ridotta efficienza di omogeneizzazione. Questo protocollo si basa sulla tosatura meccanica è anche più veloce di altre soluzioni proposte, come la digestione della collagenosi, che coinvolgono l'incubazione prolungata del tessuto dissecato a 37 ° C8. Durante questo periodo, possono verificarsi modifiche in associazione di fattore di trascrizione e di espressione genica. I nuclei di fissaggio più velocemente possibile è quindi essenziale per acquisire più fedelmente il normale stato fisiologico.
Un secondo passo fondamentale è la purificazione dei nuclei da fisso lisati. Per questo, sequenziale di filtraggio della soluzione lisata fissa, prima attraverso un colino di cella 70 µm per eliminare i detriti più grandi e quindi attraverso un colino di cella di 40 µm per rimuovere i detriti fini, evita l'intasamento del colini e massimizza i rendimenti dei nuclei ottenuti. Una volta purificata per filtrazione, i nuclei sono sonicati e la dimensione del frammento di DNA determinato dopo de-reticolazione. Una preparazione tipica da due arti posteriori di un mouse rende il µ g 100 di cromatina. I lisati da fino a 3 topi il pool può migliorare il rendimento riducendo le perdite durante la preparazione. Questa procedura è efficace in quanto permette il recupero fino al 75% del DNA genomic come cromatina (dati non mostrati).
Esperimenti di chIP progettato per valutare il legame del fattore di trascrizione e modificazioni epigenetiche ha dimostrato l'idoneità di questo protocollo per lo studio della regolazione genica nei nuclei della fibra di muscolo. Segnali di ChIP-seq forti e robusti per Pol II e H3K27ac sono stati generati da cromatina, che consenta l'identificazione della fibra muscolare geni di identità da loro distintivo profili H3K27ac e Pol II7. I livelli elevati molto di H3K27ac e Pol II su geni fortemente espressi nei nuclei di fibra, rispetto ai geni espressi in satellitare o dalle cellule endoteliali, ha mostrato che il segnale è venuto principalmente dai nuclei della fibra. Ciò è stato confermato anche dalla perdita di segnale Tead4 ChIP utilizzando la cromatina dai topi dove esso è stato inattivato in particolare nelle fibre muscolari. Tuttavia, più debole, ma chiaramente sopra segnali di fondo, per gli indicatori delle cellule satelliti quali Vcam1, Pax7 (dati non mostrati) possono essere rilevati risultati che cromatina da queste cellule è presente anche. Possiamo anticipare che il nostro protocollo dovrebbe essere adatto per altre tecniche che utilizzano formaldeide-fisso della cromatina come 3C/4C e tecniche di acquisizione di HiC cromatina conformazione. Utilizzo del nostro protocollo per la combinazione di che chip-seq per fattori di trascrizione e modificazioni della cromatina con acquisizione di conformazione della cromatina in futuro dovrebbe permettere una comprensione dettagliata del gene di meccanismi di regolazione della fibra di muscolo e come queste possono essere regolate o sconvolto da stimoli fisiologici, come esercizio, digiuno, una dieta grassa alta, denervazione, o nella malattia, utilizzando la cromatina preparata da geneticamente modificati topi riproducendo malattie come di miopatia centronucleare legata al X14.
In sintesi, questo protocollo di basso costo e rapido permette l'isolamento dei nuclei di fibra muscolare che può essere sonicato immediatamente o congelati a-80 ° C per ulteriore uso. Uso della cromatina preparata da questo protocollo ha fornito i primi dati del genoma vasto ChIP-seq da fibra muscolare7 e faciliterà gli studi futuri sulla regolazione genica in questo tessuto.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo tutto il personale della struttura di sequenziamento di IGBMC elevato throughput, un membro del Consorzio "Francia Génomique" (ANR10-INBS-09-08) e tutti i servizi generali di IGBMC in particolare il personale della struttura animale IGBMC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal CNRS, INSERM, l'AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, i francesi dichiarano fondo attraverso l'ANR nell'ambito del programma d'Avenir Investissements etichettati ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e il ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Santiago è stata sostenuta dal Ligue Nationale contre le Cancer, ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U dal Ministère de l'enseignement et de la Recherche. ID è un 'équipe labellisée' della Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
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