Summary
염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.
Abstract
우리는 성인 마우스 골격 근육, 구조 단백질의 높은 내용 가진 물리적으로 저항 조직에서에서 chromatin의 준비에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다. 성인 쥐에서 해 부 다리 근육은 육체적으로 기계 이동할 또는 닦지 세포 lysate의 포름알데히드 고정 하기 전에 당뇨 버퍼에 douncing의 조합에 의해 중단 됩니다. 고정된 핵 더 사이클 기계 이동할 또는 douncing 및 순차 filtrations 세포 파편을 제거 하 여 정화 됩니다. 순화 핵 동결 후 즉시 또는 나중에 무대에서 sonicated 수 수 있습니다. chromatin를 효율적으로 sonicated 수 있습니다 그리고는 프로필에서 볼 수 있듯이 chromatin immunoprecipitation 실험에 적합 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정에 대 한. 이 프로토콜에 의해 준비 하는 chromatin를 사용 하 여 검출 바인딩 이벤트는 주로 다른 섬유 관련 위성 및 내 피 세포에서 chromatin의 존재에도 불구 하 고 근육 섬유 핵에서 그. 이 프로토콜은 따라서 성인 쥐 골격 근육에 있는 유전자 규칙을 공부에 적응.
Introduction
Chromatin immunoprecipitation (칩) 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 결합 하 고 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq) 전사를 공부 하는 선택의 방법 및 다양 한 조직에서 유전자 발현의 후 성적인 규정 되 그리고 세포 유형1. 이 기술은 화학식 chromatin 수정, 히스톤 변형 인, 및 녹음 방송 요인 바인딩2,3의 프로 파일링 게놈 넓은 수 있습니다.
배양된 세포에서 칩을 수행 하는 것이 잘 설립 동안 포유류 조직에서 칩 더 도전 남아 있다. Chromatin 칩에 대 한 준비 하 고 모든 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 하는 데 필요한 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. Chromatin는 경작된 한 세포의 세포 lysates 또는 그들의 핵의 다음 정화에서 준비 될 수 있습니다. 포유류 직물의 경우 효율적인 세포, 포름알데히드 고정, 그리고 핵의 정화는 chromatin의 복구를 보장 하기 위해 중요 하다. 또한, 그들의 정화 전후 핵 해결을 선택 실험적으로 결정 될 수 있다. 이러한 장애물에도 불구 하 고 칩은 간, 고환, 또는 뇌4,,56같은 조직에서 성공적으로 수행 되었습니다. 골격 근육의 경우 같은 물리적으로 저항 조직, 구조 단백질의 높은 콘텐츠 및 그것의 핵의 절연 전시 중단은 특히 도전적 이다. 이 특이성을 감안할 때, 다른 조직에 대 한 최적화 된 프로토콜 주지 않는다 만족 스러운 결과 골격 근육에 대 한.
여기는 칩-학년 chromatin 물리적 조직, 포름알데히드 고정, 그리고 핵 및 쥡니다의 방해를 포함 하는 마우스 골격 근육 조직에서 분리 하는 프로토콜에 설명 합니다. 염색 질이이 조직에서 적합 한 칩에 대 한 준비를이 방법의 효율성은 다양 한 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정7칩 정량 및 칩 seq를 수행 하 여 시연 했다.
이 새로운 기술은 이전에 보고 된 프로토콜8 시간, 녹음 방송 요인의 게놈 현지화에 변화 하는 동안 오래 콜라 소화 단계를 구성 보다 훨씬 빠른 고 유전자 발현에 변경 자리를 차지할 수 있습니다. 핵은 분리 하 고 고정 속도 여기에 설명 된 메서드를 특히 매력적인 chromatin 네이티브 게놈 인 상태를 더 충실 하 게 준비 하 게 만듭니다. 또한, 비록 근육 조직에서 chromatin 격리 또는 단백질 추출에 대 한 다른 방법 설명된8,,910 되었고 선택 된 유전자, 아니 칩 seq에 칩 정량 실험을 위해 사용 그들을 사용 하 여 데이터 보고 되었습니다. 여기 보고 메서드는 전사 인자와 히스톤 수정 칩 seq에 적합 하 고 따라서 또한 적합 해야한다 3/4 C 또는 HiC chromatin 구조 캡처 응용 프로그램.
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Protocol
관리 및 실험 동물의 사용에 관한 기관 지침에 따라 그리고 국가 동물 관리 지침 (유럽 위원회 지시 86/609/CEE;에 따라 마우스 유지 했다 프랑스어 법령 no.87-848). 모든 절차는 프랑스 국가 윤리 위원회에 의해 승인 했다.
1. 절연의 근육 조직
경부 전위에 의해- 희생 한 성인 6 8 주 오래 된 마우스. Sterlise 70% 에탄올과 그것을 rinsing 하 여 사지 및 좋은 포인트가 위와 집게를 사용 하 여 뒷 다리 근육 (Gastrocnemius, Tibialis 앞쪽 허벅지 근육)를 해 부.
참고: 하나의 마우스 조직의 약 500 밀리 그램을 산출 해야 한다. - 소규모의 동질적인 준비 얼음 소형 버퍼의 1 mL를 포함 하는 2 mL 테스트 튜브에 있는 근육을 말하다 (< 2-3 m m 3) 조각을 사용 하 여가 위를 잘 하 고 5-10 분 4 ° C에서 벤치 가기 교 반기에 떨고 관 두고
2. 조직 세포
참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
- 14 mL 라운드-하단 튜브는 homogenate 전송 및 5 mL 차가운 소형 버퍼 (EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 PMSF)에서 resuspend.
- Homogenise 15-30의 라운드-하단 14 mL 튜브에 대 한 느슨한 dounce (20-30 선 3 분 이내) 또는 기계적 조직 균질 화기를 사용 하 여 다진된 근육 조직
- .
참고: 세포의 효율성, 가벼운 현미경에 의해이 단계에서 평가 될 수 있다 하 고, 필요한 경우 추가 중단을 수행할 수 있습니다.
3. 고정
- 1% 최종 농도에 포름알데히드를 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 흔들어.
- 고정 및 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 동요를 막으려고 각 관에서 0.125 M의 최종 농도에 글리신을 추가.
4. 핵 준비
참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
- 고정 lysate 사용 (5-10 스트로크) 느슨한 dounce Homogenise.
- 전송 15 mL 튜브와 4 ° C에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기를 핵 및 세포질 파편.
- 는 상쾌한을 제거 하 고 신선한 5 mL 소형 버퍼에 펠 릿을 resuspend. 필터링은 lysate 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 튜브에. 다시는 filtrate 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링.
- 핵 펠 렛을 얻기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 15 mL 튜브와 1000 x g에서 원심 분리기에는 filtrate 전송.
참고:이 단계에서 핵 수 있습니다 sonicated 즉시 수, 또는 건조 한 펠 릿으로 액체 질소에서 냉동 고-80에서 저장 된 스냅인 ° c.
5. 쥡니다
- 핵 펠 릿 (기계와 dounce 이동할 위한 50 µ L)의 볼륨을 평가 하 고 포장된 핵 볼륨의 4 번을 3까지 쥡니다 버퍼에 resuspend sonicate sonicator는을 사용 하 여 4 ° C에서 10-15 분 .
참고:는 염색 질 (6) 아래 설명 된 대로 즉시 분석 또는 냉동 고 수-80에 저장 ° c.
6. 다음 쥡니다 Chromatin 조각 크기를 평가
참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
- 드 crosslink chromatin의 30 µ L 1.5 mL 테스트 튜브에 고 추가 20 µ L 5 M NaCl. 500 µ L 볼륨을 완료 하 고 65 ° C에서 밤새 품 어.
- 다음 날 치료 1 µ L 성분 K (20 mg/mL 증권), 10 µ L 2 M Tris pH 6.8, 및 10 µ L 42 ° C. 수행 된 페 놀-클로 프롬/클로 프롬 추출에서 1 시간에 0.5 M EDTA의 수행 및 나트륨 acetat의 1 볼륨 DNA를 침전 한 시간 또는 하룻밤-20-80 ° C에서 100% 에탄올의 e (3 M) 및 2 ° c.
- 15 분 Decant는 상쾌한 13500 x g에서 원심 분리 하 여 DNA를 작은 찬 70% 에탄올과 5 분 Decant는 상쾌한에 다시 한번 원심 분리기로 깨끗이 펠 릿을 세척 하 고 건조는 펠 릿.
- 테 버퍼의 원래 볼륨 (30 µ L)에 펠 릿을 resuspend. 260 nm/280 nm에서 흡 광도 분 광 광도 계에 DNA 농도 측정. 플라스틱 1.5 %agarose 젤의 별도 차선에 DNA 크기 사다리와 DNA의 500-1000은 고 chromatin의 조각 크기를 평가 하기 위해 전기 이동 법을 수행.
참고: 조각 크기 200-500의 기본적인 쌍 사이 여야 하 고 아무 감지 높은 분자량 조각 하 비-또는 저조한-조각화 DNA에 해당 되어야 합니다. Chromatin 솔루션 (5 단계)를 다시 긴 시간 sonicated 고 최적 크기를 얻을 때까지 위에서 설명한 대로 다시 분석 수 필요한 경우.
7. Chromatin Immunoprecipitation (칩)
참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
Aliquoting 1 mL에 에탄올 50% 슬러리의 의해- 블록 단백질 G sepharose 구슬. 펠 릿은 벤치탑에서 1 분 400 x g에서 원심 분리 하 여 구슬 원심 400 x g에서 테 버퍼 원심 분리기의 1 mL로 씻어 고 반복 하는 워시
- 후 두 번째 원심 분리, 다시 칩 희석 버퍼 BSA (재고 20 mg/mL)의 25 µ L의 1 ml에서를 일시 중단 하 고 20 µ L 효 모 tRNA (재고 10 mg/mL)
- . 4 회전 (40-60 rpm) 하 여 적어도 2 사용 전에 h 구슬 차단 ° c.
- Chromatin (5 단계)의 희석 50 µ g 8 ~ 10 배 칩 희석 버퍼를 사용 하 여. 차단 된 비드 슬러리의 50 µ L을 추가 하 고 4에서 2 h (40-60 rpm) 회전에 대 한 품 어 ° C. 원심 분리기 사전 허가 chromatin 신선한 튜브 전송 하 4 ° C에 400 x g.
참고: 최적의 양의 항 체 공급 업체에서 권장 될 수 있습니다 또는 칩-정량 항 체의 다른 수량으로 최적의 농축 관찰 될 때까지 수행 하 여 실험적으로 결정 될 수 있다. 또한 단백질 G sepharose 사용 하는 항 체의 하위 형식에 따라 단백질 A sepharose에 의해 대체 될 수 있습니다.
- 회전 (40-60 rpm) 4 ° C에서 10 분 동안 각 세척을 수행 하 고 작은 벤치 가기 원심 분리기에서 20-30 s 400g x에서 원심 분리 하 여 각 씻어 사이의 구슬.
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Representative Results
핵을, 우리는 15 또는 45 s, 18000 및 22, 000 rpm ( 재료의 표참조)에 대 한 해 부와 다진 근육 조직의 기계적 균질 수행. 모든 조건에서 핵에서 조직, 분리 될 수 있었다 하지만 수익률은 낮은 속도 (그림 1A-B)를 사용 하 여 최적의. Douncing 3-5 분 (그림 1A및 데이터 표시 되지 않음), 핵 수 또한 준비 하지만 기계적 균질 화 방법의 선택, 15로 작은 핵의 최적의 수율을 달성 될 수 있다 s, 특히 시간의 중요 한 증가 허용 여러 샘플 해야 처리 (그림 1B). 2.7 x 10까지이 프로토콜을 사용 하 여 조직 (1 마우스의 조직에 해당)의 500 mg에서7 핵 chromatin의 100 µ g를 생성 하는 격리 된 수 있습니다.
고정된 핵 chromatin 조각화를 최적화 하려면 우리 sonicated 5 ~ 20 분. ( 재료의 표참조) 설정에서 10 분 쥡니다 최적의 chromatin 250의 평균 조각 크기를 생성 하는 bp (그림 2). 이 단계는 사용 sonicator 유형의 고려 실험적으로 최적화 되어야 합니다.
위에서 설명한 프로토콜에 의해 준비 된 근육 chromatin의 품질 평가, 칩 정량 및 칩 seq 실험 녹음 방송 요인, 히스톤 수정 또는 RNA 중 합 효소 II (폴 II)에 대하여 수행 했다. 칩-정량 dexamethasone (덱 스) 치료의 유무에 glucocorticoid 수용 체 (GR)에 대 한 강한 덱 스-종속 GR 농축 덱 스와 GR 것으로 알려져 있다 Redd1 와 Murf1 유전자의 규제 요소 공개 근육 섬유11에서 통제 신호 (그림 3A) 부정적인 컨트롤로 사용 고환 특정 Prm1 발기인에 보였다 동안.
에 대 한 칩 정량 acetylated lysine H3 히스톤의 27 (H3K27ac), 활성 증강에 공유 수정 및 발기인, intergenic 부정에 비해 근육 섬유에 활성화 Desmin (Des) 발기인에 강한 농축을 보였다 제어 영역 (그림 3B)입니다. H3K27ac 칩 seq Des 로커 스는 ' 슈퍼-증강 ' 규제 조직 신원 유전자12 (그림 4A)의 전형적인 걸쳐이 마크의 높은 수준을으로 나타났다. 마찬가지로, 폴 II 칩 seq 속기 폴 II이이 현장에서의 높은 수준을 보여주었다.
칩-정량 녹음 방송 요인 Tead4에 대 한 조직적 차별화13,7에 중요 한 역할을 재생을 밝혔다 Ccnd1 및 Ifrd1 유전자 (앞에서 설명한 바인딩 사이트에는 농축을 그림 3C)입니다. 중요 한 것은, 농축 Tead4 근육 섬유에 선택적으로 활성화 되지 않았습니다 chromatin 쥐에서 준비를 사용 하 여 감소 되었다 (Tead4skm-/-)7 (그림 3C). 반면 Tead4 신호, 하지만 그의 Tead1, H3K27ac, 또는 폴 II, 손실에서 chromatin를 사용 하 여 Tead1와 Tead4에 대 한 데이터 칩 seq 분석 chromatin 야생-타입 근육에서 사용 하는 Kdm5a 유전자의 발기인에 사이트에 바인딩을 보였다 Tead4의 근육skm-/- 마우스 (그림 4B). 마찬가지로, Tead1 및 Tead4 Adssl1 유전자의 하류 규제 요소에 바인딩 볼 야생-타입 근육에서 chromatin와 Tead4 바인딩 chromatin에서 Tead4를 사용 하 여 선택적으로 손실 반면skm-/- (근육 그림 4C)입니다. 이러한 관측 칩 seq 데이터에서 Tead4 신호는 근육 섬유에 바인딩에서 온 보여줍니다.
다른 종류의 세포 칩 seq 결과 근육 섬유와 관련 된 기여를 확인 하려면 평가 하는 근육 인공위성 세포 및 Pecam1의 감에서 활성 상태인 Vcam1 유전자에서 H3K27ac 및 폴 II 신호 내 피 세포 혈관의 근육을 관개 하는. Des 또는 Adssl1 유전자에서 높은 수준에 비해, H3K27ac 및 Vcam1 및 Pecam1 유전자에서 폴 II의 수준 들은 되었다 (그림 4A 및 그림 4C). 관련된 조직 표현에 비해 근육 섬유 표현 유전자에 대 한 신호에 큰 차이가 표시 위에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 준비 하는 chromatin에서 칩에서 본 신호에서 이벤트를 바인딩에서 주로 온다 고 근육 섬유입니다.
그림 1: 성인 마우스 근육에서 핵의 정화. (A) 조직 lysates 얻은 기계적 이동할 (18000 rpm, 45 s) 및 dounce 균질 (30 선/3 분) trypan blue로 얼룩진 디지털 현미경 관찰이 고 이미지 20 배 확대에서 체포 되었다. 눈금 막대 = 100 µ m. 핵의 (B) 수에서에서 얻은 조직 (1 마우스의 해당)의 500 mg 15와 45 s 또는 douncing의 3 분에 대 한 표시 조건, 18000 22000 rpm에서 준비 후에. 오차 막대를 나타내는 평균 ± S.E.M. n에 대 한 기계적 균질 및 n 3 쥐 = = douncing에 대 한 3 쥐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: chromatin 조각 크기의 확인. 고립 된 핵으로 5, 10, 15 또는 20 분 sonicated 했다. 드-가교 정화 후에, DNA 조각 크기 ethidium 평범한 사람 존재 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 평가 되었다. M는 DNA 크기 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: chromatin의 칩 정량 사용. (A) 마우스 내 복 주사와 1.5 h 후 차량 또는 dexamethasone (10 mg/kg)의 복종 되었다, chromatin 뒷 다리 근육에서 준비 했다. GR 대상 유전자 Redd1 에서 칩에 농축 및 Murf1, 부정적인 컨트롤 protamine 발기인 (Prm1)에 비해 입력 시 켰 던의 %로 표시 됩니다. (B) 칩 H3K27ac 및 IgG 제어 항 체에 대 한 수행 및 Desmin 발기인에 분석 되었고 intergenic 부정적인 제어 영역에 비해. (C) Tead4 칩 야생 유형 및 근육 관련 Tead4 녹아웃 쥐에서 얻은 근육 chromatin에서 수행 되었다 (Tead4skm-/-) Tead4 바인딩 사이트에 비해, Ccnd1 및 Ifrd1 발기인에서 분석 하 고는 제어 intergenic 지역입니다. 모든 실험에서 3 쥐에서 chromatin 풀링된 했다 하 고 오차 막대는 평균 ± 3 기술 복제에 대 한 스튜던트 T-검정에서 S.E.M를 나타냅니다. P 값 < 0.001* * < 0.0001 * * *; NS, 비-중요 한입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 근육 섬유 chromatin의 게놈 프로필. (A)는 Universit에서 스크린샷많은 H3K27ac 및 폴 II 상부 근육 섬유, 위성 세포에 표현 된 Vcam1 와 Pecam1 유전자에 비해 높은 표현 Desmin 유전자에서 보여주는 표시 loci의 산타 크루즈 게놈 브라우저에서 캘리포니아의 y와 내 피 세포, 각각. Tead4에서에 비해 야생-타입 (WT) 근육에서 chromatin에서 Tead1 및 Tead4, H3K27ac 및 폴 II의 바인딩 설명 표시 loci의 (B) UCSC 스크린샷skm-/- (MT) 근육, Tead4 바인딩의 선택적 손실 이다 관찰. 일러스트는 칩 seq 데이터 GEO 데이터베이스에서 GSE82193로 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 버퍼 이름 | 구성 | ||
| 소형 버퍼 | 10 mM HEPES-코 (pH 7.3) | ||
| 10mm KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0.1 %NP-40 | |||
| 0.1 밀리미터 PMSF (갓 추가) | |||
| 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (PIC) 1 x (갓 추가) | |||
| 쥡니다 버퍼 | 1% SDS | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 0.1% 나트륨 Deoxycholate | |||
| 1% 트라이 톤 X-100 | |||
| 갓 0.1 밀리미터 PMSF 추가 | |||
| 그림 1 x | |||
| 칩 희석 버퍼 | 0.01% SDS | ||
| 1.1% 트라이 톤 X-100 | |||
| 1.2 mM EDTA | |||
| 16.7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| 갓 0.1 밀리미터 PMSF 추가 | |||
| 그림 1 x | |||
| 낮은 염 버퍼 | 0.1% SDS | ||
| 1% 트라이 톤 X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 높은 염 버퍼 | 0.1% SDS | ||
| 1% 트라이 톤 X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl 버퍼 | 250mm LiCl | ||
| 1 %NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris HCl pH 8 | |||
| 차입 버퍼 | 1% SDS | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| 트리 스-EDTA (테) 버퍼 | 50 mM Tris HCl pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
표 1: 버퍼 작곡입니다.
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Discussion
여기는 성인 마우스 골격 근육이 염색이 질은 근육 섬유 핵 녹음 방송 요인 바인딩 및 화학식 히스톤 수정을 감지 칩 실험에 적합 표시에서 chromatin를 준비 하기 위한 새로운 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요 한 단계가 포함 됩니다. 첫 번째는 조직 장애 dounce 또는 기계적인 전단에 의해 수행 될 수 있는. 기계적 전단 빠르고 더 재현 이며 따라서 방법의 선택. 그럼에도 불구 하 고, 아무 적당 한 장치를 사용할 수 있는 경우 중단도 수행할 수 있습니다 세포는 현미경의 효율성의 평가 정착 단계를 진행 하기 전에 권장은 douncing에 의해. 전체 조직 lysates의 고정 보다는 고립 된 핵의 고정 허용 더 재현 쥡니다 작은 볼륨에서 짧은 기간에 대 한. 우리 또한 토마스 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 장애, 전에 조직 수정 보다는 lysates 중단 후 수정 선택 10 미리 조직 고정 이동할의 감소 효율성 귀착되는. 이 프로토콜 기계적 전단에 따라 다른 제안 된 솔루션, 콜라 소화 등 37 ° C8에서 해 부 조직의 머리말 붙인된 외피를 포함 하는 보다도 빠릅니다. 이 기간 동안, 유전자 표현과 녹음 방송 요인 바인딩 변경 내용이 발생할 수 있습니다. 핵을 가능한 한 빨리 고정 그러므로 정상적인 생리 적 상태를 더 충실 하 게 잡으려고 필수적 이다.
두 번째 중요 한 단계는 핵에서 고정 lysate의 정화 이다. 이 위해, 그리고 40 µ m 셀 거르는 미세 파편을 제거를 통해 더 큰 파편을 제거 하기 위해 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 먼저 고정된 lysate 솔루션의 순차적 필터링는 스 트레이너 막힘을 방지 하 고 얻은 핵의 수익률을 극대화. 핵 sonicated 일단 여과 의해 순화 하 고 DNA 조각 크기 데 가교 후 결정. 1 마우스의 두 뒷 다리 사지에서 일반적인 준비 chromatin의 100 µ g를 생성합니다. 3 쥐에서 lysates 풀링 준비 하는 동안 손실을 감소 시켜 수익률을 높일 수 있습니다. 이 절차는 효율적인 chromatin (데이터 표시 되지 않음)으로 게놈 DNA의 75% 까지의 복구를 허용 합니다.
녹음 방송 요인 바인딩을 평가 하도록 설계 된 칩 실험 그리고 후 성적인 수정 증명의 근육 섬유 핵에 있는 유전자 규칙을 공부 하 고이 프로토콜 적합성. 폴 II 및 H3K27ac에 대 한 강력 하 고 강력한 칩 seq 신호 chromatin, 그들의 독특한 H3K27ac와 폴 II 프로필7에 의해 근육 섬유의 정체성 유전자 수에서 생성 되었다. 섬유 핵, 위성 또는 내 피 세포에 표현 된 유전자에 비해 강하게 표현 하는 유전자 H3K27ac 및 폴 II의 훨씬 높은 수준 신호 섬유 핵에서 주로 온 보여주었다. 이것 또한 어디 그것은 특히 근육 섬유에 비활성화 한 chromatin에서 마우스를 사용 하 여 Tead4 칩 신호의 손실에 의해 확인 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 약한, 그러나 명확 하 게 배경 신호, 위에 Vcam1, Pax7 (데이터 표시 되지 않음) 같은 위성 세포 마커 검출 될 수 있다이 세포에서 그 chromatin 보여주는 또한 존재. 우리는 우리의 프로토콜 포름알데히드 고정 chromatin 3 C/4 C 등을 사용 하는 다른 기술 및 HiC chromatin 구조 캡처 기법에 적합 해야 예상. 결합 전사 인자와 염색 질 chromatin 구조 캡처 수정 칩 seq 미래에 허용 해야 유전자에 대 한 자세한 이해 근육 섬유에 어떻게 이러한 재수출 규제 메커니즘에 대 한 우리의 프로토콜의 사용 또는 생리 적인 자극, 운동, 금식, 고 지방 규정식, denervation, 또는 유전자에서 준비 하는 chromatin를 사용 하 여 질병에 의해 화가 수정 마우스 X 연결 된 centronuclear myopathy14같은 질병을 재현.
요약 하자면,이 낮은-비용 및 시간 효율적인 프로토콜 즉시 sonicated 또는 악의적 사용에 대 한-80 ° C에서 냉동 수 있는 근육 섬유 핵의 격리 수 있습니다. 이 프로토콜에 의해 준비 하는 chromatin의 사용 근육 섬유7 에서 첫번째 게놈 넓은 칩 seq 데이터 제공 하 고이 조직에서 유전자 규칙에 대 한 미래의 연구를 촉진 한다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리 감사 합니다 IGBMC 높은 처리량 시퀀싱 시설, "프랑스 Génomique" 컨소시엄 (ANR10-INBS-09-08)의 회원 및 모든 IGBMC 일반 서비스의 모든 직원 들은 특히 IGBMC 동물 시설 직원을. 이 작품은 CNRS는 INSERM, AFM, 국가 리그 죄수 르 암에서 교부 금에 의해 지원 되었다, 프랑스 프로그램 ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 표시 하는 Investissements d'Avenir에서 ANR 통해 펀드와 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. S.J 지원 했다 국가 리그 죄수 르 암과 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, V.U Ministère de l'Enseignement에 의해 동부 표준시 드 라 Recherche. ID는 'équipe labellisée' 국가 리그 죄수 르 암입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
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