Summary
Представлен Роман протокол для подготовки хроматина от взрослой мыши скелетных мышц, адаптированы для изучения регуляции генов в мышечных волокон иммунопреципитации chromatin.
Abstract
Мы Опишите эффективной и воспроизводимые протокол для подготовки хроматина от взрослой мыши скелетных мышц, физически устойчивостью тканей с высоким содержанием структурных белков. Расчлененных конечностей мышцы от взрослых мышей физически подорван механической гомогенизации или сочетание мясорубки и douncing, в гипотонический буфера до фиксации формальдегида lysate клетки. Фиксированная ядер очищаются путем дальнейшего циклов механической гомогенизации или douncing и последовательного фильтрации для удаления мусора ячейки. Очищенные ядра может быть sonicated немедленно или на более позднем этапе после замораживания. Могут эффективно sonicated хроматина и подходит для экспериментов иммунопреципитации chromatin, как иллюстрируется профили получается факторов транскрипции, РНК-полимераза II и ковалентный гистона модификаций. События привязки, с помощью хроматина, подготовленный этот протокол являются преимущественно те, кто принимает место в ядер мышечных волокон, несмотря на присутствие хроматина от других связанных волоконно спутника и эндотелиальных клеток. Этот протокол таким образом приспособлен для изучения гена регулирование в скелетных мышцах взрослых мыши.
Introduction
Иммунопреципитации Chromatin (обломока) в сочетании с количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и высокая производительность виртуализации (чип seq) стали методы выбора для изучения транскрипции и эпигенетическую регуляцию экспрессии генов в различных тканях и типов клеток1. Эта техника позволяет генома общесистемной профилирования ковалентных chromatin изменения, гистонов вариант размещение и транскрипционным фактором привязки2,3.
Хотя выполнение чип от культивируемых клеток является хорошо организованной, чип от тканей млекопитающих остается более сложным. Подготовка chromatin чипа включает в себя несколько важных шагов, которые должны быть оптимизированы для каждого типа ткани и клетки. Хроматин могут быть приготовлены из клеточных лизатов культивируемых клеток или следующие очистки их ядер. В случае тканей млекопитающих эффективной лизиса, формальдегид фиксации и очистки ядер важны для того, чтобы обеспечить оптимальное восстановление хроматина. Кроме того выбор ли исправить ядер до или после их очистки должен быть экспериментально определены. Несмотря на эти препятствия чип успешно выполнена из ткани, такие как печень, яичка или мозга4,5,6. В случае скелетных мышц нарушение такого физически устойчивостью ткани, которая обладает высоким содержанием структурных белков и изоляции его ядер является особенно сложным. Учитывая эту специфику, протоколы, оптимизированный для других тканей не дают удовлетворительных результатов для скелетных мышц.
Здесь мы описываем протокол изолировать хроматина чип класса от мыши скелетной мышечной ткани, которая включает в себя физически нарушить ткани, формальдегид фиксации, а затем изоляции ядер и sonication. Выполняя чип ПЦР и чип seq для различных факторов транскрипции, РНК-полимераза II и ковалентный гистона изменения7была продемонстрирована эффективность этого метода подготовить хроматина, подходящую для чип из этой ткани.
Этот новый метод гораздо быстрее, чем сообщалось ранее протокол8 , включающий давно коллагеназы пищеварение шаги во время которого, изменения в геномной локализация транскрипционных факторов и изменения в экспрессии генов может занять место. Быстрота, с которой ядер изолированных и фиксированной делает метод, описанный здесь особенно привлекательным для подготовки хроматина, что более точно отражает состояние родной геномной размещение. Кроме того хотя другие методы для извлечения изоляции или белка хроматина из мышечной ткани были описаны8,9,10 и используется для чип ПЦР экспериментов на отдельных генов, не чип seq данные поступили с их помощью. Метод, сообщили здесь подходит для транскрипционного фактора и гистона изменения чип seq и поэтому должны быть также пригодны для 3 / 4C или МКХ хроматина конформации захвата приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
мышей держали в соответствии с институциональной руководящие принципы, касающиеся ухода и использования лабораторных животных и национальные руководящие принципы ухода животных (Европейская Комиссия Директива 86/609/ЦВЕ; Французский декрет no.87-848). Все процедуры были утверждены Комитетом французской национальной этики.
1. изоляция мышечной ткани
- жертву один взрослый 6 к 8-недельных мышь шейки матки дислокации. Sterlise конечности, промыв его с 70% этанола и вскрыть задних конечностей мышцы (икроножной мышцы, Tibialis передние, четырехглавой) с помощью тонкой точке ножницы и щипцами.
Примечание: Одна мышь должна принести около 500 мг ткани. - Фарш мышц в 2 мл пробирки, содержащие 1 мл ледяной гипотонический буфера для однородных подготовки малых (< 2-3 мм 3) куски с помощью тонкой ножницы и оставить трубки, пожимая на скамейке Топ агитатор на 4 ° C на 5-10 мин
2. Лизис ткани
Примечание: пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для всех буфера композиций.
- Передать 14 мл раунд дно огневки и Ресуспензируйте в 5 мл холодной гипотонический буфера (ЭДТА бесплатно ингибитор протеазы коктейль и PMSF).
- Homogenise фарш из мышечной ткани, используя свободные dounce (20-30 ударов в течение 3 мин) или механических тканей гомогенизатор для 15-30 s в туре вниз 14 мл пробирок.
Примечание: Эффективность лизис можно оценить на данном этапе по световой микроскопии, и при необходимости могут выполняться дополнительные нарушения.
- Homogenise фарш из мышечной ткани, используя свободные dounce (20-30 ударов в течение 3 мин) или механических тканей гомогенизатор для 15-30 s в туре вниз 14 мл пробирок.
- Передачи огневки для 15 мл пробирок и заполнить объем до 10 мл, с использованием холодного гипотонический буфера. Исправить огневки, как описано ниже, прежде чем приступить к следующему мыши.
3. Фиксация
- Добавить формальдегида в конечной концентрации 1% и встряхнуть для 10 мин при комнатной температуре.
- Добавить Глицин в конечной концентрации 0,125 м в каждой тюбике остановить фиксации и встряхнуть для 5-10 мин при комнатной температуре.
4. Подготовка ядер
Примечание: пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для всех буфера композиций.
- Homogenise, фиксированная lysate используя свободные dounce (5-10 ударов).
- Передачи 15 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут при температуре 4 ° C для получения ядер и сотовой мусора.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в свежих 5 мл гипотонический буфера. Фильтр lysate через стрейнер ячейки 70 мкм в 50 мл трубки. Повторно фильтр фильтрата через стрейнер клеток 40 µm.
- Передачи фильтрат 15 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут при 4 ° C для получения ядерных Пелле.
Примечание: На данном этапе, ядра могут быть немедленно sonicated, или привязать заморожены как сухих гранул в жидком азоте и температуре -80 ° C.
5. Sonication
- оценить объем ядерной Пелле (около 50 мкл для гомогенизации как механических, так и dounce) и Ресуспензируйте ее в буфер sonication до 3-4 раза объема Упакованные ядерной и sonicate для 10-15 мин при температуре 4 ° C с помощью sonicator .
Примечание: Хроматина могут анализировать сразу же, как описано ниже (6) или замороженные и храниться на -80 ° C.
6. Оценка размера фрагмента Chromatin, после Sonication
Примечание: пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для всех буфера композиций.
- Де crosslink, взять 30 мкл хроматина в пробирке 1,5 мл и 20 мкл 5 М NaCl. Полный объем 500 мкл и инкубировать на 65 ° C ночь и.
- Следующий день, проводить лечение с 1 мкл протеиназы K (20 мг/мл бульона), 10 мкл 2 М трис рН 6,8 и 10 мкл ЭДТА 0,5 М за 1 ч при 42 ° C. выполнить фенол хлороформ/хлороформ добычи и осадка ДНК с 1 объем натрия используется e (3 М) и 2 тома 100% этанола для одного ч-80 ° c, или на ночь при -20 ° с.
- Пелле ДНК центрифугированием на 13500 g x 15 мин Decant супернатант и помыть лепешка с тщательно холодный 70% этанола и центрифуги снова для 5 минут Decant супернатант и просушите гранулы.
- Ресуспензируйте гранулы в первоначального объема (30 мкл) TE буфера. Измерьте концентрации ДНК в спектрофотометре абсорбция 260 Нм/280 Нм. Пипетка 500-1000 нг ДНК вместе с ДНК размер лестницы на отдельные полосы 1,5% геля агарозы и провести электрофорез оценить размер фрагмента хроматина.
Примечание: Размер фрагмента должен быть между 200-500 пар оснований и не должно быть без обнаружению высокой молекулярной массой фрагментов, соответствующий для или плохо нефрагментированные ДНК. При необходимости, хроматина решение (шаг 5) могут быть повторно sonicated на более длительное время и затем повторно проанализированы, как описано выше, до тех пор, пока оптимальный размер получается.
7. Иммунопреципитации Chromatin (обломока)
Примечание: пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для всех буфера композиций.
- Блок протеина G sepharose бусины aliquoting 1 мл 50% раствора в этиловом спирте. Пелле бусины центрифугированием на 400 x г за 1 мин в настольная центрифуга и мыть с 1 мл раствора TE буфера центрифуги на 400 x g и повторить Вашингтон
- После второй центрифугирования, вновь приостановить в 1 мл буфера для разведения чип с 25 мкл BSA (акций 20 мг/мл) и 20 мкл дрожжей tRNA (запасов 10 мг/мл). Блокировать Бусины для по крайней мере 2 h до использования путем вращения (40-60 мин) на 4 ° C.
- Разбавить 50 мкг хроматина (шаг 5) 8-10 раз с использованием буфера для разведения чип. Добавьте 50 мкл суспензии заблокированных шарик и проинкубируйте 2 ч, вращающиеся (40-60 об/мин) на 4 ° C. центрифуги на 400 x g при 4 ° C для получения предварительно отобранных хроматина и перенести его на свежий трубки.
- Для иммунопреципитации, добавьте соответствующее количество первичных антител (например, 1-2 мкг на 10 мкг хроматина) и инкубировать на ночь с вращением на 4 ° C.
Примечание: Оптимальное количество антител может быть рекомендован поставщиком или можно определить эмпирически, выполняя чип ПЦР с различных количеств антител, пока наблюдается оптимальное обогащение. Также белок G sepharose могут быть заменены sepharose белок в зависимости от подтипа антитела используются. - Добавить заблокированный бусины следующий день и инкубировать 1 час с вращения (40-60 мин) на 4 ° C. центрифуги на 400 x g для 20-30 s Пелле бусы, удалить супернатант и начать обломок стирает.
- Чип моет: выполняют следующие моет буферы: один раз с низкой соли буфера и затем дважды с высоким соли буфера, дважды с LiCl буфера и наконец дважды с буфером TE.
- Выполнять каждый мыть за 10 мин с вращением (40-60 об/мин) при 4 ° C и Пелле бусы между каждой стирки центрифугированием на 400 x g для 20-30 s в центрифуге настольное.
- Для элюции, удалите последние мыть и Ресуспензируйте бусины в 250 мкл Элюирующий буфер (свежеприготовленные) для 15 мин при комнатной температуре при встряхивании.
- Центрифуги 400 x g и собирать элюата в свежий трубку. Выполните этот шаг дважды, а затем де crosslink элюата ночь с 20 мкл NaCl 5 М и 1 мкл РНКазы A (10 мг/мл), лечить с протеиназы K и фенол хлороформ/хлороформ extrдействовать как в шаге 6.
- Ресуспензируйте в 50 мкл буфера TE и использовать аликвоты для чип ПЦР согласно стандартных протоколов 15 для проверки качества чипа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы изолировать ядер, мы провели механической гомогенизации расчлененных и фарш мышечной ткани для 15 или 45 s, в 18000 и 22000 об/мин (см. Таблицу материалы). Во всех условиях ядра могут быть отделены от мусора ткани, но выход был оптимальным, с помощью низкой скорости (рис. 1A-B). Ядра могут быть также подготовлены douncing для 3-5 мин (рис. 1Aи данные не показаны), но механической гомогенизации является методом выбора, как можно достичь оптимальной урожайности ядер в качестве лишь 15 s, позволяя важный выигрыш времени, особенно если несколько образцов должны быть обработаны (рис. 1B). Используя этот протокол, до 2,7 x 107 ядра от 500 мг ткани (эквивалент 1 мышь ткани) может быть изолированы, чтобы генерировать 100 мкг хроматина.
Чтобы оптимизировать фрагментации хроматина от фиксированной ядер, мы sonicated на 5-20 мин. В разделе Параметры (см. Таблицу материалы) 10 мин sonication является оптимальным решением для создания хроматина со среднем фрагмента размером 250 bp (рис. 2). Этот шаг должен быть оптимизирован экспериментально, принимая во внимание тип sonicator используется.
Чтобы оценить качество мышц хроматина, подготовленный протокол, описанных выше, чип ПЦР и чип seq эксперименты были проведены против факторов транскрипции, изменения гистона или РНК-полимераза II (Pol II). Чип ПЦР против глюкокортикоидный рецептор (GR) в присутствии или отсутствии лечения дексаметазоном (Dex) показали сильный Dex зависимых GR обогащения в регуляторных элементов генов Redd1 и Murf1 , которые известны как Dex и гр регулируется в мышечных волокон11, пока сигнал не был замечен на яички конкретных Prm1 промоутер используется как отрицательный контроль (рис. 3A).
Чип ПЦР против ацетилированные лизин 27 гистонов H3 (H3K27ac), ковалентная модификация на активные расширители и промоутеров, показали сильный обогащения на промоутер десмин (Des), который является активным в мышечных волокон, по сравнению с отрицательным intergenic область элемента управления (рис. 3B). H3K27ac чип seq показали высокий уровень этой марки на протяжении Des локус, типичной регулируемой ткани «супер усилитель» личность гена12 (рис. 4A). Аналогичным образом Пол II чип seq показали высокий уровень транскрипции Pol II в данном локусе.
Чип ПЦР для транскрипционного фактора Tead4, который играет важную роль в миогенных дифференциация13,7, показали его обогащения на ранее описанных привязки сайтов в Ccnd1 и Ifrd1 генов ( Рисунок 3 c). Важно отметить, что обогащение было уменьшено с помощью хроматина, приготовленный из мышей, где Tead4 был выборочно инактивированных в мышечных волокон (Tead4skm-/-)7 (рис. 3 c). Анализ данных чип seq для Tead1 и Tead4 показали их привязку к сайту в промоутер Kdm5a гена, с помощью хроматина от дикого типа мышц, в то время как Tead4 сигнала, но не то, что Tead1, H3K27ac, или Пол II, было потеряно с помощью хроматина от мышцы Tead4skm-/- мышей (рис. 4В). Аналогичным образом, Tead1 и Tead4 привязку к элементу регулирования, вниз по течению Adssl1 гена рассматривается с хроматином от дикого типа мышц, тогда как Tead4 привязки выборочно погиб, используя хроматина от Tead4skm-/- мышц () Рисунок 4 c). Эти наблюдения показывают, что сигнал Tead4, видели в чип seq данных пришли из привязки в мышечные волокна.
Чтобы определить вклад других типов клеток, связанных с мышечные волокна на чип seq результаты, мы оценили H3K27ac и Пол II сигналов на Vcam1 ген, который активен в мышечные клетки спутниковой и Pecam1, маркер эндотелиальные клетки кровеносных сосудов, которые орошают мышцы. По сравнению с высокими уровнями, видели в Des или Adssl1 генов, уровни H3K27ac и Пол II, видели в Pecam1 , так и Vcam1 генов были гораздо ниже (рис. 4A и Рисунок 4 c). Большие различия в сигнал для мышечных волокон выразил генов, по сравнению с теми в тканях связано указал, что сигнал, видели в чип от хроматина, подготовлен с использованием протокола, описанные выше приходит большей частью от привязки событий в мышечные волокна.
Рисунок 1: Очистка ядер от взрослой мыши мышцы. (A) ткани лизатов получаемых механической гомогенизации (18000 об/мин, 45 s) и dounce гомогенизации (30 ударов/3 мин) были окрашенных с Трипановый синий и наблюдается под микроскопом цифровой изображения были захвачены при 20-кратном. Шкалы бар = 100 µm. (B) количество ядер полученные от 500 мг ткани (эквивалент 1 мышь) после подготовки в указанных условиях, 18000 и 22000 об/мин для 15 и 45 s или 3 мин douncing. Планки погрешностей представляют собой среднее ± S.E.M. для n = 3 мышей для механической гомогенизации и n = 3 мышей для douncing. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: проверка размера фрагмента хроматина. Изолированные ядра были sonicated для 5, 10, 15 или 20 минут, как указано. После очистки и де сшивки электрофорез геля агарозы присутствии бромид ethidium оценивали размер фрагментов ДНК. M является ДНК размер маркера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: использование chromatin для чип ПЦР. (A) мышах были подвергнуты внутри брюшной полости инъекции транспортного средства или дексаметазон (10 мг/кг) и через 1,5 ч, хроматина был подготовлен от мышц задних конечностей. Обогащение в чип на GR целевых генов Redd1 и Murf1, по сравнению с отрицательного контроля протамина промоутер (Prm1), указывается как % химически осажденный ввода. (B) чип для H3K27ac и IgG антитела управления и проанализированы на десмин промоутер и по сравнению с intergenic отрицательный контроль регион. (C) Tead4 чип была выполнена на мышцы хроматина, полученные от дикого типа и мышц конкретной Tead4 плей мышей (Tead4skm-/-) и анализ на Tead4 привязки сайтов в Ccnd1 и Ifrd1 промоутеров, по сравнению с intergenic область элемента управления. Все эксперименты объединили хроматина от 3 мышей и погрешностей представляют собой среднее ± S.E.M в студента T-тест для трех технических реплицирует. Значение P < 0.001* *, < 0.0001 ***; NS, незначительным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: геномной профили мышечные волокна chromatin. (A) скриншоты из универсиy из Калифорнии в Санта-Крус генома браузер указанных локусов, иллюстрирующие гораздо выше H3K27ac и Пол II уровни в гене десмин, сильно выражена в мышечных волокон, по сравнению с Vcam1 и Pecam1 генов в клетках Спутниковое и эндотелиальные клетки, соответственно. (B) UCSC скриншоты указанных локусов, иллюстрирующие привязки Tead1 и Tead4, а также H3K27ac и Пол II, в хроматина от дикого типа мышц (WT) по сравнению с показателем от Tead4skm-/- (MT) мышцы, где является селективная потеря Tead4 привязки отмечено. Чип seq данных иллюстрированный доступен как GSE82193 в базе данных ГЕО. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя буфера | Состав | ||
| Гипотонический буфер | 10 мм HEPES-Кох (рН 7.3) | ||
| 10 мм KCl | |||
| 5 мм MgCl2 | |||
| 0,1% NP-40 | |||
| 0,1 мм PMSF (свеже добавлено) | |||
| Ингибитор протеазы коктейль (ПОС) 1 x (свеже добавлено) | |||
| Sonication буфера | 1% SDS | ||
| 10 мм ЭДТА | |||
| 20 мм трис-HCl рН 8 | |||
| 150 мм NaCl | |||
| 0,1 Дезоксихолат натрия % | |||
| 1% X-100 Тритон | |||
| Недавно добавлены 0,1 мм PMSF | |||
| Рис 1 x | |||
| Чип буфером для разбавления проб | 0.01% SDS | ||
| 1.1% тритон X-100 | |||
| 1.2 мм ЭДТА | |||
| 16,7 мм Tris-HCl pH8 | |||
| 167 мм NaCl | |||
| Недавно добавлены 0,1 мм PMSF | |||
| Рис 1 x | |||
| Низкая соль буфер | 0,1% SDS | ||
| 1% X-100 Тритон | |||
| 500 мм ЭДТА | |||
| 20 мм Tris-HCl pH8 | |||
| 150 мм NaCl | |||
| Высокая соли буфер | 0,1% SDS | ||
| 1% X-100 Тритон | |||
| 500 мм ЭДТА | |||
| 20 мм Tris-HCl pH8 | |||
| 500 мм NaCl | |||
| LiCl буфер | 250 мм LiCl | ||
| 1% NP-40 | |||
| 1 мм ЭДТА | |||
| 10 мм Tris-HCl рН 8 | |||
| Элюирующий буфер | 1% SDS | ||
| 100 мм NaHCO3 | |||
| Буфер Tris-ЭДТА (TE) | 50 мм Tris-HCl рН 8 | ||
| 1 мм ЭДТА | |||
Таблица 1: Буфера композиции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем Роман протокол для подготовки хроматина от взрослой мыши скелетных мышц и показать, что это хроматина подходит для чип экспериментов, которые обнаружить связывания фактор транскрипции и ковалентный гистона изменения в ядер мышечных волокон. Этот протокол включает в себя несколько важных этапов. Во-первых, нарушение ткани, которая может быть выполнена либо путем dounce механической резки. Механической резки быстрее и более воспроизводимые и поэтому является методом выбора. Тем не менее если нет подходящего аппарата, нарушение может также осуществляться douncing, где оценка эффективности лизис под микроскопом рекомендуется перед переходом к шагу фиксации. Фиксация лизатов целом ткани, а не фиксации отдельных ядер, позволили более воспроизводимые sonication в небольших объемах и на короткий срок. Мы также решили исправить лизатов после нарушения, вместо того, чтобы исправить ткани до потрясений, как описано в Thomas et al. 10 предварительно фиксации ткани привели к снижения эффективности гомогенизации. Этот протокол, основанный на механической резки также быстрее, чем другие предложенные решения, такие как коллагеназы пищеварение, предусматривающие длительный инкубационный Иссеченную ткань при 37 ° C8. В этот период могут происходить изменения в привязке фактор выражение и транскрипции генов. Фиксации ядер как можно быстрее, поэтому важно более точно захватить нормального физиологического состояния.
Вторым важным шагом является очистки ядер от фиксированной lysate. Для этого последовательная фильтрация фиксированной lysate решения, сначала через стрейнер ячейки 70 мкм для ликвидации больше мусора, а затем через сито клеток 40 мкм, чтобы удалить мелкий мусор, позволяет избежать засорения фильтры и увеличивает доходность получены ядер. Как только очищенный фильтрации, sonicated ядер и размер фрагментов ДНК определяется после де сшивки. Типичная подготовки из двух задних конечностей одной мыши дает 100 мкг хроматина. Объединение лизатов от до 3 мышей может улучшить урожайность путем уменьшения потерь во время подготовки. Эта процедура является эффективной, поскольку она позволяет восстановления до 75% геномной ДНК как хроматина (данные не показаны).
Чип эксперименты для оценки привязки фактор транскрипции и эпигеномные изменения продемонстрировал пригодность этого протокола для изучения гена регулирование в ядер мышечных волокон. Сильные и надежные сигналы чип seq для Pol II и H3K27ac были получены от хроматина, позволяя идентификации мышечных волокон идентификации генов, их отличительные H3K27ac и Пол II профили7. Гораздо более высокий уровень H3K27ac и Пол II на гены, решительно выраженную в ядрах волокна, по сравнению с гены, выраженный в спутниковое или эндотелиальных клеток, показали, что сигнал пришли преимущественно из волокна ядер. Это было также подтверждено потери сигнала Tead4 чип, используя хроматина от мышей, где он был специально инактивированная в мышечных волокон. Тем не менее, слабее, но явно выше фона сигналы, для спутниковой ячейки маркеры например Vcam1, Pax7 (данные не показаны) могут быть обнаружены показаны что хроматина из этих клеток присутствует также. Мы ожидаем, что наш протокол должны быть пригодны для других методов, использующих формальдегида Исправлена хроматина например 3 C/4 C и МКХ хроматина конформации захват техники. Использование нашего протокола для комбинирования чип seq для факторов транскрипции и хроматина модификаций с захватом конформации хроматина в будущем должно позволить детального понимания гена регулирующих механизмов в мышечных волокон и как они могут регулироваться или расстроен физиологических раздражителей, таких как упражнения, постом, высоким содержанием жиров, денервация, или в болезнь, с помощью хроматина, приготовленный из генетически модифицированный мышей воспроизводства болезни, как Х-хромосомой centronuclear миопатия14.
В целом этот лоу кост и время эффективный протокол позволяет изоляции ядер мышечных волокон, которые могут быть sonicated немедленно или замороженные при температуре-80 ° C для скрытых использования. Использование хроматина, подготовленный этот протокол предоставил первый генома широкий чип seq данные из мышечных волокон7 и облегчит будущие исследования о регулировании гена в этой ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим всех сотрудников объекта последовательности IGBMC высокой пропускной способности, членом консорциума «Франция Génomique» (ANR10-INBS-09-08) и все IGBMC общих услуг в частности сотрудников животных фонда IGBMC. Эта работа была поддержана грантов из CNRS, INSERM, AFM, le Национальная лига против рака, французский государственный фонд через НРУ по программе Investissements будущее помечены АНР-10-IDEX-0002-02, Labex нар INRT-10-IDEX-0001-02 и ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. Le Национальная лига против рака и ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, и V.U S.J была поддержана Ministère де образования et de la исследований. Идентификатор является «équipe labellisée» le Национальная лига против рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).
