Summary
Se presenta un nuevo protocolo para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto adaptado al estudio de la regulación de los genes en las fibras musculares por inmunoprecipitación de cromatina.
Abstract
Se describe un protocolo eficiente y reproducible para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto, un tejido resistente físicamente con un alto contenido de proteínas estructurales. Disecada extremidades músculos de ratones adultos físicamente se interrumpen por homogeneización mecánica, o una combinación de picado y douncing, en un tampón hipotónico antes de fijación formaldehído de la célula lisada. Los núcleos fijos son purificados por más ciclos de homogeneización mecánica o douncing y filtraciones secuenciales para eliminar restos celulares. Los núcleos purificados pueden ser sonicados inmediatamente o en una etapa posterior después de congelar. La cromatina puede ser sonicada eficientemente y es conveniente para los experimentos de inmunoprecipitación de cromatina, como lo demuestran los perfiles obtenido para factores de transcripción, ARN polimerasa II y modificaciones covalentes de histonas. Los eventos de enlace detectados con cromatina preparada por este protocolo son predominantemente aquellos que toman lugar en los núcleos de la fibra muscular a pesar de la presencia de cromatina de otro satélite de fibra-asociada y las células endoteliales. Este protocolo, por tanto, se adapta para estudiar la regulación de los genes en el músculo esquelético de ratón adulto.
Introduction
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se han convertido en los métodos de elección para el estudio de transcripción y regulación epigenética de la expresión génica en distintos tejidos y tipos de la célula1. Esta técnica permite perfiles de genoma de modificaciones covalentes de la cromatina, ocupación variante de la histona y transcripción factor vinculante2,3.
Mientras que realizar ChIP de células cultivadas está bien establecida, ChIP de tejidos mamíferos sigue siendo más difícil. Preparación de cromatina chip implica varios pasos críticos que necesitan ser optimizados para todo tipo de tejidos y células. La cromatina puede ser preparada de los lisados celulares de las células cultivadas o purificación siguiente de sus núcleos. En el caso de tejidos mamíferos, lisis eficiente fijación formaldehído y purificación de núcleos son críticos para asegurar la óptima recuperación de la cromatina. Por otra parte, la elección de fijar los núcleos antes o después de su purificación debe determinarse experimentalmente. A pesar de estos obstáculos, el ChIP se ha realizado con éxito de tejidos como el hígado, testículo, cerebro4,5,6. En el caso del músculo esquelético, la interrupción de un tejido resistente físicamente, que exhibe un alto contenido de proteínas estructurales y el aislamiento de sus núcleos es particularmente desafiante. Dada esta especificidad, protocolos optimizados para otros tejidos no dan resultados satisfactorios para los músculos esqueléticos.
Aquí se describe un protocolo para aislar la cromatina ChIP-grado de tejido de músculo esquelético de ratón que consiste en alterar físicamente el tejido, fijación de formaldehído y el aislamiento de núcleos y sonicación. La eficacia de este método para preparar conveniente para el ChIP de este tejido la cromatina fue demostrada realizando qPCR ChIP y ChIP-seq para varios factores de transcripción, ARN polimerasa II y de modificaciones covalentes de histonas7.
Esta nueva técnica es mucho más rápida que un protocolo previamente divulgados8 que comprende largos pasos de digestión colagenasa durante ese tiempo, cambios en la localización genómica de factores de transcripción y pueden ocurrir alteraciones en la expresión génica. La rapidez con que los núcleos son aislados y fijo hace que el método descrito aquí particularmente atractiva para preparar cromatina que refleja más fielmente el estado nativo ocupación genómica. Por otra parte, aunque tienen otros métodos para la extracción de proteína o aislamiento de cromatina de tejido muscular han sido descrito8,9,10 y utilizado para los experimentos de ChIP-qPCR en genes seleccionados, sin ChIP-seq se ha reportado datos usarlos. El método aquí es conveniente para la transcripción factor e histona modificación ChIP-seq y por lo tanto debe ser también adecuado para 3 / 4C o aplicaciones de captura de conformación de la cromatina de HiC.
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Protocol
ratones fueron mantenidos de conformidad con las directrices institucionales sobre el uso y cuidado de animales de laboratorio y de acuerdo con directrices nacionales de cuidado Animal (Comisión Directiva 86/609/CEE; El francés decreto no.87-848). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Nacional de ética francés.
1. aislamiento de tejido muscular
- sacrificio adultos 6 a 8 semanas de edad ratón por dislocación cervical. Sterlise la extremidad por lavado con etanol al 70% y disecar los músculos de extremidades (gastrocnemio, tibial Anterior, cuadriceps) utilizando tijeras de punta fina y fórceps.
Nota: Un ratón debe generar alrededor de 500 mg de tejido. - Pique los músculos en un tubo de ensayo 2 mL que contiene 1 mL de tampón hipotónico helada a una preparación homogénea de pequeño (< 2-3 mm 3) piezas finas tijeras y dejar el tubo de agitación en un agitador de Banco superior a 4 ° C durante 5-10 min
2. Lisis de tejido
Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
- Traslado el homogenizado a un tubo de fondo redondo de 14 mL y resuspender en tampón hipotónico frío (libre de EDTA inhibidor de la proteasa cóctel y PMSF) de 5 mL.
- Homogenise tejido muscular picada mediante un flojo dounce (20-30 movimientos dentro de 3 minutos) o un homogeneizador de tejidos mecánicos para 15-30 s en tubos de fondo redondo 14 mL.
Nota: La eficiencia de la lisis puede evaluarse en esta etapa por microscopia ligera, y si es necesario, puede realizarse la interrupción adicional.
- Homogenise tejido muscular picada mediante un flojo dounce (20-30 movimientos dentro de 3 minutos) o un homogeneizador de tejidos mecánicos para 15-30 s en tubos de fondo redondo 14 mL.
- Traslado el homogeneizado en tubos de 15 mL y completar volumen a 10 mL con tampón hipotónico frío. Fijar el homogeneizado como se describe a continuación antes de proceder con el ratón siguiente.
3. Fijación
- añadir formaldehído a concentración final de 1% y agitar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir glicina a una concentración final de 0,125 M en cada tubo para detener la fijación y agitar durante 5-10 min a temperatura ambiente.
4. Preparación de núcleos
Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
- Homogenise fijo lisado usar un flojo dounce (5-10 movimientos).
- Transferencia a un tubo de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C para obtener núcleos y ruina celular.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en tampón hipotónico fresco 5 mL. Filtrar el lisado a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo de 50 mL. Volver a filtrar el líquido filtrado a través de un tamiz de 40 μm celular.
- Transferir el filtrado a un tubo de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos a 4 ° C para obtener el pellet nuclear.
Nota: En esta etapa, los núcleos pueden ser sonicados inmediatamente, o el rápido congelado como una pelotilla seca en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C.
5. Sonicación
- evaluar el volumen de la pastilla nuclear (alrededor de 50 μL para homogeneización mecánica y dounce) y resuspender en tampón de sonicación hasta 3 a 4 veces del volumen nuclear lleno y someter a ultrasonidos durante 10-15 min a 4 ° C utilizando un sonicador .
Nota: La cromatina puede ser analizada inmediatamente como se describe a continuación (6) o congelada y almacenada a -80 ° C.
6. Evaluar el tamaño del fragmento de la cromatina tras sonicación
Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
- Para de-reticular, 30 μl de la cromatina en un tubo de ensayo de 1,5 mL y añadir 20 μl 5 M NaCl. El volumen a 500 μl e incubar a 65 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, realizar un tratamiento con proteinasa K de 1 μl (stock de 20 mg/mL), 10 μl 2 M Tris pH 6.8 y 10 μl de EDTA de 0,5 M por 1 h a 42 º C. Realice un fenol-cloroformo/cloroformo la extracción y precipitar el ADN con 1 volumen de sodio acetat e (3 M) y 2 volúmenes de etanol al 100% para una h a-80 ° C o durante la noche-20 ° C.
- De la pelotilla de la DNA por centrifugación a 13.500 x g durante 15 minutos decantar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70% frío y centrifugar nuevamente por 5 min, decantar el sobrenadante y secar el pellet.
- Resuspender el precipitado en el volumen original (30 μL) de tampón TE. Medir la concentración de ADN en un espectrofotómetro la absorbancia a 260 nm/280 nm. Pipetear 500-1.000 ng de ADN junto con una escala de tamaño de DNA en carriles separados de un gel de agarosa al 1,5% y realizar la electroforesis para determinar el tamaño de fragmento de cromatina.
Nota: Tamaño del fragmento debe estar entre 200-500 pares de bases y no debe ser fragmentos de peso molecular perceptible corresponde a no - o mal-fragmentación ADN. Si es necesario, la solución de la cromatina (paso 5) puede volver a sonicada durante más tiempo y entonces volvieron a analizar como se describe anteriormente hasta obtener el tamaño óptimo es.
7. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
- Abalorios de sepharose del bloque G de la proteína por tomar 1 mL de la mezcla de 50% en etanol. Pellets de los granos por centrifugación a 400 x g durante 1 min en una sobremesa centrifugar y lavan con 1 mL de la centrifugadora de buffer TE a 400 x g y repetición el Washington
- Después de la segunda centrifugación, resuspender en 1 mL de tampón de dilución de ChIP con 25 μl de BSA (stock 20 mg/mL) y 20 μl de levadura tRNA (stock 10 mg/mL). Bloquear las cuentas de al menos 2 h antes de su uso por rotación (40-60 rpm) a 4 ° C.
- Diluir 50 μg de la cromatina (paso 5) 8 a 10 veces con tampón de dilución de la viruta. Añadir 50 μl de mezcla de grano bloqueado e incubar por 2 h giratoria (40-60 rpm) a 4 ° C. Centrifugar a 400 x g a 4 ° C para obtener previamente despejado de la cromatina y transferirlo a un tubo nuevo.
- Para la inmunoprecipitación, añadir la cantidad apropiada de anticuerpo primario (p. ej., 1-2 μg por 10 μg de cromatina) e incubar durante una noche con giro en 4 ° C.
Nota: La cantidad óptima de anticuerpo puede ser recomendada por el proveedor o se puede determinar empíricamente mediante la realización de ChIP-qPCR con diferentes cantidades de anticuerpo hasta enriquecimiento óptima se observa. También sepharose proteína G puede ser reemplazado por proteína A sefarosa según el subtipo de anticuerpo usado. - Añadir las cuentas bloqueadas al día siguiente e incubar durante 1 h con rotación (40-60 rpm) a 4 ° C. Centrifugar a 400 x g por 20-30 s los granos de la pelotilla, eliminar el sobrenadante, y empezar el ChIP lava.
- ChIP lavados: realice los siguientes lavados con los almacenadores intermediarios: una vez con tampón salino de baja y luego dos veces con tampón salino alto, dos veces con tampón de LiCl y finalmente dos veces con Buffer TE.
- Realizar cada lavado durante 10 min con rotación (40-60 rpm) a 4 ° C y de la pelotilla de las cuentas entre cada colada por centrifugación a 400 x g por 20-30 s en una centrífuga de mesa.
- La elución, quite el último lavado y resuspender los granos en 250 μl de tampón de elución (recién preparado) por 15 min a temperatura ambiente agitando.
- Centrifugar a 400 x g y recoger el eluido en un tubo nuevo. Realizar este paso dos veces y luego de-reticulación el efluente durante la noche con 20 μl de NaCl 5 M y 1 μl Rnasa A (10 mg/mL), tratamiento con proteinasa K y fenol-cloroformo/cloroformo extractuar como en el paso 6.
- Resuspender en 50 μl de buffer TE y utilizar alícuotas para qPCR ChIP según protocolos estándar 15 para comprobar la calidad de la viruta de.
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Representative Results
Para aislar los núcleos, realizamos la homogeneización mecánica del tejido muscular disecado y picada para 15 o 45 s, en 18.000 y 22.000 rpm (véase Tabla de materiales). En todas las condiciones, los núcleos podrían ser separados de los desechos de tejido, pero el rendimiento fue óptimo con la velocidad más baja (figura 1A-B). Núcleos también pueden ser preparados por douncing 3-5 minutos (figura 1Ay datos no mostrados), pero la homogeneización mecánica es el método de elección, como rendimientos óptimos de núcleos se pueden lograr en tan poco como 15 s, lo que permite una importante ganancia de tiempo sobre todo si múltiples las muestras han de ser procesadas (figura 1B). Mediante este protocolo, hasta 2.7 x 107 núcleos de 500 mg de tejido (equivalente al tejido del 1 ratón) pueden ser aislados para generar 100 μg de cromatina.
Para optimizar la fragmentación de la cromatina de los núcleos fijos, sonicó durante 5 a 20 minutos. En la configuración (véase Tabla de materiales), a 10 min de sonicación fue óptima para generar cromatina con un tamaño de fragmento promedio de 250 bp (figura 2). Este paso debe optimizarse experimentalmente, teniendo en cuenta el tipo de sonicador utilizado.
Para evaluar la calidad de la cromatina de músculo preparada por el protocolo descrito anteriormente, se realizaron experimentos de qPCR ChIP y ChIP-seq contra factores de transcripción, una modificación de las histonas o ARN polimerasa II (Pol II). ChIP-qPCR contra el receptor de glucocorticoides (GR) en la presencia o ausencia de tratamiento con dexametasona (Dex) reveló fuerte enriquecimiento de Dex-dependiente GR en elementos reguladores de los genes Redd1 y Murf1 que son conocidos por ser Dex y GR regulado en las fibras musculares11, mientras que ninguna señal fue vista en el testículo específicos Prm1 promotor utilizado como control negativo (Figura 3A).
ChIP-qPCR contra acetilado lisina 27 de la histona H3 (H3K27ac), una modificación covalente en potenciadores activos y promotores, demostradas fuerte enriquecimiento en el promotor de desmina (Des) que es activo en las fibras musculares, en comparación con un negativo intergénico región de control (figura 3B). H3K27ac ChIP-seq reveló un alto nivel de esta marca en el lugar de Des , típico de un reforzador de la super tejido regulado identidad gene12 (Figura 4A). Semejantemente, Pol II ChIP-seq demostró altos niveles de transcribir Pol II en este locus.
ChIP-qPCR para el factor de transcripción Tead4, que juega un papel importante en la diferenciación miógena13,7, reveló su enriquecimiento en sitios de Unión previamente descritos ( Ifrd1 ) genes y Ccnd1 Figura 3). Lo importante, enriquecimiento fue reducido con cromatina de ratones donde Tead4 se inactiva selectivamente en las fibras musculares (Tead4skm-/-)7 (figura 3). Análisis de los datos del ChIP-seq para Tead1 y Tead4 demostraron su enlace a un sitio en el promotor del gen Kdm5a con cromatina de tipo muscular, mientras que la señal Tead4 pero no Tead1 H3K27ac y Pol II, se perdió con la cromatina de los músculos de la Tead4skm-/- ratones (Figura 4B). Del mismo modo, Tead1 y Tead4 vinculante a un elemento regulador corriente abajo del gen Adssl1 es visto con cromatina de tipo muscular, mientras que Unión Tead4 perdió selectivamente con cromatina de Tead4skm-/- muscular () Figura 4). Estas observaciones demuestran que la señal Tead4 vista en los datos del ChIP-seq provenía de atascamiento en la fibra muscular.
Para determinar la contribución de otros tipos de células asociados con la fibra muscular a los resultados de ChIP-seq, determinamos las señales H3K27ac y Pol II en el gen Vcam1 que es activo en las células satélite del músculo y Pecam1, un marcador de células endoteliales de los vasos sanguíneos que riegan los músculos. En comparación a los niveles vistos en los genes de Des o Adssl1 , los niveles de H3K27ac y Pol II en los genes la Vcam1 y Pecam1 eran mucho menor (Figura 4A y figura 4). Las grandes diferencias en la señal por fibra muscular expresada genes en comparación con los expresados en los tejidos asociados indicaron que la señal en el ChIP de la cromatina preparada utilizando el protocolo descrito anteriormente viene predominante de enlace eventos en el fibra del músculo.
Figura 1: purificación de núcleos del músculo de ratón adulto. (A) lisados de tejidos obtienen por homogeneización mecánica (18.000 rpm, 45 s) y homogeneización dounce (30 golpes/3 min) fueron teñidas con azul de tripán y observados bajo un microscopio digital y capturaron imágenes con 20 aumentos. Barra de escala = 100 μm. (B) número de núcleos obtenidos con 500 mg de tejido (equivalente a 1 ratón) después de la preparación bajo las condiciones indicadas, 18.000 y 22.000 rpm de 15 a 45 s o 3 min de douncing. Barras de error representan la media ± SEM para n = 3 ratones homogeneización mecánica y n = 3 ratones de douncing. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: verificación del tamaño del fragmento de cromatina. Núcleos aislados fueron sonicados para 5, 10, 15 o 20 min como se indica. Después de reticulación y purificación, se evaluó el tamaño del fragmento de ADN por electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. M es marcador de tamaño de DNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: uso de la cromatina para ChIP-qPCR. (A) ratones fueron sometidos a inyecciones intra peritoneales de vehículo o dexametasona (10 mg/kg) y después de 1,5 h, la cromatina se preparó de los músculos de extremidades. El enriquecimiento en ChIP en genes de la blanco GR Redd1 y Murf1, comparado con el promotor de protamina de control negativo (Prm1), se indica como un % de entrada precipitada. (B) ChIP fue realizado para H3K27ac y IgG anticuerpos de control analizado en el promotor del Desmin y en comparación con una región intergénica control negativo. (C) Tead4 ChIP fue realizada en la cromatina de músculo de tipo salvaje y ratones knockout de músculo-específica Tead4 (Tead4skm-/-) y analizados en Tead4 sitios de Unión en los promotores Ccnd1 y Ifrd1 , en comparación con el región intergénica control. En todos los experimentos, la cromatina de los 3 ratones se agruparon y barras de error representan la media ± S.E.M del estudiante T-test para tres repeticiones técnicas. Valor de P < 0.001* *, < 0.0001 ***; NS, no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: perfiles genómicos de la cromatina de la fibra muscular. (A) imágenes de la University de California en Santa Cruz navegador de genoma de los loci indicados que ilustra las H3K27ac y Pol II niveles superiores en el gene de Desmin, altamente expresada en fibra muscular, en comparación con los genes Vcam1 y Pecam1 expresados en células de satélite y endotelial de las células, respectivamente. (B) imágenes UCSC de los loci indicados ilustrar atascamiento de Tead1 y Tead4, así como H3K27ac y Pol II, en cromatina de tipo salvaje (WT) muscular en comparación con la de Tead4skm-/- muscular (MT), donde la pérdida selectiva de Tead4 vinculante es observado. Los datos del ChIP-seq ilustrados están disponibles como GSE82193 en la base de datos GEO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de búfer | Composición | ||
| Tampón hipotónico | 10 mM HEPES-KOH (pH 7.3) | ||
| 10 mM de KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0.1% NP-40 | |||
| 0,1 mM PMSF (recientemente agregado) | |||
| Cóctel de inhibidor de la proteasa (foto) 1 x (recientemente agregado) | |||
| Buffer de sonicación | SDS 1% | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl de pH 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 0.1 el desoxicolato del sodio % | |||
| 1% Tritón X-100 | |||
| Recién añadido 0,1 mM PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| Tampón de dilución de chIP | 0.01% SDS | ||
| 1.1% Tritón X-100 | |||
| 1,2 mM EDTA | |||
| 16,7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| Recién añadido 0,1 mM PMSF | |||
| PIC 1 x | |||
| Tampón salino de baja | 0.1% SDS | ||
| 1% Tritón X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| Tampón salino alto | 0.1% SDS | ||
| 1% Tritón X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| Buffer de LiCl | 250 mM LiCl | ||
| 1% NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris HCl, pH 8 | |||
| Tampón de elución | SDS 1% | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| Tampón Tris-EDTA (TE) | 50 mM Tris HCl, pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
Tabla 1: Composición de búfer.
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Discussion
Aquí describimos un nuevo protocolo para la preparación de cromatina de músculo esquelético de ratón adulto y muestran que esta cromatina es conveniente para los experimentos de ChIP que detectan modificaciones covalentes de la histona y atascamiento del factor de transcripción en los núcleos de la fibra muscular. Este protocolo implica varios pasos críticos. El primero es tejido que se pueden realizar por corte mecánico o dounce. Corte mecánico es más rápido y más reproducible y por lo tanto es el método de elección. Sin embargo, si no se dispone de ningún aparato adecuado, la interrupción puede realizarse también por douncing, donde se recomienda la evaluación de la eficiencia de la lisis al microscopio antes de proceder a la etapa de fijación. Fijación de lisados de todo tejido, en lugar de fijación de núcleos aislados, permitió más reproducible sonicación en volúmenes más pequeños y de corta duración. También decidimos fijar los lisados después de la interrupción, en lugar de fijar el tejido antes de la interrupción, según lo descrito por Thomas et al. 10 la fijación el tejido resultó reducida eficiencia de homogeneización. Este protocolo basado en la mecánica de corte también es más rápido que otras soluciones propuestas, tales como la digestión de la colagenasa, que requieren incubación prolongada de los tejidos disecados en 37 ° C8. Durante este período, pueden ocurrir cambios en el atascamiento de gene expresión y transcripción factor. Fijar los núcleos tan rápido como sea posible, por tanto, es esencial captar más fielmente el estado fisiológico normal.
Un segundo paso fundamental es la depuración de los núcleos del fijo lisados. Para ello, secuencial de filtrado de la solución lisada fija, primero a través de un colador de celular de 70 μm para eliminar la suciedad más grande y luego a través de un tamiz de 40 μm celular para eliminar los residuos finos, evita estorbar los filtros y maximiza el rendimiento de los núcleos obtenidos. Una vez purificada por filtración, se sonicó núcleos y del tamaño del fragmento de ADN determinado después de reticulación. Una preparación típica de las dos extremidades traseras de un ratón produce 100 μg de cromatina. Agrupación de los lisados de ratones hasta 3 puede mejorar el rendimiento al reducir las pérdidas durante la preparación. Este procedimiento es eficiente ya que permite la recuperación de hasta el 75% de la DNA genomic como cromatina (datos no mostrados).
ChIP de experimentos diseñados para evaluar atascamiento del factor de transcripción y las modificaciones epigenéticas demostraron la conveniencia del presente Protocolo para el estudio de regulación de los genes en los núcleos de la fibra muscular. Fuertes y robustas señales de ChIP-seq para Pol II y H3K27ac se obtuvieron de la cromatina, que permite la identificación de la fibra del músculo genes de identidad por su distintivo H3K27ac y Pol II perfiles7. Mucho mayores niveles de H3K27ac y Pol II de genes fuertemente expresados en los núcleos de la fibra, en comparación con los genes expresados en satélite o las células endoteliales, demostraron que la señal vino predominante de los núcleos de la fibra. Esto fue confirmado también por la pérdida de la señal del ChIP Tead4 con cromatina de ratones donde se inactivó específicamente en las fibras musculares. Sin embargo, más débil, pero claramente por encima de las señales de fondo, porque pueden detectar marcadores de célula satélite como Vcam1, Pax7 (datos no mostrados) mostrando que la cromatina de estas células también está presente. Esperamos que nuestro protocolo debería ser conveniente para otras técnicas que utilizan el formaldehído-fija la cromatina como C 3/4 C y técnicas de captura de conformación de la cromatina de HiC. Uso de nuestro protocolo para combinar que chip-seq para factores de transcripción y las modificaciones de la cromatina con captura de la conformación de la cromatina en el futuro permitiría una comprensión detallada del gene de mecanismos reguladores en la fibra muscular y cómo éstos pueden regularse o malestar por estímulos fisiológicos, como ejercicio, ayuno, una dieta alta en grasas, denervación, o en la enfermedad, mediante el uso de preparados genéticamente a partir de la cromatina ratones reproducir enfermedades como X-ligado centronuclear myopathy14.
En Resumen, este protocolo de bajo costo y eficiente permite el aislamiento de los núcleos de fibra muscular que puede ser sonicada inmediatamente o congeladas a-80 ° C para su uso ulterior. Uso de cromatina preparada por este protocolo ha proporcionado los primeros datos de ChIP-seq amplia de genoma de fibra del músculo7 y facilitará los estudios futuros sobre regulación génica en este tejido.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a todo el personal de la planta de secuenciación de alto rendimiento IGBMC, miembro del consorcio "Francia Génomique" (ANR10-INBS-09-08) y todos los servicios generales de IGBMC en particular el personal de la instalación animal IGBMC. Este trabajo fue financiado por becas del CNRS, INSERM, la AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, los franceses del estado fondo a través de la ANR en el programa Investissements Avenir con ANR-10-IDEX-0002-02, la empresa Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 y la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. S.J fue apoyado por la Ligue Nationale contre le cáncer de la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 y V.U por el Ministère de l ' enseignement et de la Recherche. ID es un 'équipe labellisée' de la Ligue Nationale contre le cáncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
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