Summary
此 step-by 步骤协议使用自动缸系统来分析果蝇的负 geotaxis 行为, 它承载数以百计的苍蝇并使其动作与电动机同步。在同步时, 采用自行设计的 RflyDetection 软件对飞行负 geotaxis 行为进行检测、数字记录和分析。
Abstract
神经退行性疾病往往与运动能力的逐渐丧失, 缩短寿命, 和年龄相关的神经。为了了解这些细胞事件的机制, 以及它们之间的因果关系,果蝇, 用其复杂的遗传工具和多样的行为特征, 作为疾病模型来评估神经退行性表型。在这里, 我们描述了一个高通量的方法来分析果蝇成人负 geotaxis 行为, 作为可能的运动缺陷的迹象, 与神经。一个自动化的机器是设计和开发, 以驱动飞行同步使用最初的电脉冲, 后来允许记录的负 geotaxis 行为的过程中秒到分钟。然后用自行设计的 RflyDetection 软件对数字记录的视频图像进行统计处理。不同于基于单飞的人工控制的负 geotaxis 检测, 这种精确、快速和高通量的协议允许同时获取超过数百个苍蝇的数据, 提供了一种有效的方法来推进我们与神经相关的运动缺陷的基本机制的理解。
Introduction
为分析果蝇的成人攀爬行为制定了各种协议和方法。比较费力的是, 传统的分析主要涉及将一只苍蝇放入单个小瓶中, 并使用手动的力量来为同步1,2,3,4。这是单调乏味和费时, 不适合大规模高通量的研究, 并有潜在的变化, 手动力量, 用来打击苍蝇以及其他限制。为了改进这种检测, 我们开发了一种快速的迭代负 Geotaxis (环) 试验, 它允许高通量分析在同一时间的大量苍蝇5。然而, 该检测仍需要人工施加力来同步飞行动作。我们的版本的环化验, 修订后, 先前的化验, 包括一个金属基地承载多个装有苍蝇的小瓶自动控制由电机驱动飞行同步6。录音后, 同步后立即爬升, 然后使用自行设计的软件进行分析。我们的自动环试验已经消除了繁琐和 labor-intensive 的过程, 收集数据从一个单一的苍蝇, 一次一个, 并使数据采集过程更有效。此外, 在一些研究中使用了自动环法来阐明阿尔茨海默氏症和帕金森病的发病机制, 并以高效率的方法验证了7,8,9.
在本文中, 我们演示了使用DDC-Gal4驱动的 rna 干扰飞行的自动环检测。DDC-Gal4是在多巴胺能 (DA) 和素神经元中特别表达的 Gal4 线, 因此它代表了分析与神经10相关的运动缺陷的靶基因效应的一个很好的工具。此外, 我们还合并了UAS-Dicer2, 这是一条提高 rna 干扰效率的飞行线, 用于生成UAS-Dicer2;DDC-Gal4工具行。我们选择使用的 rna 干扰的苍蝇是auxilin (辅助) 的 rna 干扰 v16182 (auxR16182), 一个我们先前确定的基因, 以展示对飞行运动活动的影响8。auxGFP苍蝇也准备用于分析在辅助上的效果. 我们将展示如何使用自动环法测量苍蝇负 geotaxis, 提出结果, 并讨论从结果获得的任何影响。
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Protocol
1. 飞集
- 在标准飞行食物上保持苍蝇在25和 #176; C、70% 湿度和 12 h/12 h 光/暗循环.
- 收集 UAS-Dicer2;DDC-GAL4 飞行 virginsunder 二氧化碳 (CO 2 ) 麻醉.
- 将这些处女带到2天大的成年雄蝇携带以下基因型: UAS-mCD8GFP (控制), auxR 16182 ( 辅助 干扰) , auxGFP ( 辅助 干扰), 和 auxR 16182 ;auxGFP (抢救), 与男性: 女性比率为 1:2.
- 分别为每个组和 #160;p er 实验收集新 eclosed 的雄性和雌性小瓶, 每只普通的苍蝇小瓶中放置10只苍蝇, 标准食物在和 #160; 25 和 #176; C.
- 根据实验, 将收集的苍蝇保持35天, 并将其用于5、15、25和35天的自动环分析.
2。自动环形检测
- 将每种基因型的10只收集的苍蝇 (中性) 转移到每个小瓶中, 然后用螺钉固定药瓶。分析控制苍蝇和苍蝇携带不同基因型一起为每组实验 (最多10瓶同时, 每瓶10只苍蝇).
- 打开放置在设备前面的数码相机, 一旦苍蝇都装好就开始录音.
- 在允许1分钟的苍蝇以小瓶结算后, 打开控制步骤驱动程序的步骤控制器; 这将驱动小型电动机控制连接的拉杆, 使其在2秒内连续上升并轻拍设备4次。请参见 图 1 。
- 敲击后, 请注意, 苍蝇开始爬上墙。确保录制继续进行.
- 在3到5连续的试验中重复步骤2.3 中描述的60秒间隔中的同步.
- 重复试验5、15、25和35天的老苍蝇。每组至少进行3项独立实验, 每次试验至少30只收集的苍蝇 (3 瓶).
3。数据分析
- 将录制的视频导入计算机.
- 在敲击后6秒拍摄视频的快照, 用于每个试用版.
- 将快照映像导入 RflyDetection 软件 (请参见 图 2 ), 使用 #39; 文件和 #39; 菜单.
- 通过使用工具栏上的基线图标, 然后使用光标标记图像上的上、下基线, 精确设置小瓶的上下基线.
- 输入每瓶的苍蝇数 (, 如 , 10 在这里) #39; 飞在矩形和 #39; 在和 #39 中的字段和瓶长 (, 如 , 14 厘米); 管高度和 #39; 设置栏中的字段。
- 请注意, 每个小瓶都在屏幕上检测到各个飞行位置并标记有点.
注意: 图 2 指示所有菜单按钮单击的位置.
- 请注意, 每个小瓶都在屏幕上检测到各个飞行位置并标记有点.
- 注意, 软件自动确定每只苍蝇的爬升距离, 并在右侧面板的表格中显示每瓶10只苍蝇的平均值。(请参见 图 2 )
- 使用统计软件 ( 如 、棱镜) 处理爬数, 以进行进一步的统计分析.
- 将数据显示为平均值和 #177; SEM.
- 计算 p 值的重要性 (用星号、* p 和 #60; 0.05、 p 和 #60; 0.01、*** p 和 #60; 0.001) 使用 one-way 方差分析 Bonferroni 多项比较试验.
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Representative Results
本文说明了在评估苍蝇负 geotaxis 行为的使用自动环法。与以前的环分析不同的是, 我们的检测包括一个自动装置, 它提供了一种同步飞行动作的电动力量, 并同时对数以百计的苍蝇进行解析 (图 1)。分析了Dicer2;DDC 和 #62; auxR16182 苍蝇在6秒的时间内显示出在攀爬距离上的年龄依赖性下降, 这表明在 DA 神经元中, 辅助表达对飞行活动是至关重要的. 在 da 神经元中, 攀爬能力似乎不会受到auxGFP过度表达的影响, 而 da 神经元中的auxR16182 和auxGFP的表达则救出了 rna 干扰表型 (图 2和图 3)。除了验证自动环法作为高通量和有效的方法来评估与 DA 神经元变性相关的运动缺陷外, 这些结果还表明, 这种自动化的方法有助于识别潜在帕金森病的危险因素, 并提供了他们的神经退行性功能的线索。
图1。自动环形装置.(A和B) 设备的前后视图: 插座 (1), 立式钢杆 (2), 固定在车架 (3) 上的管子, 透明塑料瓶 (4), 泡沫棒 (5), 金属底座 (6), 微步驱动 (7), 电子控制器 (8),开关 (9), 小电机 (10), 和杠杆连接到小电机 (11)。长方形金属框架的大小是 46 cm x 26 cm x 16 cm, 藏品10透明塑料瓶 (2.1 cm 在直径, 14.5 cm 在高度) 巩固用螺丝。要打开仪器, 首先点击开关 (9), 打开 (8), (7), 和 (10) 因此。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。RflyDetection 的典型快照图像分析.将快照图像导入到 RflyDetection 软件中, 并在该接口上的每个图标上都显示了右侧有文本的操作。在设置了顶部和底部基线后, 软件会自动检测并标记小瓶内的飞行位置。每只苍蝇的爬升距离 (cm) 为6秒, 每个小瓶的平均值都显示在表中。然后将这些数字输入统计软件, 以便进行进一步的统计分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。在 DA 神经元中, 当辅助表达式为 downregulated 时, 统计条形图显示了随年龄的下降而上升的能力.采用自动环法分析了携带以下基因型的果蝇的负 geotaxis 行为: auxR16182/+ (无 Gal4), UAS-Dicer2;DDC-Gal4苍蝇越过w1118 (控制)、 UAS-mCD8GFP (控制)、 auxR16182、auxGFP和auxR16182; auxGFP (抢救)。请注意, 随着时间的推移, 当辅助表达式在 DA 神经元中减少时, 雄性和雌性果蝇的速度明显减慢. 在重新引入辅助表达式时, 会救出运动缺陷. 对5、15、25和35天的苍蝇进行了评估。雄性 (A) 和雌性 (B) 苍蝇分别显示。在右侧显示与不同条形颜色对应的基因型标签的图例。数据显示为平均± SEM. p-意义值 (用星号表示, * p和 #60; 0.05, ** p 和 #60; 0.01, ** p 和 #60; 0.001, ns: 没有意义, 在星号下面绘制了一个条形图来指示对象 比较) 计算比较mCD8GFP控件或辅助 rna 干扰, 使用 one-way 方差分析与 Bonferroni 多比较测试. 请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里描述的自动环分析可以同时对数以百计的苍蝇的飞行负 geotaxis 行为进行高通量研究。以前的分析成人攀登的策略涉及单个小瓶中单飞的观察, 而苍蝇的位置则由眼睛手动检测。这个相当繁琐的过程有时可能会导致对数据的误读或误解, 以及 labor-intensive 的工作。我们的自动环分析从一个简单的点击开始, 该仪器自动同步和评估高达100苍蝇的攀登能力。电同步提供了更精确的控制时间和其他参数的方法, 因此可以仔细地测量飞行成人攀爬过程的总体捕获。
接下来, 利用我们自行设计的 RflyDetection 软件, 可以确定准确的飞行位置。该软件考虑到整个2D 小瓶面积 (由矩形框架确定), 和顶部和底部基线, 在获得位置的所有苍蝇在指定区域内, 并提出他们作为点。此外, 对爬升距离和平均值的自动计算使得数据的处理变得更快、更容易。在一个合理的时间框架7,8,9中,可以振振有词地收集和分析一大群苍蝇的数据集。
尽管这里描述了与神经相关的攀岩活动的年龄依赖性下降, 但这种方法同样有效地分析了与发育缺陷相关的运动活动。为此, 自动环法是一种有效的方法来分析果蝇阴性 geotaxis 在任何成人阶段, 并在正常或病理状态的大脑功能。尽管如此, 尽管 RflyDetection 软件能够手动识别任何意外的 uncaptured, 但该检测方法在完全分析所有苍蝇方面的应用有限。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢布卢明顿股票中心和维也纳的果蝇的飞行股票 rna 干扰中心。该设备的专利属于中国科学院上海市先进研究院。对 RflyDetection 软件的要求应由富煌 (见作者名单)。这项工作得到了中国国家基础研究项目 (973 项目 2013CB945602) 和中国国家自然科学基金 (31270825 和 31171043) 的资助。我们感谢何议员的讨论和意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
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