Summary
Dit stapsgewijze protocol analyseert Drosophila negatieve geotaxis gedrag met behulp van een geautomatiseerd systeem van meerdere cilinders die honderden vliegen en synchroniseert hun optreden door een elektromotor. Bij synchronisatie, is vliegen negatieve geotaxis gedrag vehiculumcontrolegroep, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van de zelf ontworpen RflyDetection software.
Abstract
Neurodegeneratieve aandoeningen worden vaak geassocieerd met een progressief verlies van beweging vermogen, verminderde levensduur en leeftijd-afhankelijke neurodegeneratie. Om te begrijpen van het mechanisme van deze cellulaire gebeurtenissen en hun causale relaties met elkaar, Drosophila melanogaster, met zijn verfijnde genetische tools en diverse gedrags functies, worden gebruikt als ziekte modellen voor de beoordeling van neurodegeneratieve fenotypen. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor het analyseren van Drosophila volwassen negatieve geotaxis gedrag, als indicatie voor de mogelijke motor gebreken neurodegeneratie is gekoppeld. Een geautomatiseerde machine is ontworpen en ontwikkeld tot vliegen synchronisatie station met behulp van een eerste elektrische impuls, waardoor later de opname van negatieve geotaxis gedrag in een loop van seconden tot minuten. Beelden van de video-digitaal opnamen worden vervolgens verwerkt met de zelf ontworpen RflyDetection software om statistische gegevens te manipuleren. Anders dan de bepaling van de handmatig gecontroleerde negatieve geotaxis op basis van één vliegen, dit nauwkeurige, snelle en hoge-doorvoer protocol staat data-acquisitie van meer dan honderden vliegen tegelijk, bieden een efficiënte aanpak om vooraf onze inzicht in het onderliggende mechanisme van motorische tekorten neurodegeneratie is gekoppeld.
Introduction
Een scala aan protocollen en methoden zijn ontwikkeld voor het analyseren van Drosophila volwassen klimmen gedrag. Nogal moeizaam, de traditionele analyse meestal gaat brengen van een interne vlieg in een individuele flesje en maakt gebruik van een handmatige kracht te vliegen naar beneden boren voor synchronisatie1,2,3,4. Het is vervelend en tijdrovend, ongeschikt voor grote high-throughput studies, en mogelijke variaties van de handmatige kracht gebruikt om de kraan naar beneden de vliegen evenals andere beperkingen heeft. Ter verbetering van de bepaling, werd een snelle iteratieve negatieve Geotaxis (RING) test ontwikkeld waardoor high-throughput analyse over talrijke vliegen op de dezelfde tijd5. De bepaling vereist echter nog steeds een handmatig om kracht te synchroniseren vliegen actie. Onze versie van de RING assay, herzien op de vorige assay, bevat een metalen base hosting meerdere vliegen-bevattende flesjes automatisch gecontroleerd door een elektromotor om te vliegen synchronisatie6rijden. Bij opname, de vlieg klimmen onmiddellijk na de synchronisatie is geregistreerd dan geanalyseerd met behulp van een zelf ontworpen software. Onze geautomatiseerde RING assay heeft geëlimineerd de vervelende en arbeidsintensieve proces in het verzamelen van gegevens uit een enkele fly, een tegelijk, en de data-acquisitie proces efficiënter ingeschakeld. Daarnaast is de geautomatiseerde RING assay werkzaam zijn in een aantal studies het ophelderen van het mechanisme onderliggende ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson's, het valideren van de aanpak met hoog rendement7,8,9 .
In dit artikel tonen we de geautomatiseerde RING bepaling met behulp van de DDC-Gal4 gedreven RNAi vliegen. DDC-Gal4 is een Gal4 lijn speciaal uiten in Dopaminerge (DA) en serotonerge neuronen, aldus vertegenwoordigt een geweldig hulpmiddel voor het analyseren van de doel-gen effecten geassocieerd met motorische tekorten begeleidende neurodegeneratie10. Daarnaast nemen we UAS-Dicer2, een vlieg lijn die RNAi efficiëntie verbetert, voor het genereren van de UAS-Dicer2; DDC-Gal4 gereedschap lijn. Het RNAi vliegen we kiezen om te gebruiken is de auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), een gen die wij hebben eerder aangeduid als u wilt vertonen een effect op motorische activiteit8vliegen. auxGFP vliegen zijn ook bereid voor het analyseren van de gevolgen voor de aux overexpressie. We zullen laten zien hoe met de automatische bepaling van de RING te meten vliegen negatieve geotaxis, de resultaten presenteren en bespreken eventuele consequenties van de resultaten verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vliegen collectie
- handhaven de vliegen op standaard vliegen voedsel bij 25 ° C, luchtvochtigheid van 70%, en een 12/12 uur licht/donker cyclus.
- Verzamelen UAS-Dicer2; DDC-GAL4 vliegen virginsunder kooldioxide (CO 2) verdoving.
- Steken deze maagden naar 2 dag oud volwassen mannelijke vliegen de volgende genotypen uitvoering: UAS-mCD8GFP (control), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux overexpressie), en auxR 16182; auxGFP (redden), met een man: vrouw verhouding van 1:2.
- Apart verzamelen nieuw eclosed mannetjes en vrouwtjes in 3 flesjes voor elke groep per experiment, 10 vliegen te plaatsen in elke regelmatig vliegen flesje met standaard voedsel op 25 ° C.
- Afhankelijk van het experiment, houd de verzamelde vliegt tot 35 dagen en ze gebruiken voor automatische analyse van de RING op dag 5, 15, 25 en 35.
2. Geautomatiseerde RING Assay
- Transfer 10 verzamelde vliegen (unisex) per genotype in elk ampul, dan beveiligen de flacon met een schroef. Analyseren van controle vliegen en vliegen uitvoering van verschillende genotypen samen voor elke set van experimenten (t/m 10 flesjes gelijktijdig, 10 vliegen in elk flesje).
- Zet de digitale camera voor het apparaat geplaatst en start de opname eenmaal vliegen zijn alle geladen en klaar.
- Na 1 min. voor vliegen te vestigen in flesjes, zet de stap controller waarmee de bestuurder stap; dit schijven de kleine elektrische motor waarmee de hendel gekoppeld, zodat het opeenvolgend stijgt en het apparaat 4 keer in 2 kranen s. Zie Figuur 1.
- Na te tikken, er rekening mee dat de vliegen beginnen te stijgen van de muur. Zorgen dat opname blijft.
- De synchronisatie zoals beschreven in stap 2.3 in 60-s interval voor opeenvolgende trials van 3 tot en met 5 herhalen.
- Herhaal het experiment voor 5, 15, 25 en 35 dagen oude vliegen. Uitvoering van ten minste 3 onafhankelijke experimenten voor elke groep, elk experiment met ten minste 30 verzamelde vliegt (3 flesjes).
3. Data-analyse
- de video-opnamen in de computer importeren.
- Een momentopname van de video op 6 s na te tikken, voor elk afzonderlijk experiment.
- De momentopname afbeelding importeren in de software van RflyDetection (Zie Figuur 2), met behulp van de ' bestand ' menu.
- De bovenste en onderste basislijnen van de flacon juist met behulp van de basislijn-pictogram op de werkbalk en vervolgens de cursor ter gelegenheid van de basislijnen van het bovenste en onderste op de afbeelding instellen.
- Het aantal vliegen per flacon (bijv, 10 hier) ingevoerd de ' Flys in rect ' veld en flacon lengte (b.v. 14 cm hier) in de ' buis hoogte ' veld aan de balie van de instellingen.
- Opmerking dat de individuele fly posities ontdekt en gelabeld met puntjes op het scherm voor elke flacon.
Opmerking: Figuur 2 geeft de standpunten van alle menu knop klikken.
- Opmerking dat de individuele fly posities ontdekt en gelabeld met puntjes op het scherm voor elke flacon.
- Nota van dat de software automatisch de klimmen afstand voor elke fly bepaalt en de gemiddelde waarden van 10 vliegen in elk flesje in een tabel aan de rechterzijde geeft. (Zie Figuur 2)
- Het klimmen nummer met statistische software (b.v., Prism) voor verdere statistische analyse verwerken.
- Dit moment de gegevens als ± SEM. betekenen
- Berekenen van de p-waarden van belang (aangegeven met sterretjes, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.001) met one-way ANOVA met Bonferroni meerdere vergelijking test
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel demonstreert het gebruik van een automatische bepaling van de RING bij de beoordeling van vliegen negatieve geotaxis gedrag. In tegenstelling tot de vorige RING assay, onze assay bevat een geautomatiseerde apparaat dat voorziet in een elektrische kracht om te synchroniseren van vliegen actie en tot honderden vliegen analyseert gelijktijdig (Figuur 1). Analyse van Dicer2; DDC > auxR16182 vliegen toonde een leeftijd-afhankelijke daling in de klimmen afstand in een tijdsbestek van 6-s voor zowel mannelijke als vrouwelijke vliegt, suggereren dat aux expressie in DA neuronen cruciaal voor vliegen motorische activiteit is. Klimvermogen lijkt niet te worden beïnvloed op auxGFP overexpressie in DA neuronen en co uitdrukking van auxR16182 en auxGFP in DA neuronen gered het RNAi fenotype (Figuur 2 en Figuur 3). Naast het valideren van de automatische bepaling van de RING als een high-throughput en efficiënte aanpak voor de beoordeling van motorische defecten DA neuron degeneratie is gekoppeld, blijkt deze resultaten ook dat deze geautomatiseerde aanpak nuttig in het identificeren van potentieel De ziekte van Parkinson risico factoren en geeft een aanwijzing over hun neurodegeneratieve functie.
Figuur 1. Het geautomatiseerde RING apparaat. (A en B) voorzijde en achterzijde uitzicht op het apparaat: socket (1), verticale stalen staaf (2), een schroef voor het beveiligen van de buis op het frame (3) transparant plastic flesjes (4), schuim bar (5), metalen basis (6), de micro-stap driver (7), de elektronische regelaar (8), de schakelaar (9), kleine elektromotor (10), en de hendel aangesloten op de kleine elektromotor (11). De grootte van de rechthoekige metal frame is 46 cm × 26 cm × 16 cm, houden van 10 doorzichtige plastic flesjes (2.1 cm diameter, hoogte 14,5 cm) beveiligd met schroeven. Om te schakelen op het apparaat, klikt u eerst in op de switch (9), die draait op (8), (7), en (10) derhalve. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Analyse van een vertegenwoordiger momentopname beeld door RflyDetection. Momentopname afbeelding wordt geïmporteerd in de RflyDetection-software en actie voor elk pictogram op het grensvlak wordt aangegeven met de tekst aan de rechterkant. Na het instellen van de boven- en onderkant basislijnen, de software automatisch detecteert en markeert het standpunt van de vliegen in het flesje. De klimmen afstand (cm) in 6 s voor elke fly en de gemiddelde waarden voor elke flacon worden weergegeven in een tabel. Deze nummers worden vervolgens geïmporteerd in de statistische software voor verdere statistische analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Statistische staafdiagrammen tonen een daling van de leeftijd afhankelijke vliegen klimmen vermogen als aux expressie werden in DA neuronen is. De automatische bepaling van de RING werd gebruikt voor het analyseren van de negatieve geotaxis gedrag voor de uitvoering van de volgende genotypen vliegen: auxR16182/ + (geen Gal4), UAS-Dicer2; DDC-Gal4 vliegen gekruist w1118 (control), UAS-mCD8GFP (control), auxR16182, auxGFPen auxR16182; auxGFP (redding). Merk op dat zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen klom aanzienlijk langzamer na verloop van tijd wanneer aux expressie in DA neuronen werd verminderd. De motorische tekorten werden gered op herinvoering van aux expressie. Vliegt van 5, 15, 25 en 35 dagen oude werden beoordeeld. (A) mannelijke en vrouwelijke (B) vliegen worden afzonderlijk weergegeven. Legenden met genotype labels overeenkomen met verschillende kleuren worden weergegeven aan de rechterkant. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. p-waarden van belang (aangegeven met sterretjes, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns: geen betekenis, een bar was onder de sterretjes om aan te geven van de objecten getrokken Vergelijk) werden berekend naar het mCD8GFP -besturingselement of aux RNAi one-way ANOVA met Bonferroni meerdere vergelijkingstest vergelijken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De geautomatiseerde RING test hier beschreven maakt een analyse van de high-throughput van vliegen negatieve geotaxis gedrag voor honderden vliegen gelijktijdig. Eerder bestaande strategieën voor het analyseren van volwassen klimmen opmerkingen van een enkele vliegen in een individuele flesje betrekken en vliegen positie handmatig wordt gedetecteerd met het blote oog. Deze nogal vervelend proces kan soms verkeerd lezen of verkeerde interpretatie van gegevens, alsook arbeidsintensief werk. Onze geautomatiseerde RING test begint met een simpele klik, en het apparaat automatisch wordt gesynchroniseerd en beoordeelt klimmen vermogen van maximaal 100 vliegen. De elektrische synchronisatie de mogelijkheid biedt een nauwkeuriger controle tijd en andere parameters, zodat het totale vastleggen van vliegen volwassen klimmen proces nauwkeurig kan worden gemeten.
Vervolgens met onze zelf ontworpen software van de RflyDetection, kan de exacte vliegen positie worden geïdentificeerd. De software neemt in overweging de algehele 2D flacon gebied (bepaald door het rechthoekig frame) en de boven- en onderkant basislijnen, voor het verwerven van posities voor alle vliegen binnen het aangewezen gebied en presenteert ze als stippen. Bovendien, kunt de automatische berekening van de klimmen afstand en gemiddelde waarden sneller en gemakkelijker gegevensmanipulatie. Verzamelingen van gegevens over een grote groep van vliegen kan aannemelijk worden verzameld en geanalyseerd binnen een redelijk tijdsbestek7,8,9.
Hoewel een leeftijd afhankelijke daling van de klimmen activiteit gekoppeld neurodegeneratie is beschreven hier, deze test is even effectief bij het analyseren van de motorische activiteit relevant zijn voor ontwikkelingsstoornissen gebreken. Te dien einde is de automatische bepaling van de RING een nuttige en efficiënte aanpak voor het analyseren van Drosophila negatieve geotaxis in elke volwassen stadium en in hetzij de normale of pathologische toestand van hersenfunctie. Toch heeft de bepaling beperkt gebruik in volledig analyseren alle vliegen ondanks de RflyDetection-software de mogelijkheid om handmatig identificeren een per ongeluk ontluchtingen degenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de Bloomington voorraad Center en de Vienna Drosophila RNAi Center voor vliegen voorraden. Het octrooi voor het RING-apparaat behoort tot Shanghai Advanced Research institute, Chinese Academie van Wetenschappen. Aanvragen voor de RflyDetection-software moet worden gedaan om Fu-de Huang (Zie Auteur lijst). Dit werk werd gesteund door subsidies van nationale Basic Research programma van China (973 programma 2013CB945602) en nationale Natural Science Foundation van China (31270825 en 31171043). Wij danken Ho lab leden voor discussie en commentaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
