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Behavior

Eine automatisierte rasche Iterative Negative Geotaxis Assay für die Analyse von Erwachsenen Klettern Verhalten in einem Drosophila -Modell der Neurodegeneration

Published: September 12, 2017 doi: 10.3791/56507
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4,5, 1,2,3
* These authors contributed equally

Summary

Dieses schrittweise Protokoll analysiert Drosophila negative Geotaxis Verhalten mit einem automatisierten Multi-Zylinder-System, das beherbergt hunderte von fliegen und synchronisiert ihre Aktion durch einen Elektromotor. Bei der Synchronisation ist fliegen negative Geotaxis Verhalten untersucht, digital erfasst und analysiert mit Hilfe der selbst entworfenen RflyDetection-Software.

Abstract

Neurodegenerative Erkrankungen gehen häufig einher mit einem fortschreitenden Verlust der Bewegungsfähigkeit, reduzierten Lebensdauer und altersabhängigen Neurodegeneration. Um zu verstehen, den Mechanismus dieser zelluläre Ereignisse und ihre kausale Beziehungen zueinander, Drosophila Melanogaster, mit seiner genetischen Spezialtools und vielfältige Verhaltensstörungen Funktionen, Krankheitsmodelle für die Beurteilung dienen als Neurodegenerative Phänotypen. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur Drosophila Erwachsene negative Geotaxis Verhalten, als Hinweis auf mögliche motor Mängel verbunden mit neurodegenerativen Erkrankungen zu analysieren. Eine automatische Maschine konzipiert und entwickelt für Antrieb fliegen Synchronisierung verwenden einen ersten elektrischen Impuls, so dass später die Aufnahme der negative Geotaxis Verhalten über einen Verlauf von Sekunden bis Minuten. Bilder von Digital aufgenommenen Videos werden dann mit der selbst gestalteten RflyDetection-Software für statistische Datenmanipulation verarbeitet. Anders als die manuell gesteuerte negative Geotaxis Assay basierend auf Fliege, präzise, schnell und Hochdurchsatz-Protokolls ermöglicht Datenerfassung von mehr als Hunderte von fliegen, gleichzeitig eine effiziente Herangehensweise voraus unsere Verständnis in den zugrunde liegenden Mechanismus der motorischen Defizite verbunden mit neurodegenerativen Erkrankungen.

Introduction

Eine Vielzahl von Protokollen und Methoden wurden für die Analyse von Drosophila Erwachsenen Klettern Verhalten entwickelt. Eher mühsam, die traditionelle Analyse meistens geht es darum eine Fliege in einem einzelnen Fläschchen und nutzt eine manuelle Kraft zu fliegen nach unten für Synchronisation1,2,3,4Tippen Sie auf. Es ist mühsam und zeitraubend, ungeeignet für große Hochdurchsatz-Studien und Variationsmöglichkeiten der verwendet, um die fliegen sowie andere Einschränkungen Tippen Sie auf manuelle Kraft hat. Um den Test zu verbessern, wurde ein schnelle Iterative Negative Geotaxis (RING) Assay entwickelt die Hochdurchsatz-Analyse über zahlreiche fliegen in der gleichen Zeit5ermöglicht. Der Test erfordert jedoch noch eine manuell auszuüben Kraft zu fliegen Aktion synchronisiert. Unsere Version des RING-Assays, überarbeitet nach der vorherigen Test enthält eine Metallbasis mehrere fliegen-haltigen Fläschchen automatisch gesteuert durch einen Elektromotor fliegen Synchronisation6fahren hosten. Bei der Aufnahme, die Fliege, die Besteigung sofort nach einer Synchronisation dann aufgezeichnet wird mit eine selbst entworfene Software analysiert. Unsere automatisierten RING-Assay hat eliminiert die mühsamen und arbeitsaufwändiger Prozess bei der Erhebung von Daten aus einer Fliege, einzeln nacheinander, und aktiviert die Datenerfassung effizienter. Darüber hinaus ist der automatisierte RING-Test in einer Reihe von Studien klären Mechanismus zugrunde liegenden Alzheimer und Parkinson, Validierung des Ansatzes mit hohem Wirkungsgrad7,8,9 beschäftigt .

In diesem Artikel zeigen wir die automatisierte RING-Assay mit DDC-Gal4 getrieben RNAi fliegen. DDC-Gal4 ist eine Gal4-Linie, die speziell mit dem Ausdruck (DA) dopaminergen und serotonergen Neuronen, stellvertretend für ein großartiges Werkzeug für die Analyse der Ziel-gen Auswirkungen im Zusammenhang mit motorischen Defizite begleitenden Neurodegeneration10. Darüber hinaus integrieren wir UAS-Dicer2, eine Fliegenschnur, die RNAi-Effizienz, um die FH-Dicer2 generieren erhöht; DDC-Gal4 Werkzeug Linie. Die RNAi fliegen wir wählen zu verwenden ist die Auxilin (Aux) RNAi v16182 (AuxR16182), ein Gen, das wir zuvor identifiziert haben, um einen Effekt auf ausstellen fliegen lokomotorische Aktivität8. AuxGFP fliegen sind auch bereit, für die Analyse von Auswirkungen auf die Aux -Überexpression. Wir zeigen, wie Sie mithilfe den automatisierten RING-Test messen fliegen negative Geotaxis, präsentieren die Ergebnisse und Auswirkungen gewonnenen Ergebnisse zu diskutieren.

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Protocol

1. fliegen Sammlung

  1. die fliegen auf standard fliegen Essen bei 25 ° C, 70 % Luftfeuchtigkeit und einer 12 h/12 h hell/dunkel-Zyklus zu erhalten.
  2. Sammeln FH-Dicer2; DDC-GAL4 fliegen Virginsunder Kohlendioxid (CO 2) Anästhesie.
  3. Überqueren Sie diese Jungfrauen auf 2 Tage alten erwachsenen männlichen fliegen tragen die folgenden Genotypen: FH-mCD8GFP (Kontrolle), AuxR 16182 (Aux RNAi) AuxGFP (Aux Überexpression), und AuxR 16182; AuxGFP (retten), mit einem Mann: weibliches Verhältnis von 1:2.
  4. Separat sammeln neu geschlüpften Männchen und Weibchen in 3 Fläschchen für jede Gruppe pro Experiment, indem 10 fliegen in jedes normale fliegen Fläschchen mit standard-Food bei 25 ° c
  5. Je nach dem Experiment, halten Sie die gesammelten fliegt bis zu 35 Tage und nutzen sie für automatisierte Analyse der RING am Tag 5, 15, 25 und 35.

2. Automatisierte RING Assay

  1. Transfer 10 gesammelten fliegen (Unisex) pro Genotyp in jedes Fläschchen, dann das Fläschchen mit einer Schraube sichern. Kontrolle fliegen und fliegen mit verschiedenen Genotypen zusammen für jeden Satz von Experimenten zu analysieren (bis zu 10 Ampullen gleichzeitig 10 fliegen in jedes Fläschchen).
  2. Schalten Sie die Digitalkamera vor dem Gerät platziert und Aufnahme einmal fliegen sind alle geladen und schussbereit.
  3. Nach Abzug 1 min für fliegen in Fläschchen zu begleichen, schalten Sie die Schritt-Steuerung, die den Schritt Treiber steuert, das treibt den kleinen Elektromotor steuern den Hebel befestigt, so dass es nacheinander erhebt sich und das Gerät 4 Mal in 2 klopft s. Siehe Abbildung 1.
    1. Nach dem Abstich, beachten Sie, dass die fliegen an die Wand zu steigen beginnen. Sicherzustellen, dass die Aufnahme wird fortgesetzt,.
  4. Wiederholen Sie die Synchronisierung wie unter Punkt 2.3 in 60 s-Intervall für 3 bis 5 aufeinander folgende Versuche beschrieben.
  5. Wiederhole das Experiment für 5, 15, 25 und 35 Tage alten fliegen. Mindestens 3 unabhängige Experimente für jede Gruppe, jedes Experiment mit mindestens 30 gesammelten fliegt (3 Ampullen).

3. Analyse der Daten

  1. aufgenommene Videos in den Computer zu importieren.
  2. Einen Schnappschuss des Videos bei 6 s nach dem Abstich, für jeden Versuch.
  3. Das Snapshotbild in die RflyDetection-Software importieren (siehe Abbildung 2), mit der ' Datei ' Menü.
  4. Festgelegten der oberen und unteren Grundlinien des Fläschchens genau mithilfe der Baseline-Symbol auf der Symbolleiste und dann mit dem Cursor, markieren Sie die obere und untere Baselines auf das Bild.
  5. Geben Sie die Anzahl der fliegen pro Vial (z. B. 10 hier) in der ' Flys in Rect ' Feld und Vial Länge (z. B. 14 cm hier) in der ' Röhre Höhe ' Feld in der Einstellungsleiste auf.
    1. Beachten Sie, dass die Fliege Einzelpositionen werden erkannt und mit Punkten auf dem Bildschirm für jedes Fläschchen gekennzeichnet.
      Hinweis: Abbildung 2 zeigt die Positionen der alle Klicks auf die Schaltfläche Menü.
  6. Beachten Sie, dass die Software automatisch den Klettern Abstand für jede Fliege bestimmt und die gemittelten Werte von 10 fliegen in jedes Fläschchen in einer Tabelle an der rechten Seitenwand zeigt. (Siehe Abbildung 2)
  7. Klettern Anzahl mit Statistiksoftware (z.B. Prisma) für weitere statistische Auswertungen verarbeiten.
  8. Gegenwart, die die Daten als ± SEM meine.
  9. Berechnung der p-Werte von Bedeutung (mit Sternchen gekennzeichnet * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001) mit One-Way ANOVA mit Bonferroni mehrere Vergleich Test

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Representative Results

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von einen automatisierten RING-Test bei der Beurteilung der Fliege negative Geotaxis Verhalten. Im Gegensatz zu den vorherigen RING-Assay, unser Test beinhaltet eine automatisierte Vorrichtung, die eine elektrische Kraft zu fliegen Aktion synchronisiert und analysiert bis zu Hunderte von fliegen gleichzeitig (Abbildung 1). Analyse der Dicer2; DDC > AuxR16182 fliegen zeigten einen altersabhängige Rückgang der Klettern Abstand in einem Zeitrahmen von 6 s für männliche und weibliche fliegen, darauf hindeutet, dass Aux Ausdruck in DA Neuronen für fliegen lokomotorischen Tätigkeit entscheidend. Steigfähigkeit scheint nicht auf AuxGFP Überexpression in DA Nervenzellen betroffen sein, und Co Ausdruck AuxR16182 und AuxGFP in DA Nervenzellen gerettet des RNAi-Phänotyps (Abbildung 2 und Abbildung 3). Neben der Validierung von automatisierten RING-Assay als einen hohen Durchsatz und effizienten Ansatz für die Beurteilung der motorischen Mängel DA Neuron Degeneration zugeordnet, zeigen diese Ergebnisse auch, dass dieser automatisierten Ansatz hilfreich ist bei der Identifizierung von Potenzial Morbus Parkinson-Risiko Faktoren und bietet einen Hinweis auf ihre Neurodegenerative Funktion.

Figure 1
Abbildung 1: Die automatisierte RING Apparat. (A und B) vorne und hinten Ansichten des Apparates: Sockel (1), vertikalen Stahldraht (2), eine Schraube zur Befestigung der Rohr am Rahmen (3), transparenten Kunststoff-Fläschchen (4), Schaum (5), Metall-Basis (6), Mikro-Schritt Fahrer (7), elektronische Regler (8), der Schalter (9), kleinen Elektromotor (10) und den Hebel an der kleine Elektromotor (11) angeschlossen. Die Größe des rechteckigen Metallrahmen ist 46 cm × 26 cm × 16 cm, mit 10 transparenten Kunststoff Fläschchen (2,1 cm im Durchmesser, 14,5 cm hoch) mit Schrauben befestigt. Um das Gerät einzuschalten, klicken Sie zunächst auf den Schalter (9), die aktiviert wird (8), (7) und (10) daher. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Analyse eines Vertreters snapshot-Bild von RflyDetection. Snapshot-Image wird in der RflyDetection-Software importiert und Aktion für jedes Symbol an der Schnittstelle wird mit Text auf der rechten Seite angezeigt. Nach der Einstellung der oberen und unteren Basislinien, die Software automatisch erkennt und markiert die Fliege Position innerhalb der Durchstechflasche. Das Klettern Abstand (cm) in 6 s für jede Fliege und die gemittelten Werte für jedes Fläschchen sind in einer Tabelle angezeigt. Diese Zahlen werden dann in die Statistiksoftware für weitere statistische Auswertungen importiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Statistischen Balkendiagramme zeigen einen Rückgang der altersabhängigen fliegen Steigfähigkeit, wenn Aux Ausdruck herunterreguliert in DA Neuronen ist. Die automatisierte RING-Assay wurde verwendet, um negative Geotaxis Verhalten für Fliegen tragen die folgenden Genotypen zu analysieren: AuxR16182/ + (keine Gal4), FH-Dicer2; DDC-Gal4 fliegen gekreuzt, um w1118 (Kontrolle), FH-mCD8GFP (Kontrolle), AuxR16182, AuxGFPund AuxR16182; AuxGFP (Rettung). Beachten Sie, dass sowohl weibliche als auch männliche fliegen deutlich langsamer im Laufe der Zeit stieg als Aux Ausdruck in DA Neuronen reduziert wurde. Die motorischen Defizite wurden gerettet, nach Wiedereinführung Aux Ausdruck. Fliegen von 5, 15, 25 und 35 Tage alten wurden bewertet. (A) männlich und weiblich (B) fliegen werden gesondert ausgewiesen. Legenden mit Genotyp Etiketten entsprechend verschiedenen Bar-Farben werden auf der rechten Seite angezeigt. Daten sind als Mittelwert ± SEM pgezeigt-Werte von Bedeutung (mit Sternchen gekennzeichnet * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns: keine Bedeutung, eine Bar war unter die Sternchen an die Objekte gezeichnet Vergleichen Sie) waren im Vergleich zu der mCD8GFP -Steuerung oder Aux RNAi mit One-Way ANOVA mit Bonferroni mehrere Vergleichstest berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Der automatisierte RING-Test hier beschriebenen ermöglicht gleichzeitig eine Hochdurchsatz-Analyse der Fliege negative Geotaxis Verhalten für Hunderte von fliegen. Bereits bestehende Strategien zur Analyse von Erwachsenen Klettern beinhalten Beobachtungen eine Fliege in einem einzelnen Fläschchen und fliegen Position manuell vom Auge erfasst. Dieses ziemlich langwierige Prozess kann manchmal Fehlinterpretation oder Fehlinterpretation von Daten sowie arbeitsintensiven Arbeit verursachen. Unsere automatisierten RING-Test beginnt mit einem einfachen Klick, und das Gerät automatisch synchronisiert und Steigfähigkeit von bis zu 100 fliegen bewertet. Die elektrische Synchronisation bietet genauere Mittel zur Steuerzeit und andere Parameter, so dass die allgemeine Erfassung von fliegen Erwachsenen Klettern Prozess sorgfältig gemessen werden.

Als nächstes kann mit unserer selbst entworfenen RflyDetection Software, die genaue Position der Fliege identifiziert werden. Die Software berücksichtigt die Betrachtung der gesamten 2D Fläschchen Bereich (bestimmt durch den rechteckigen Rahmen) und den oberen und unteren Basislinien, vor dem Erwerb Positionen für alle fliegen in dem dafür vorgesehenen Bereich und präsentiert sie als Punkte. Darüber hinaus ermöglicht die automatische Berechnung der Klettern Abstand und gemittelte Werte schneller und einfacher Datenmanipulation. Datensätze über eine große Gruppe von fliegen können innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens7,8,9plausibel erfasst und analysiert werden.

Obwohl eine altersabhängige Rückgang der kletternde Aktivität im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wird hier beschrieben, dieser Test ist ebenso wirksam bei der Analyse von lokomotorischen Tätigkeit zu Entwicklungsschäden. Zu diesem Zweck ist die automatisierte RING-Assay eine nützliche und effiziente Vorgehensweise zur Analyse von Drosophila negative Geotaxis in jedem erwachsenen Stadium und entweder des normalen oder pathologischen Zustand der Funktion des Gehirns. Dennoch hat der Test eingeschränkte Nutzung vollständig analysieren alle fliegen trotz der RflyDetection-Software die Möglichkeit, manuell eine versehentlich zu identifizieren uncaptured diejenigen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken der Bloomington Stock Center und den Drosophila RNAi in Wien für fliegen Bestände. Das Patent für das RING-Gerät gehört zur Shanghai Advanced Research Institut, chinesische Akademie der Wissenschaften. Anfragen für die RflyDetection-Software auf Fu-de Huang erfolgen soll (siehe Autorenliste). Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Basic Research Program of China (973 Programm 2013CB945602) und National Natural Science Foundation of China (31270825 und 31171043). Wir danken Ho-Lab-Mitglieder zur Diskussion und Kommentare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forma Environmental Chamber Thermo 3949
Carbon dioxide cylinders FuLian GAS Technology GB/T6052
HDR-Camcorder SONY HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope Xin Zhen SMZ-168BL
Electronic scales MinQiao SL1002N
Refrigerator Haier SC-350
Agar-agar powder Sinopharm 10000561
Glucose Sinopharm 10010518
Corn meal Sinopharm 5464654
Brown sugar LiuCaiYuan 45467936
Instant dry yeast AB MAURI 20886
AuxR16182 VDRC 7187
UAS-Dicer2 Bloomington 24650
UAS-mCD8GFP Bloomington 32185
DDC-Gal4 A gift from Fude Huang
AuxGFP A gift from Henry Chang

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References

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Tags

Verhalten Ausgabe 127 Drosophila Klettern Parkinson-Krankheit altersabhängige Neurodegeneration negative Geotaxis lokomotorische Verhalten Erwachsener
Eine automatisierte rasche Iterative Negative Geotaxis Assay für die Analyse von Erwachsenen Klettern Verhalten in einem <em>Drosophila</em> -Modell der Neurodegeneration
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Cao, W., Song, L., Cheng, J., Yi,More

Cao, W., Song, L., Cheng, J., Yi, N., Cai, L., Huang, F. d., Ho, M. An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (127), e56507, doi:10.3791/56507 (2017).

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