Summary
Questo protocollo dettagliato analizza il comportamento di geotassi negativa di Drosophila utilizzando un sistema automatico di multi-cilindro che ospita centinaia di mosche e sincronizza la loro azione da un motore elettrico. Al momento della sincronizzazione, volare geotassi negativo comportamento viene analizzato, registrata digitalmente ed analizzati utilizzando il software di RflyDetection auto-progettato.
Abstract
Malattie neurodegenerative sono associate frequentemente con una progressiva perdita di capacità di movimento, durata della vita ridotta e neurodegenerazione età-dipendente. Per capire il meccanismo di questi cellulari eventi e loro relazioni causali con a vicenda, Drosophila melanogaster, con i suoi sofisticati strumenti genetici e diverse caratteristiche comportamentali, vengono utilizzati come modelli di malattia per la valutazione neurodegenerative fenotipi. Qui descriviamo un metodo di alto-rendimento per analizzare il comportamento di adulto geotassi negativa di Drosophila , come un'indicazione per eventuali difetti motore associato di neurodegenerazione. Una macchina automatica è stata progettata e sviluppata per la sincronizzazione volare utilizzando un iniziale impulso elettrico, più tardi che permette la registrazione del comportamento negativo geotassi sopra un corso di secondi per minuti in auto. Immagini dal video registrata digitalmente vengono poi elaborati con il software RflyDetection self-progettato per la manipolazione di dati statistici. Diverso del dosaggio controllato manualmente geotassi negativa basata su singolo fly, questo protocollo preciso, veloce e ad alta velocità permette l'acquisizione di dati da più di centinaia di mosche fornendo al contempo, un approccio efficace per far avanzare la nostra comprensione nel meccanismo sottostante dei deficit motorio associato a neurodegenerazione.
Introduction
Una varietà di protocolli e metodi sono stati sviluppati per analizzare il comportamento di arrampicata adulto della drosofila . Piuttosto laborioso, l'analisi tradizionale principalmente consiste nel mettere una singola Mosca in una fiala di singola e utilizza una forza manuale per toccare mosche giù per sincronizzazione1,2,3,4. È noioso e richiede tempo, inadatto per i grandi studi di alto-rendimento ed ha potenziale variazioni della forza manuale utilizzato per toccare giù le mosche, così come altre limitazioni. Per migliorare il test, un test rapido iterativo geotassi negativa (anello) è stato sviluppato che permette l'analisi di alto-rendimento sopra numerose mosche al tempo stesso5. Tuttavia, il test richiede comunque una forza manualmente esercitando per sincronizzare volare azione. La nostra versione del test RING, riveduto al momento l'analisi precedente, comprende una base di metallo hosting più flaconcini contenenti volare controllate automaticamente da un motore elettrico a guidare volare sincronizzazione6. Al momento della registrazione, al volo arrampicata immediatamente dopo sincronizzazione è registrato poi analizzato utilizzando un software di auto-progettato. Il nostro saggio anello automatizzato ha eliminato il processo noioso e laborioso nella raccolta di dati da un singolo fly, uno alla volta e attivato il processo di acquisizione di dati essere più efficiente. Inoltre, il test automatizzato di anello è stato impiegato in una serie di studi per delucidare il meccanismo sottostante Alzheimer e morbo di Parkinson, convalida l'approccio con alta efficienza7,8,9 .
In questo articolo, dimostriamo il test automatizzato anello utilizzando la DDC-Gal4 guidato RNAi mosche. DDC-Gal4 è una linea di Gal4 specificamente esprimendo in (DA) neuroni dopaminergici e serotoninergici, rappresentando quindi un ottimo strumento per analizzare gli effetti del gene bersaglio associati a deficit motorio che accompagna la neurodegenerazione10. Inoltre, incorporiamo UAS-Dicer2, una linea di volo che migliora l'efficienza di RNAi, per generare il UAS-Dicer2; DDC-Gal4 strumento linea. Le mosche di RNAi scegliamo di usare è il auxilin (aux), RNAi v16182 (auxR16182), un gene che precedentemente abbiamo identificato per esporre un effetto su attività locomotrice8per volare. auxGFP mosche sono preparati anche per analizzare gli effetti sopra aux sovraespressione. Mostreremo come utilizzare il test automatizzato di anello per misurare volare geotassi negativa, presentare i risultati e discutere eventuali implicazioni acquisite dai risultati.
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Protocol
1. collezione fly
- mantenere le mosche sul cibo standard vola a 25 ° C, 70% di umidità e un ciclo luce/buio di 12 h/12 h.
- Raccogliere UAS-Dicer2; DDC-GAL4 virginsunder volare anidride carbonica (CO 2) anestesia.
- Attraversare queste vergini per 2 giorno vecchie mosche maschi adulti che trasportano i seguenti genotipi: UAS-mCD8GFP (controllo), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux sovraespressione), e auxR 16182; auxGFP (salvataggio), con un maschio: rapporto femminile di 1:2.
- Separatamente raccogliere appena obtecta maschi e femmine in 3 fiale per ogni gruppo per esperimento, ponendo 10 mosche in ogni flaconcino di volare regolare con cibo standard a 25 ° C.
- a seconda dell'esperimento, tenere il raccolto Vola fino a 35 giorni e utilizzarli per l'analisi automatizzata di anello al giorno 5, 15, 25 e 35.
2. Automatizzati di analisi dell'anello
- trasferire 10 mosche raccolti (unisex) al genotipo in ogni fiala, quindi fissare il flaconcino con una vite. Analizzare il controllo mosche e mosche che trasportano diversi genotipi insieme per ogni set di esperimenti (fino a 10 fiale contemporaneamente, 10 mosche in ogni flaconcino).
- Attivare la fotocamera digitale posizionata davanti l'apparato, e iniziare a registrare una volta mosche sono tutti caricati e pronti.
- Dopo 1 min per mosche a stabilirsi in fiale, accendere il controllore passo-passo che controlla il driver passo; ciò spinge il motorino elettrico per controllare la leva in modo che consecutivamente sorge e rubinetti per l'apparato 4 volte in 2 s. Vedere la Figura 1.
- Dopo aver toccato, si noti che le mosche cominciano a salire la parete. Assicurarsi che la registrazione continua.
- Ripetere la sincronizzazione come descritto al punto 2.3 in intervallo 60-s per 3 a 5 prove consecutive.
- Ripetere l'esperimento per 5, 15, 25 e 35 giorno vecchie mosche. Almeno 3 esperimenti indipendenti per ogni gruppo, ogni esperimento con almeno 30 raccolti Vola (3 fiale).
3. Analisi dei dati
- importare il video registrato nel computer.
- Scattare un'istantanea del video a 6 s dopo aver toccato, per ogni prova.
- Importare l'immagine snapshot nel software RflyDetection (vedere Figura 2), utilizzando il ' File ' menu.
- Impostare le linee di base superiore e inferiore del flaconcino proprio da utilizzando l'icona della linea di base della barra degli strumenti e quindi utilizzando il cursore per contrassegnare le linee di base superiore e inferiore dell'immagine.
- Inserire il numero di mosche per flaconcino (ad esempio, 10 qui) il ' le mosche in rect ' lunghezza campo e flaconcino (ad es., 14cm qui) nella ' altezza del tubo di ' campo all'interno della barra di impostazioni.
- Nota che le singole posizioni di volare sono rilevate e identificate con puntini sullo schermo per ogni flaconcino.
Nota: Nella figura 2 indica le posizioni di tutti i menu pulsante click.
- Nota che le singole posizioni di volare sono rilevate e identificate con puntini sullo schermo per ogni flaconcino.
- Nota che il software automaticamente determina la distanza di arrampicata per ogni volo e vengono visualizzati i valori medi da 10 mosche in ogni flaconcino in una tabella sul pannello di destra. (Vedi Figura 2)
- Elaborare il numero arrampicato con software statistici (ad es., Prisma) per ulteriori analisi statistiche.
- Attualmente i dati come media ± SEM.
- Calcolare il p-valori di significatività (contrassegnati con un asterisco, * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001) usando il One-way ANOVA con Bonferroni più confronto test.
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Representative Results
In questo articolo viene illustrato l'utilizzo di un test automatizzato di anello nel valutare il comportamento di volare geotassi negativa. A differenza del precedente saggio di anello, la nostra analisi include un apparecchio automatizzato che fornisce una forza elettrica per sincronizzare volare azione e analizza fino a centinaia di mosche contemporaneamente (Figura 1). Analisi di Dicer2 di ; DDC > auxR16182 mosche hanno mostrato una diminuzione età-dipendente in lontananza arrampicata in un lasso di tempo di 6 s per mosche sia maschile che femminile, suggerendo che l'espressione aux in neuroni DA è cruciale per volare attività locomotrice. Capacità di arrampicata non sembra risentirne su auxGFP sovraespressione in neuroni DA, e co-espressione di auxR16182 e auxGFP in neuroni DA salvato il fenotipo di RNAi (Figura 2 e Figura 3). Oltre a convalidare il test automatizzato di anello come un approccio efficiente e ad alta velocità per la valutazione motori difetti associati a degenerazione del neurone DA, questi risultati inoltre indicano che questo approccio automatizzato è utile per identificare il potenziale Rischio del morbo di Parkinson fattori e fornisce un indizio sulla loro funzione neurodegenerative.
Figura 1. L'apparato di anello automatizzato. (A e B) viste frontale e posteriore dell'apparato: presa (1), tondino di acciaio verticale (2), una vite per fissare il tubo sul telaio (3), fiale di plastica trasparente (4), schiuma bar (5), base in metallo (6), driver di micro-punto (7), controllore elettronico (8), l'interruttore (9), piccolo motore elettrico (10) e la leva collegata al piccolo motore elettrico (11). La dimensione del telaio in metallo rettangolare è 46 × 26 cm × 16 cm, che tiene 10 fiale di plastica trasparente (2,1 cm di diametro, altezza 14,5 cm) fissati con viti. Per accendere l'apparecchio, prima di fare clic sull'interruttore (9), che si accende (8), (7) e (10) di conseguenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Analisi di un rappresentante snapshot immagine di RflyDetection. Immagine snapshot viene importato nel software RflyDetection e azione per ogni icona all'interfaccia è indicata con il testo a destra. Dopo aver impostato le linee di base superiore e inferiore, il software rileva automaticamente e contrassegna la posizione di volare all'interno del flaconcino. La distanza di arrampicata (cm) in 6 s per ogni volo e i valori medi per ogni flaconcino sono visualizzati in una tabella. Questi numeri sono poi importati nel software statistico per ulteriori analisi statistiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Grafici statistici bar mostrando un declino età-dipendente nel volare abilità rampicante quando aux espressione è downregulated in neuroni DA. Il test automatizzato di anello è stato utilizzato per analizzare il comportamento di geotassi negativa per le mosche, che trasportano i seguenti genotipi: auxR16182/ + (nessun Gal4), UAS-Dicer2; DDC-Gal4 mosche attraversato w1118 (controllo), UAS-mCD8GFP (controllo), auxR16182, auxGFPe auxR16182; auxGFP (salvataggio). Si noti che mosche sia maschile che femminile è salito notevolmente più lenta nel tempo quando aux espressione è stata ridotta in neuroni DA. I deficit motorio sono stati salvati su reintroducendo aux espressione. Mosche di 5, 15, 25 e 35 giorni di età sono stati valutati. Maschio (A) e femmina (B) mosche sono indicati separatamente. Leggende con etichette di genotipo corrispondenti ai colori diversi bar sono mostrati sulla destra. I dati sono mostrati come media ± SEM. p-valori di importanza (contrassegnati con un asterisco, * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001, ns: nessun significato, un bar è stato disegnato sotto gli asterischi per indicare gli oggetti da Confronta) sono stati calcolati confrontando al controllo mCD8GFP o aux RNAi utilizzando One-way ANOVA con Bonferroni più test di confronto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il test automatizzato anello qui descritto consente un'analisi di alto-rendimento del comportamento di volare geotassi negativa per centinaia di mosche contemporaneamente. In precedenza strategie esistenti per l'analisi di arrampicata adulti comportano l'osservazione di una singola Mosca in un singolo flaconcino, e volare posizione manualmente viene rilevata dall'occhio. Questo processo piuttosto noioso a volte potrebbe causare fraintendimento o errata interpretazione dei dati, come pure laborioso lavoro. Nostra analisi automatizzata di anello inizia con un semplice click e l'apparato automaticamente Sincronizza e valuta la capacità di arrampicata di fino a 100 mosche. La sincronizzazione elettrica fornisce un mezzo più preciso per controllare il tempo e altri parametri, quindi l'acquisizione complessiva di volare adulto arrampicata processo può essere misurato accuratamente.
Successivamente, con il nostro software RflyDetection self-progettato, l'esatta posizione di volare può essere identificata. Il software prende in considerazione il 2D complessiva flaconcino area (determinato da una cornice rettangolare) e le linee di base superiore e inferiore, prima di acquisire posizioni per tutte le mosche all'interno dell'area designata e li presenta come punti. Inoltre, il calcolo automatico dei valori medi e arrampicata distanza permette la manipolazione dei dati più veloce e più facile. Insiemi di dati sopra un folto gruppo di mosche possono essere plausibilmente raccolti e analizzati entro un ragionevole lasso di tempo7,8,9.
Anche se un'età-dipendente declinare arrampicata attività associata a neurodegenerazione è descritto qui, questo test è ugualmente efficace nell'analizzare attività locomotrice pertinenti a difetti inerenti allo sviluppo. A tal fine, l'analisi automatizzata dell'anello è un approccio utile ed efficiente per l'analisi della drosofila geotassi negativa in qualsiasi fase adulta e in entrambi lo stato normale o patologico della funzione del cervello. Tuttavia, il saggio ha un uso limitato nell'analizzare completamente tutte le mosche nonostante il software RflyDetection di capacità di identificare manualmente qualsiasi accidentalmente non catturate ones.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Bloomington Stock Center e il centro Vienna RNAi della drosofila per stock di volare. Il brevetto per l'apparato di anello appartiene a Shanghai Advanced Research institute, Accademia cinese delle scienze. Le richieste per il software di RflyDetection dovrebbe essere fatto per Fu-de Huang (Vedi lista dell'autore). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma di ricerca base nazionale della Cina (973 programma 2013CB945602) e National Natural Science Foundation of China (31270825 e 31171043). Ringraziamo i membri del laboratorio Ho per discussioni e commenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
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