Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56508
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

ERRATUM NOTICE

Summary

يصف لنا طريقة لإنتاج أجسام مضادة بشرية محددة مستضد الاهتمام، بدءاً من الخلايا ب نادرة المتداولة في الدم البشري. جيل من هذه الأجسام المضادة الطبيعية بكفاءة وسرعة، والأجسام المضادة التي تم الحصول عليها يمكن أن تميز بين المستضدات المتصلة بدرجة عالية.

Abstract

[مونوكلونل] (مابس) أدوات قوية مفيدة لكلا من البحوث الأساسية، وفي الطب الحيوي. خصوصيتها العالية أمر لا غنى عنه عند الجسم يحتاج إلى التمييز بين الهياكل ذات الصلة العالية (مثلاً، بروتين عادي وتحور نسخة منه). الطريقة الحالية لتوليد مثل هذه مابس التمييزية ينطوي فحص واسعة النطاق متعددة الخلايا المنتجة لأب ب، ومكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء. ونحن نقترح هنا طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد التمييزية، مابس البشرية الكامل بدءاً من الدم البشري تعميم لمفاوية ب. أصالة هذه الاستراتيجية سبب اختيار محددة مستضد ملزمة ب الخلايا جنبا إلى جنب مع التحديد مكافحة كافة الخلايا الأخرى، استخدام متاحة الطرفية الدم وحيدات النوى خلايا (ببمك). مرة واحدة محددة ب الخلايا المعزولة، يتم الحصول على تسلسلات كدنا (تكميلية الحمض الخلوي الصبغي) الترميز ماب المقابلة استخدام تكنولوجيا عكس النسخ-"تفاعل البوليميراز المتسلسل" (RT-PCR) خلية مفردة، وأعربت في وقت لاحق في الإنسان الخلايا. خلال أقل من شهر واحد، فمن الممكن تنتج ملليغرام من مابس البشرية عالية التمييزية ضد أي مستضد المطلوب الكشف عنها بطبيعة الحال بواسطة مرجع الخلية ب.

Introduction

الأسلوب الموصوفة هنا يسمح إنتاج مونوكلونل البشرية الكامل (مابس) ضد مستضد المطلوب (Ag) السريع وتنوعاً. مابس أدوات لا غنى عنها في العديد من تطبيقات البحوث الأساسية في المختبر و في فيفو: التدفق الخلوي، وعلم الأنسجة، والتجارب الغربية النشاف، وحظر على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، مابس تستخدم أكثر فأكثر في الطب لعلاج أمراض المناعة الذاتية، السرطان، ومراقبة زرع الرفض1. على سبيل المثال، استخدمت مؤخرا مابس 4-مكافحة-كتلاً ومكافحة-PD-1 (أو مكافحة-PD-L1) كمثبطات محصنة ضد نقطة تفتيش في علاجات السرطان2.

مابس الأولى تم إنتاجها بواسطة الغلوبولين المناعي (Ig)-إفراز هيبريدوماس التي تم الحصول عليها من خلايا الطحال المحصنين الفئران أو الجرذان. ومع ذلك، يعوق الاستجابة المناعية القوية ضد مابس الفئران أو الجرذان استعمالها العلاجي في البشر، وسبب بهم التخليص السريع وتحريض محتمل من تفاعلات فرط الحساسية3. لمعالجة هذه المشكلة، استبدلت تسلسل البروتين الحيواني مابس جزئيا بالبشرية منها لإنشاء ما يسمى تشيميريك الإنسان الماوس أو أنسنة الأجسام المضادة. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية جزئيا فقط يقلل الاستمناع، مع زيادة كبيرة في التكلفة والجدول الزمني للإنتاج. حل أفضل لتوليد مابس البشرية مباشرة من الخلايا ب البشرية وتتوافر استراتيجيات عدة لهذا. واحد منهم هو استخدام عرض بالعاثية أو الخميرة. وهذا ينطوي على عرض مجالات متغير من مكتبة اندماجي عشوائي Ig البشرية الثقيلة وسلاسل الضوء على فاجيس أو الخمائر، والقيام بخطوة اختيار استخدام مستضد معين من الفائدة. عيب رئيسي لهذه الاستراتيجية أن السلاسل الثقيلة والخفيفة وترتبط عشوائياً، مما أدى إلى زيادة كبيرة جداً في تنوع الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها. الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها من المحتمل أن تقابل تلك التي ستنشأ عن استجابة جهاز المناعة طبيعية ضد أغ خاصة. وعلاوة على ذلك، طي البروتين البشري والتعديلات بوستترانسلاشونال لا بانتظام مستنسخة في بدائيات النوى، أو حتى في الخمائر. أسلوب إنتاج البشري ماب ثاني هو تخليد للخلايا البشرية الطبيعية ب، بعدوى فيروس ابشتاين-بار أو التعبير عن العوامل المضادة-apoptotic BCL-6 و BCL-XL4. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا ينطبق إلا على خلايا الذاكرة ب وغير الفعالة، التي تتطلب فحص العديدة المنتجة للإنسان والمحيط الحيوي مخلدة ب الخلايا لتحديد المستنسخين ماب قليلة (أن وجدت) مع خصوصية مستضدي المرجوة. الأسلوب وبالتالي مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء.

ووصف مؤخرا بروتوكولا جديداً لإنتاج مابس البشرية من خلايا ب مفردة معزولة5. وهي تعتمد على محسن خلية واحدة عكس النسخ-"تفاعل البوليميراز المتسلسل" (RT-PCR) للتضخيم من كلا الثقيلة-والضوء-سلسلة ترميز شرائح من خلية واحدة بتم فرزها. وهذا يعقب بالاستنساخ والتعبير عن هذه الأجزاء في نظام تعبير حقيقية النواة، مما يسمح لتعمير ماب البشرية الكامل. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح بدءاً من الخلايا ب من المانحين جرى تطعيمهم. كانت حصاد الخلايا بعد التطعيم للحصول على ترددات أعلى من الخلايا ب الموجهة ضد النائب العام المطلوب، وبالتالي الحد من الوقت اللازم لفحص6أسابيع عدة. كما تم إنتاج أخرى مابس البشرية الكامل من فيروس نقص المناعة البشرية+ (فيروس نقص المناعة البشرية) إصابة المرضى7 وسرطان الجلد المرضى8. وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه، لا يزال هناك لا الإجراءات المتاحة التي تمكن من عزل خلايا ب Ag على حدة مستقلة عن النمط الظاهري الذاكرة أو التردد.

ووصف الإجراء هنا يؤدي إلى كفاءة السابقين فيفو عزل الخلايا ب تعميم البشرية استناداً إلى خصوصيتها في المركز، تليها إنتاج البشرية الكامل محددة مستضد مابس في عالية الغلة ومع وقت فحص منخفضة. الأسلوب لا يقتصر على الذاكرة ب الخلايا أو الخلايا ب إفراز الأجسام المضادة التي يسببها بعد استجابة مناعية، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على مرجع الخلية بالسذاجه البشرية. أنه يعمل حتى بدءاً من الخلايا الخاصة بحج ب حاضرا في الترددات المنخفضة جداً مؤشر جيد لكفاءتها. ومبدأ الأسلوب كما يلي: ملطخة الخلايا وحيدات النوى الدم طرفية (PBMC) مع اثنين تيتراميرس عرض المستضد الفائدة، وبعضها يحمل فلوروتشرومي مختلفة (مثلاً، فيكوريثرين (PE) واللوفيكوسيانين (APC))، وأن تيترامير ثالث عرض مستضد وثيق صلة مترافق مع فلوروتشرومي ثالث (مثلاً، Brillant البنفسجي 421 (BV421)). لإثراء لخلايا مستضد ملزمة، ثم هي المحتضنة الخلايا مع حبات مغلفة بمكافحة-PE وتقاسم المنافع المضادة-آسيا والمحيط الهادئ، وفرزها في الخلية الفصل بين الأعمدة. يتم تحديد الكسر خلية APC PE+ + ، الملون مع مجموعة متنوعة من مابس المحددة لمختلف أنواع الخلايا ببمك للسماح بتحديد الخلايا ب، ويتعرض للتدفق الخلوي الخلية الفرز. خلايا ب PE+ والجيش الشعبي الكونغولي+، لكن "البنفسجي الرائعة"-، يتم عزل. هذه الخطوة تحديد مكافحة الخلايا التي ليست خلايا ب أو عدم ربط مستضد تيتراميريزيد، ولكن ربط إلى بي أو آسيا والمحيط الهادئ (ستكون هذه الخلايا PE+ الجيش الشعبي الكونغولي– أو PE– الجيش الشعبي الكونغولي+) أو إلى الجزء غير مستضد tetramers المستخدمة (وهذه وسوف تكون الخلايا BV421+). كما يتم تحديد الخلايا ب ليست محددة للغاية حانمه مصلحة مكافحة في هذه الخطوة (وستكون هذه الخلايا أيضا BV421+). وهكذا، هذا الأسلوب يمكن تنقية الخلايا ب محددة للغاية معربا عن مستقبلات الخلية ب (بكرس) قادرة على التمييز بين اثنين من مولدات المضادات ذات صلة وثيقة جداً. يتم جمع الخلايا ب محددة واحدة في أنابيب وعلى تضخيم PCR Ig كدناس (الأحماض منقوص الأكسجين التكميلية) المستنسخة وأعرب عنها خط خلية بشرية يفرز مفتش مابس.

كدليل على المفهوم، توضح هذه الدراسة كفاءة توليد مابس البشرية، التي تعترف ببتيد التي قدمها فئة histocompatibility رئيسية معقدة (MHC--أنا) جزيء ويمكن أن تميز بين هذا الببتيد وغيرها الببتيدات محملة على نفس MHC--أنا اليل. على الرغم من أهمية مستوى تعقيد هذا Ag، يسمح هذا الأسلوب (ط) الانتعاش عالية الغلة من مابس Ag على حدة؛ (ثانيا) إنتاج مابس قادرة على التمييز بين اثنين Ags هيكلياً الوثيق. هذا النهج يمكن تمديدها للمرضى الذين جرى تطعيمهم أو المصابة دون أي تعديل البروتوكول، ولديها أيضا الفعل نفذت بنجاح في نظام جرذ أنسنة9. وهكذا، تصف هذه الدراسة اتباع نهج مرنة وفعالة لتوليد مابس البشرية الكامل الذي يمكن استخدامه في البحوث الأساسية والعلاج المناعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على عينات الدم الطرفية البشرية كافة من المانحين الكبار مجهول بعد الموافقة عن علم، وفقا للجنة الأخلاقيات المحلية (المؤسسة الفرنسية دو سانغ، EFS، نانت، الإجراء NTS بلير-2016-08).

1-عزل خلايا الدم الطرفية البشرية وحيدات النوى

ملاحظة: ابتداء من المواد يمكن أن يكون مجموع الدم المحيطي البشري أو عينات سيتافيريسيس. لا ينبغي أن يكون أقدم من ح 8 عينات وتستكمل مع مضادات التخثر (مثل، الهيبارين).

  1. تمييع الدم بحجم 2 (الدم المحيطي البشري) أو 5 وحدات التخزين (نموذج سيتافيريسيس) ربمي (معهد ميموريال بارك روزويل) متوسطة.
  2. طبقة 35 مل تعليق خلية المخفف على 15 مل من الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب 50 مل مخروطية بعناية. جعل العديد من الأنابيب اللازمة لتوزيع جميع الدم المخفف. الطرد المركزي في 1,290 س ز لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في دوار دلو يتأرجح مع الفرامل قبالة.
  3. عناية نضح طبقة الخلايا وحيدات النوى في الواجهة بين كثافة متوسطة الانحدار وطبقة البلازما، ونقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.
  4. ملء الأنبوب مع ربمي المتوسطة وخلط والطرد المركزي في 1,290 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعناية إزالة المادة طافية.
  5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 20 مل ربمي المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 10 دقيقة لإزالة الصفائح الدموية. بعناية إزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  6. ريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط ربمي مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
    ملاحظة: انتقل مباشرة إلى وسم تيترامير أو إبقاء الخلايا في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في تركيز من 107 خلايا/مل.

2-تيترامير المرتبطة تخصيب المغناطيسي من الخلايا الخاصة بحج ب

  1. إعداد تيتراميرس Ag بإضافة أما PE أو المسمى APC قسط الصف ستريبتافيدين أو ستريبتافيدين المسمى BV421 بنسبة 1:4 إلى مونومرات مستضد بيوتينيلاتيد مولى. إضافة المقدار المناسب من المتقارن streptavidin في ثلاثة أجزاء منفصلة، مضيفاً قاسمة واحد كل 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. توزيع الخلايا (تصل إلى 3 × 108 كل أنبوب) في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل والطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: البروتوكول التالي لأنبوب واحد.
  3. ريسوسبيند بيليه الخلية في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) مع 2% FBS. إضافة PE وآسيا والمحيط الهادئ، ومترافق BV421 تيتراميرس، كل إلى تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل. يخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تعد الخلية المثلج فصل المخزن المؤقت (SB) باستخدام برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 0.5% (ألبومين المصل البقري) ويدتا (حمض الإيثيلين) 2 مم.
  5. إضافة 10 مل خلايا SB. بيليه بالطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق.
  6. ريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من المثلج SB. إضافة 50 ميليلتر من مكافحة-PE و 50 ميليلتر من ميكروبيدس المغناطيسية المضادة-آسيا والمحيط الهادئ.
  7. يخلط جيدا واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. كرر الخطوة 2، 5 مرتين.
  9. إزالة المادة طافية بعناية أندريسوسبيند بيليه الخلية بتركيز 2 x 108 خلايا/مل في الجليد الباردة بينالي الشارقة.
  10. حجته عمود مغناطيسية كبيرة المتمركزة في مغناطيس مع 3 مل من س. ب.
  11. نقل تعليق خلية من 2.9 إلى أعلى العمود متوازن والسماح لاستنزاف تماما. الخطوة الحاسمة: تجنب التثاقل العمود، تمر الخلايا عبر نايلون 70 ميكرون.
  12. شطف الأنبوب الذي يتضمن الخلايا مع 3 مل من الجليد الباردة بينالي الشارقة ونقل المخزن المؤقت مباشرة على العمود (في حالة الترشيح، الشطف 70 ميكرون النايلون).
  13. عند المخزن المؤقت قد استنزفت تماما في العمود، إضافة آخر 3 مل من الجليد الباردة بينالي الشارقة للعمود.
  14. كرر الخطوة 2.13 لآخر 3 مل الغسيل.
  15. إزالة العمود من المغناطيس ومكان عبر أنبوب جمع مخروطية 15 مل.
  16. إضافة 5 مل من الجليد SB البارد على الجزء العلوي من العمود ومباشرة مسح الخلايا خارج العمود باستخدام المكبس. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  17. الطرد المركزي الخلايا المجمعة (التخصيب تيترامير ذات الصلة الإيجابية الخلية الكسر) في ز 460 x لمدة 5 دقائق والمضي قدما لتلطيخ جسم إضافية.
    ملاحظة: تجمع جمع الخلايا من جميع الأنابيب، إذا كان ذلك مناسباً.

3-تلطيخ الخلايا الخاصة بحج ب البشرية وفرز الخلايا

  1. ريسوسبيند بيليه الخلية مع مزيج أجسام مضادة الإنسان ضد CD3 (تمييع النهائي: 01:20)، CD19 (01:20)، CD14 (01:50)، CD16 (01:50)، و 7AAD (1: 1000) في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2% FBS. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني لخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق، والقضاء على المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. ريسوسبيند بيليه الخلية في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، عامل التصفية على 70 ميكرون النايلون.
  3. المضي قدما لفرز الخلايا ب محددة على مستوى خلية مفردة في سيتوميتير فارز خلية مع فوهة 100 ميكرومتر وضغط 20 رطل/بوصة مربعة دون تجاوز الأحداث/s 1,0009.
    ملاحظة: يظهر النابضة الاستراتيجية المستخدمة في الشكل 1. كانت بوابات الخلايا أولاً على CD14–CD16 7AAD–– الخلايا لاستبعاد وحيدات، ناغورني كاراباخ، والخلايا الميتة (غير مبين في الشكل 1). ثم CD19+ ب تم تحديد الخلايا قبل النابضة في الخلايا الملون مزدوجة بي وآسيا والمحيط الهادئ ذات الصلة Ag-تيتراميرس. تم استبعاد الخلايا ب الخاصة بعدم النابضة في الخلايا السلبية BV421 (أونستينيد تيترامير Ag غير ذي صلة).
  4. جمع الخلايا ب واحد إلى 8-قطاع أنابيب PCR مليئة سابقا 10 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 1 و 10 وحدات من "مثبط رناسي" ووضعت على رف ل 96 microtubes. فورا تجميد أنابيب PCR في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: أقنعة الفرز المختارة في الصك cytometer قناع الغلة: 0, نقاء القناع: 32، وقناع المرحلة: 0. يمكن تعديل هذا الإيداع خلية واحدة للوحة بكر 96-384 جيدا أو إذا لزم الأمر. الخلايا ب واحد يجب أن تجمد بأقصى سرعة ممكنة، ويمكن تركها في-80 درجة مئوية لعدة أسابيع، إذا لزم الأمر.

4-وحيد الخلية RT-PCR

  1. الخلايا بتدفئة مباشرة العينات المجمدة في شرائط PCR عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حمام جافة.
  2. نقل الشرائط للجليد والشروع في عكس النسخ (RT) بإضافة 10 ميليلتر كل أنبوب 2 x ميكس الرئيسي المخزن المؤقت الذي يحتوي على دنتب 1 مم 25 ميكروغرام/مل oligod(T) الإشعال، 5 ميكرومتر عشوائي hexamers، 20 من مثبط رناسي، ووحدات 400 وحدة من المنتسخة العكسية.
    ملاحظة: بعد خلية ذوبان الجليد، الرايت يجب تنفيذها بسرعة لتجنب تدهور الجيش الملكي النيبالي.
  3. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح هيكساميرس عشوائي هجن، ثم احتضانها ح 1 عند 50 درجة مئوية، وينتهي حضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقيقة التوقف عن رد فعل.
  4. المضي قدما في جولتين من التضخيم PCR المتداخلة لكل منطقة من مناطق الترميز لمتغير الثقيلة (vH) وكابا (vLκ) أو سلاسل خفيفة لامدا (vLλ).
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، عينات RT يمكن المجمدة في-20 درجة مئوية والاحتفاظ بها لمدة أسبوع واحد.
    1. بالنسبة للجولة الأولى من بكر، إضافة 3 ميليلتر من كدنا لوحدة تخزين نهائي 40 ميكروليتر المحتوية على 1.5 مم مجكل2، دنتبس 0.25 مم، ووحدات 2.5 من بوليميريز الحمض النووي، و 200 نيوتن متر الإشعال الخارجي (انظر الشكل 2 و الجدول للمواد لمتواليات التمهيدي).
      ملاحظة: تكوين مزيج الإشعال الخارجي. لتضخيم السلسلة الثقيلة: 4 كبسولة تفجير (لفة ميكس 5 ') إلى الأمام، وعكس 2 كبسولة تفجير (CµCγ ميكس 3'). لتضخيم السلسلة الخفيفة كابا، قدما 3 كبسولة تفجير (5 'LV | ميكس) وعكس 1 التمهيدي (3' Cκ543-566). لتضخيم السلسلة الخفيفة لامدا، 7 إلى الأمام الإشعال (5 'مزيج لاتس لاتفي) وعكس 1 التمهيدي (3' Cl).
      ملاحظة: صممت كبسولة تفجير جانب تيلر وآخرون للتضخيم5جميع الأسرة جينات السلسلة الثقيلة والخفيفة.
    2. تنطبق الشروط التالية ركوب: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 4، تليها دورات 40 من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 30 s في 58 درجة مئوية ل VH و VLκ (60 درجة مئوية، ل VLλ)، و 55 s في 72 درجة مئوية، مع استطالة نهائية خطوة في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. لبكر الجولة الثانية، استخدم 3 ميليلتر من التضخيم أول منتج لوحدة تخزين نهائي من 40 ميكروليتر المحتوية على 1.5 مم مجكل2، دنتبس 0.25 مم، ووحدات 2.5 من بوليميريز الحمض النووي، و 200 نانومتر كبسولة تفجير داخلية تحتوي على مواقع إنزيم التقييد للاستنساخ في التعبير ناقلات (انظر الشكل 2 و الجدول للمواد لمتواليات التمهيدي).
      ملاحظة: تكوين مزيج الإشعال الداخلية. لتضخيم السلسلة الثقيلة: 9 إلى الأمام الإشعال (5 'مزيج أجييفه)، وعكس 3 كبسولة تفجير (3' مزيج ساليجه). لتضخيم السلسلة الخفيفة كابا، الأمام 9 الإشعال (5 'عجيب | ميكس) وعكس 3 كبسولة تفجير (3' مزيج BsiWIJκ). لامدا الخفيفة سلسلة التضخيم، 6 إلى الأمام الإشعال (5 'مزيج أجيفل) وعكس 1 التمهيدي (3' إكسهويكل).
      ملاحظة: صممت كبسولة تفجير جانب تيلر et al.، لتضخيم جميع الأسرة جينات السلسلة الثقيلة والخفيفة5.
    4. تنطبق الشروط التالية ركوب: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 4، تليها دورات 40 من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 30 s في 58 درجة مئوية ل VH و LCκ (60 درجة مئوية، ل LCλ)، و 45 s عند 72 درجة مئوية مع استطالة نهائية خطوة في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  5. تحديد الآبار الإيجابية بترحيل ميكروليتر 5 منتجات PCR vH و vLκ و vLλ على 1.5% [اغروس] هلام (500 bp المنتجات لقطاعات ترميز متغير السلسلة الثقيلة) ومنتج شركة بريتيش بتروليوم 350 لمتغير السلسلة الخفيفة ترميز شرائح.
  6. تنقية منتجات PCR ميليلتر 35 الباقية المتبقية من الآبار الإيجابية باستخدام الأغشية ultrafiltration مصممة لتنقية منتجات PCR.
  7. الوت منتجات PCR مع 60 ميليلتر من H2o.

5-التعبير استنساخ

  1. يعد إدراج
    ملاحظة: هضم 60 ميليلتر من كل بكر المنقي المنتج في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر الذي يحتوي على المخزن المؤقت إنزيم التقييد الملائمة.
    1. منتجات PCR vH، إضافة 50 وحدة من يجئ ووحدات 50 من سالي، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية.
    2. منتجات PCR vLλ، إضافة 50 وحدة من يجئ و 50 وحدة من إكسهوي، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية.
    3. VLκ بكر المنتجات، إضافة 50 وحدة من يجئ واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية. تنقية النبذ استخدام 96 بكر الأغشية والوت مع 60 ميليلتر من ح2خلاصة O. النذرة ميليلتر 60 في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر بسيوي إنزيم التقييد المخزن المؤقت، وإضافة وحدات 50 من بسيوي واحتضانها ح 1 في 55 درجة مئوية.
    4. إلغاء تنشيط الإنزيمات بتدفئة في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. إعداد للتعبير عن المتجهات
    ملاحظة: يتم استنساخ vH [بكر] منتوجات في متجه تعبير (HCγ1) التي تحتوي على سلسلة ثقيلة ثابتة Cγ1 IgG1. يتم استنساخ منتجات PCR vLκ في متجه تعبير (LCκ) التي تحتوي على السلسلة الخفيفة مستمرة Cκ. يتم استنساخ منتجات PCR vLλ في متجه تعبير (LCλ) التي تحتوي على السلسلة الخفيفة مستمرة Cλ.
    1. أداء ديجيسشنز التالية:
      1. ميكروغرام 1 مزيج التعبير ناقل HCγ1 مع 10 وحدات من يجئ و 10 وحدات من اندونوكليسيس سالي في إجمالي حجم 20 ميليلتر من تقييد المخزن المؤقت الذي أوصت به الشركة المصنعة، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية.
      2. ميكس 1 ميكروغرام من ناقلات التعبير LCκ مع 10 وحدات من إنزيم التقييد يجئ في إجمالي حجم 20 ميليلتر من تقييد المخزن المؤقت الذي أوصت به الشركة المصنعة، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية. إضافة 10 وحدات بسيوي إنزيم التقييد، واحتضان ح 1 في 55 درجة مئوية.
      3. ميكس 1 ميكروغرام من ناقلات التعبير LCλ مع 10 وحدات من يجئ و 10 وحدات من اندونوكليسيس زهوي في إجمالي حجم 20 ميليلتر من تقييد المخزن المؤقت الذي أوصت به الشركة المصنعة، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية
    2. الحرارة كل خليط الهضم عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإلغاء تنشيط إنزيمات التقييد.
    3. إجراء عملية ربط من 5 ميليلتر من هضم PCR المنتج مع 2 ميليلتر (100 نانوغرام) من ناقلات التعبير خطية المقابلة في إجمالي حجم 20 ميليلتر من 1 × الحمض النووي ليجاسى المخزن المؤقت مع وحدة واحدة من الحمض النووي-ليجاسى T4 بالحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يتم ربط ح 3 في 4 درجات مئوية.
  3. الاستنساخ
    1. اليكتروبوراتي 1 ميليلتر من خليط ربط ميليلتر 20 إلى 45 ميليلتر من اليكتروكومبيتينت محلية الصنع TOP10 كولاي (البروتوكولات الحالية في البيولوجيا الجزيئية، قسم 1.8.4-1.8.8). إضافة 500 ميليلتر من 2 X أي تي المتوسطة على الفور واحتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 انتشار تحول البكتيريا على 2 × لوحات الأمبيسلّين أي تي. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. لكل تحويل، شاشة المستعمرات الثماني ببكر.
      1. إعداد مواده رد فعل النحو التالي على الجليد: 45 ميليلتر من 5 × PCR المخزن المؤقت، 12 ميليلتر مجكل2 (25 مم)، 4 ميليلتر من دنتبس (من أسهم تحتوي على 10 مم لكل منهما)، 10 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (الأوراق المالية 10 ميكرومتر) التهجين إلى تسلسل المتجهات (التمهيدي Ab-مركزنا-إحساس) ، و 10 ميليلتر لعكس التمهيدي (الأوراق المالية 10 ميكرومتر) استهداف منطقة السلسلة الثقيلة أو الخفيفة مستمرة (انظر الجدول للمواد لمتواليات التمهيدي). على وحدة تخزين نهائي من 200 ميليلتر مع H2o. ثم إضافة 4 ميليلتر من إنزيم بوليميريز الحمض النووي (يو 5/ميليلتر).
      2. توزيع 25 ميليلتر من مواده رد فعل كل 8-قطاع بكر الأنبوبة على الجليد.
      3. استخدام مسواك عقيمة لالتقاط مستعمرات فردية. خط المسواك على صفيحة x TY الأمبيسلّين 2 تشكل لوحة نسخ متماثل وثم تراجع ذلك في أنبوب تفاعل PCR.
      4. إجراء فحص PCR تحت الظروف التالية ركوب: 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها دورات 25 من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية، و 50 s عند 72 درجة مئوية.
      5. تحديد البكتيريا إيجابية بترحيل ميليلتر 5 منتجات PCR على 1.5% [اغروس] هلام.
        ملاحظة: تعطي مستعمرات إيجابيات منتج PCR حوالي 850 bp لناقل سلسلة ثقيلة و 600 شركة بريتيش بتروليوم لناقل سلسلة الخفيفة.
    3. تطعيم أربع مستعمرات إيجابية من لوحة نسخ متماثل إلى 2 مل متوسطة رطل واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
    4. استخراج البلازميدات من الثقافات السائل باستخدام مجموعة أدوات تنقية بلازميد، كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
    5. التحقق من الإدراج الصحيح المجالات متغيرة حسب سانغر التسلسل من البلازميدات مع التمهيدي Ab مركزنا-بمعنى.
      ملاحظة: يتم والبلازميدات مع إدراج الصحيح (ترميز المفوض السامي و LC المقابلة) كوترانسفيكتيد إلى 293A الخلايا لإفراز. هو جزيئي خصوصية صغيرة الحجم في إنتاج مابس بإليزا. ثم، يتم إنتاج كبير الحجم إذا كان ذلك ممكناً.

6-إنتاج مابس

  1. الإنتاج على نطاق صغير للتحقق من خصوصية
    1. قبل يوم من تعداء، بذور 15,000 الكلي الجنينية البشرية 293A (HEK 293A) الخلايا في 200 ميليلتر من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 10% FBS كل بئر في لوحات 96-جيدا. تبني بين عشية وضحاها في حاضنة2 CO (5% CO2) عند 37 درجة مئوية.
    2. كوترانسفيكت الخلايا 293A في دميم المتوسطة التي تحتوي على نسبة 10% باستخدام مشتق بولييثيلينيميني خطية ككاشف تعداء FBS.
      ملاحظة: إجراء تعداء في تريبليكاتيس. البروتوكول التالي واحد من لوحة مسطحة القاع 96-جيدا جيدا.
      1. تمييع 0.5 ميليلتر من الحمض النووي تعداء الكاشف إلى 10 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم. تمييع ميكروغرام 0.125 من vH وميكروغرام 0.125 من ناقلات داء الليشمانيات الحشوي إذ تعرب عن إلى 10 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم. دوامة كل تمييع لمدة 10 ق.
      2. إضافة 10 ميليلتر المخفف كاشف تعداء الحمض النووي إلى الحل الحمض النووي 10 ميليلتر. S دوامة 15 واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة مزيج 20 ميليلتر دروبويسي على خلايا 293A، وتخلط بلطف يحوم اللوحة.
    3. استبدال ح 16 متوسطة بعد تعداء وخلايا الثقافة لمدة 5 أيام في المتوسط خالية من المصل.
      ملاحظة: استخدم المتوسطة خالية من المصل لتجنب المصل Igs تلوث الأجسام المضادة المنتجة.
    4. القضاء على الخلايا والحطام بالطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق.
    5. حصاد سوبيرناتانتس بتطلع مع ماصة متعدد القنوات وتحويلها إلى لوحة 96 الخامس-أسفل بئر.
    6. معطف Ag ذات الصلة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 100 ميليلتر الواحدة من المعاد تشكيلها أليسا/السبت طلاء جيدا المخزن المؤقت 1 x بتركيز نهائي 2 ميكروغرام/مل في لوحات أليسا 96-جيدا. راجع الأمثلة في 9.
    7. كتلة الآبار مع 10% FBS دميم المتوسطة ح 2 في 37 درجة مئوية
    8. إضافة 50 ميليلتر من سوبيرناتانتس transfected 293A الخلايا من الخطوة 6.1.5، واحتضان ح 2 في الرايت
    9. إضافة 100 ميليلتر الإنسان المضادة مترافق Ab مفتش لأنزيم البيروكسيديز (HRP) الفجل في 1 ميكروغرام/مل واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة. إضافة 50 ميليلتر اللونية الركازة (TMB)، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
    10. قراءة الكثافة البصرية في 450 نانومتر على جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: مابس محددة التي كشف عنها تحليل إليزا يمكن زيادة إنتاجها على نطاق واسع وتنقيته على البروتين عمود عرض انجذاب لمفتش البشرية.
  2. الإنتاج على نطاق كبير وتنقية مابس محددة
    1. قبل يوم من تعداء، البذور 6 × 106 الكلي الجنينية البشرية 293A (HEK 293A) الخلايا إلى 175 سم2 قوارير تحتوي على 25 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS. تبني بين عشية وضحاها في حاضنة2 CO (5% CO2) عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا روافد 70% عند ترانسفيكتيد.
    2. كوترانسفيكت الخلايا 293A في دميم المتوسطة التي تحتوي على نسبة 10% باستخدام مشتق بولييثيلينيميني خطية ككاشف تعداء FBS.
      1. تمييع 50 ميليلتر من الحمض النووي تعداء الكاشف إلى 450 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم. تضعف من 10 ميكروغرام من vH وميكروغرام 10 ناقلات داء الليشمانيات الحشوي إذ تعرب عن إلى 500 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم. S دوامة 10 إضعاف كل.
      2. إضافة كاشف تعداء الحمض المخفف للحل الحمض النووي. S دوامة 15 واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة هذا المزيج 1 مل دروبويسي للخلايا، وتخلط بلطف يحوم في قارورة.
    3. استبدال ح 16 متوسطة بعد تعداء وخلايا الثقافة لمدة 5 أيام في المتوسط خالية من المصل.
    4. حصاد المتوسطة التي يسفط مع ماصة 25 مل.
    5. القضاء على الخلايا والحطام بالطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق.
    6. تنقية الأجسام المضادة باستخدام عمود 1 مل مغلفة بروتين A على نظام بروتين سريعة لوني سائل (فبلك) في 4 درجات مئوية.
      1. حجته البروتين عمود سيفاروسي مع المخزن المؤقت للفوسفات 20 مم (pH 7).
      2. تصفية مستنبت الخلية من 6.2.5 باستخدام عامل تصفية 1.22 ميكرومتر، ثم عامل تصفية 0.45 ميكرومتر.
      3. تحميل المتوسطة التي تمت تصفيتها على العمود.
      4. يغسل مع المخزن المؤقت للفوسفات 20 مم (pH 7) والوت مع عازلة سترات 0.1 M (pH 3.5).
      5. قراءة الكثافة البصرية في 280 نانومتر على جهاز المطياف الضوئي امتصاص على الفور وتحييد الكسور التي تحتوي على البروتين مع 1 "م تريس" العازلة (pH 9).
    7. دياليزي Ab المنقي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في كاسيت مع وزن الجزيئي 3.5 ك استقطاع ضد برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4).
    8. تعقيم بنقاء الترشيح وتحكم 0.2 ميكرون بحجم الاستبعاد اللوني، كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بدءاً من ببمك من المانحين صحية، وهذا يعرض مشروع توليد مابس البشرية، التي تعترف الببتيد Pp65495 (Pp65، من الفيروس المضخم للخلايا البشرية) المقدمة من الفئة الرئيسية histocompatibility معقدة أنا (MHC--أنا) جزيء (هلا-A * 0201 HLA-A2). هذه مابس يمكن أن تميز بين هذا المجمع ومجمعات يمثلون الببتيدات الأخرى حملت MHC نفس--أنا جزيء.

كانت ملطخة ببمك هلا-A2/Pp65-PE وهلا-A2/Pp65-آسيا والمحيط الهادئ، وهلا-A2/MelA2-BV421 تيتراميرس كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. وبعد إيمونوماجنيتيك تخصيب خلية من الخلايا إيجابية تيترامير بي وآسيا والمحيط الهادئ، كانت ملطخة الخلايا التيد مابس إضافية. على فارز خلية التدفق الخلوي، كانت بوابات الخلايا مغناطيسيا التخصيب أولاً على CD14 قابلة للحياة–CD16–CD3–CD19+ نوع (خلايا ب). ويبين الشكل 1 الاستراتيجية النابضة التي تستخدم لعزل الخلايا ب التعبير عن بكرس قادرة على التمييز بين هلا-A2/Pp65 وغيرها المتعلقة بالمجمعات هلا-A2/الببتيد. تحديد خلايا ب اهتمام أنجز بعد النابضة هلا-A2/Pp65 PE+ وهلا-A2/Pp65 APC+ من إيجابيات مزدوجة، لاستبعاد fluorochrome محددة ب الخلايا التي كانت منفردة الملون PE+ أو الجيش الشعبي الكونغولي+. وأخيراً، حددت محددة للغاية ب الخلايا النابضة في الخلايا السلبية هلا-A2/MelA2-BV421. يسمح هذا تحديد الخلايا ب التعبير عن بكرس قادرة على ربط هلا-A2/Pp65، الببتيد وهلا-A2-تعتمد على أسلوب، تميز بين هذه الخلايا ب وتلك الموجهة ضد β2 microglobulin، البيوتين، هلا-A2، أو تلك التي لا تميز بين الببتيدات في groove ملزمة MHC. وسيكون جميع هذه الخلايا الأخيرة BV421 الخلايا إيجابية. وكما هو موضح سابقا وكذلك توثيق مع أنواع أخرى من Ag، هذه الاستراتيجية الاستبعاد أكثر أهمية بسبب الزيادات في القدرة التمييزية من الخلايا ب Ag9.

كدناس ترميز الثقيلة والخفيفة Ig-سلاسل تم تضخيمه حالما تم فرز الخلايا ب محددة واحدة، عن طريق RT-PCR. وتم الحصول على أزواج من السلسلة الثقيلة والخفيفة ترميز شرائح في حوالي 50% خلايا ب واحد اختبار (الجدول 1). متجهات المجال متغير ثم قد تم استنساخ متواليات في التعبير التي تحتوي على تسلسل المجال ثابت المقابلة (الثقيلة κ ثابت ثابت 1 والخفيفة أو λ). كانت cotransfected الخلايا البشرية الكلي الجنينية (HEK، 293A خلايا) مع ناقلات السلسلة الثقيلة والخفيفة. كانت تحصد مابس يفرز من ايستب IgG1 من supernatants ثقافة الخلايا 293A 5 أيام بعد تعداء (انظر الشكل 3 للاستراتيجية العالمية لإنتاج مابس البشرية الكامل). وهذا أنتجت بنجاح واحد هلا-A2/Pp65 جسم محددة بدءاً من 3 خلايا مفردة باللمفاويات تسفر عن أزواج من السلسلة الثقيلة والخفيفة ترميز شرائح (الجدول 1). أليسا فحوصات أظهرت بوضوح أن هذا ماب كلا MHC والببتيد-تعتمد الملزمة بالمجمعات هلا-A2/Pp65 (الشكل 4 أ)، وسهولة أنتجت عدة ميلليجرامات للإنسان والمحيط الحيوي لمزيد من التحليل (مثلاً، التحليلات تقارب، الاختبارات الوظيفية). وكان تقارب ملزمة لها، تحددها صدى السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة)، حوالي 7 × 10-6 م (الشكل 4 باء).

وهكذا، توضح هذه المقالة مجموعة من أساليب حساسة وفعالة تسمح ط) الكشف عن الخلايا الخاصة بحج ب ذات الصلة، حتى عندما يقدم في الترددات المنخفضة جداً في دم المانحين صحي والثاني) توليد مابس البشرية عالية التمييزية.

Figure 1
الشكل 1: الكشف عن هلا-A2/Pp65 محددة ب الخلايا من ببمك البشرية.
كانت ملطخة 3 × 108 PBMC هلا-A2/Pp65-PE وهلا-A2/Pp65-آسيا والمحيط الهادئ، وهلا-A2/MelA2-BV421 تيتراميرس. وبعد إيمونوماجنيتيك تخصيب خلية من الخلايا إيجابية تيترامير بي وآسيا والمحيط الهادئ، كانت ملطخة الخلايا التيد مابس إضافية. في تدفق الخلوي فارز خلية، كانت بوابات الخلايا أولاً على القميص صالحاً CD14–CD16 اللمفاويات– (غير معروضة)، ثم في CD19+CD3 الخلايا– . ثم، كانت بوابات الخلايا ب ملطخة تيتراميرس هلا-A2/Pp65-PE وهلا-A2/Pp65-آسيا والمحيط الهادئ. واستخدمت تيترامير هلا-A2/ميلا-BV421 لاستبعاد الخلايا ب لا تعترف هلا-A2/Pp65، بطريقة تعتمد على MHC والببتيد.

Figure 2
رقم 2: استراتيجية للتضخيم واستنساخ الجينات Ig- الخفيفة والثقيلة Ig-سلسلة ترميز الجينات تم تضخيمه من قبل المتداخل RT-PCR. وأجريت أول تقارير إتمام المشروعات مع مزيج الإشعال إلى الأمام التهجين زعيم المنطقة وعكس كبسولة تفجير محددة للمناطق الثابتة كابا، الثقيلة والخفيفة المناسبة، أو سلاسل خفيفة لامدا. أجريت الثانية تقارير إتمام المشروعات مع الإشعال تحتوي على مواقع التقييد، والإشعال إلى الأمام وعكس محددة على التوالي لبداية القطع الخامس ونهاية القطع ي. منتجات PCR كانت متتابعة، هضمها مع إنزيمات التقييد، والمستنسخة في ناقلات التعبير التي تحتوي على نطاقات المستمر المناسب. CMV: مروج الفيروس المضخم للخلايا؛ عمبر: الجينات المقاومة الأمبيسلّين.

Figure 3
الشكل 3: الاستراتيجية العامة لإعادة إعمار مابس البشري المؤتلف.
استراتيجية فرز على أساس تيترامير يتيح الكشف عن خلايا ب من الفائدة. وكانت محددة للغاية ب الخلايا خلية واحدة فرز. تم تضخيمها الخفيفة والثقيلة Ig-سلسلة ترميز شرائح استخدام RT-PCR. قد تم استنساخ تسلسل المجال المتغير في ناقلات التعبير التوكسينات منفصلة في الإطار مع شرائح الجينات ترميز المناطق خفيفة وثقيلة ثابتة. وأعرب عن طريق عابر transfected الخلايا 293A HEK مابس البشرية الكامل المطابق وتنقيته من ثقافة طافية. تم تعديل هذا الرقم من أوويسي et al. (2017) 9.

Figure 4

الشكل 4: وصف الممثل ماب الغاية التمييزية ضد هلا-A2/Pp65 المتولدة من الدم المحيطي البشري تعميم خلايا ب.
A) خصوصية ماب PC1.02 ضد هلا-A2/Pp65 اختبارها من قبل أليسا. كانت مغلفة بلوحات مع ذات الصلة (هلا-A2/Pp65) أو غير ذات صلة مجمعات هلا-A2 تحتوي على الببتيدات المقيدة هلا-A2: ميلا، NS3 (سي-1)، و GagP17 (فيروس نقص المناعة البشرية-1) في 2 ميكروغرام/مل ومآب PC1.02 أضيفت الإنسان المضادة Ab HRP مفتش كان يستخدم للكشف. الكثافة البصرية (OD) قد اقرأ في 450 نانومتر. ب) تقارب البت ماب PC1.02 استخدام سطح مأكل مثل الطحين الرنين (موارد البرنامج الخاصة) التي تتدفق تركيزات مختلفة من المجمعات هلا-A2/Pp65 أكثر ماب CM5 رقاقة زمنياً. تم تعديل هذا الرقم من عويس et al. (2017) 9.

عدد ببمك عدد PE + APC + الخلايا بعد تخصيب عدد الخلايا المستبعدة (BV421 +) عدد خلايا مفردة تم فرزها عدد من الآبار تم تحليلها عدد من الآبار مع المفوض السامي و LC المرتبطة (الاسترداد ٪) عدد مابس المنتجة عدد مابس محددة
هلا-A2/Pp65 الإنسان والمحيط الحيوي (PC1.02) 3 × 108 818 117 161 7 3 (43%) 3 1

الجدول 1: تحليل هلا-A2/Pp65 محددة ب الخلايا.
وقد أثر استراتيجية الاستبعاد غير محدد ب الخلايا، غلة Ig التضخيم الجيني، وإنتاج ماب من خلايا معينة ب معزولة هلا-A2/Pp65 تقييم المقاسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول المقترح وسيلة قوية لتوليد مابس البشرية مباشرة من الخلايا الخاصة بحج ب المتداولة في الدم. فهو يجمع بين ثلاثة جوانب هامة: (ط) استخدام المرتبطة تيترامير المغناطيسي تخصيب اليورانيوم، الذي يسمح لعزل السابقين فيفو نادرة حتى ب Ag ملزم الخلايا؛ (ثانيا) استراتيجية النابضة يستخدم ثلاثة تيتراميرس Ag (اثنين منها ذات الصلة وواحدة واحدة ذات صلة) المسمى مع ثلاثة فلوروتشروميس مختلفة لعزل، بالتدفق الخلوي، فقط الخلايا ب التعبير عن بنك معين للنائب العام المنشود؛ (ثالثا) إعادة إعمار كدناس ماب المؤتلف المقابلة من الرايت-بكر على مستوى الخلية الواحدة والتعبير عن كدناس في الخلايا البشرية.

اقترحت دراسات سابقة باستخدام مولدات ذات الصلة فلوري واحد أو اثنين لتسمية الخلايا البشرية ب قبل الفرز واللاحقة إنتاج مابس من عزلة ب خلايا6،،من78. تحليل واحد في المرضى الذين يعانون من التهاب المفاصل، وواحدة في نموذج ماوس المناعة الذاتية، قد المرتبطة مستضد فلورية غير ذي صلة لوصف الخلايا ب أوتورياكتيفي وتحديد ما تردد10،11. وبقدر ما نعلم، استخدام مزيج من اثنين مستضد الفلورية ذات الصلة تيتراميرس ولا قد وصف واحد غير ذي صلة مستضد تيترامير سابقا لتخصيب اليورانيوم لخلايا ب معينة قبل استخدامها لإنتاج مابس البشرية الكامل. هذا الأسلوب الأمثل يسمح مابس التمييزية البشرية الكامل يمكن الحصول عليها في أقل من شهر، ويمكن أن يؤديها بنجاح حتى عندما بدءاً من مرجع خلية بالسذاجه. وهكذا، فإنه لا يوجد من المآخذ الرئيسية على عرض بالعاثية، تخليد الإنسان بالخليه، أو أخرى سبق وصف إجراءات إعادة الإعمار ماب المستندة إلى علم الأحياء الجزيئي.

وينتج هذه الخلية فرز استراتيجية انتعاش عالية غلة من مابس البشرية Ag على حدة. أزواج من قطاعات السلسلة الثقيلة والخفيفة من خلايا مفردة ب معزولة تزداد بمعدل نجاح حوالي 50%. أجزاء سلسلة الخفيفة تتضخم دائماً تقريبا، ولكن هذه ليست الحال بالنسبة لقطاعات السلسلة الثقيلة. الكفاءة RT-PCR يعتمد اعتماداً كبيرا على احترام النقاط التالية: أنا) يجب تجميد فرز الخلايا ب واحد، في أقرب وقت ممكن؛ ثانيا) إضافة 30 وحدة رناسي المانع وتقليل الفترة الزمنية بين أخذ الخلايا ب الخروج من الثلاجة والشروع في رد فعل RT؛ ثالثا) ذوبان جميع أجهزة الإشعال على الجليد؛ رابعا) ابدأ تجميد/ذوبان كبسولة تفجير أكثر من ثلاث مرات؛ v) تخزين كبسولة تفجير لمدة أقصاها سنة واحدة.

وفيما يتعلق بكفاءة الإنتاج مابس المؤتلف المقابلة مع خصوصية المنشود، هو حوالي 30-40% الحال بالنسبة للرهن العقاري مابس محددة. هذه مابس معينة لا بد أن نعترف الببتيد وجزيء MHC، التي تطالب تماما، وقد أظهرنا سابقا أن العائد الإجمالي لانتعاش مابس المحددة الموجهة ضد المستضدات أكثر تقليدية متفوقة، تصل إلى 100% مستضد β-جالاكتوسيداسي9. يجب التشديد على أن اختيار Ag المناسبة تيترامير غير ذات صلة من المهم أن زيادة خصوصية مابس المنتجة.

تقارب ماب المضادة-هلا-A2/Pp65 (PC1.02) الموصوفة في هذه المادة منخفضة نسبيا، عن 7 × 10-6 م، مماثلة للتقارب من تكر. هذه النتيجة كان من المتوقع، كما تم إجراء عزل الخلية بمن السذاجة الجهات المانحة. وكانت معظم الخلايا ب تيترامير+ IgM+IgG-، مما يقلل من احتمال الحصول على اضبارة Ag جيدة. ومع ذلك، هذا الأسلوب يمكن أيضا جعل إمكانية الفرز نفاد الذاكرة تحسن ب الخلايا ضد أغ المرجوة من السذاجة الجهات المانحة، بسبب الماضي المناعية للأفراد12. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب قابلاً للتطبيق بسهولة للمرضى الذين جرى تطعيمهم أو المصابين أو الحيوانات أنسنة تحصينا، كما هو موضح في 9، حيث يمكن أن تزيد في فيفو نضوج تقارب تقارب مابس الناجمة عن ذلك بنحو 1 × 10-9 م مختلف وقد وصف إجراءات أيضا لتحسين التقارب من مابس في المختبر، وبخاصة عن طريق استنساخ هايبرموتيشن جسدية في الخلايا معربا عن الجسم (استعرض في 13).

وفي الختام، فإننا نقترح استراتيجية متعددة الجوانب لإنتاج مابس عالية التمييزية التي يمكن استخدامها في أنواع مختلفة من الحالة، من ساذج فرادى المانحين جرى تطعيمهم أو مريض يعاني من مرض المناعة الذاتية. مابس البشرية الكامل التي تم إنشاؤها بهذه الطريقة ضد حانمه المطلوب يمكن أن تكون مفيدة سواء بالنسبة للبحوث الأساسية والعلاج المناعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر المرفق الخلوي "سيتوسيل" (الصحة فرنك سويسري، بيوجينويست، نانت) لخبراء المساعدة التقنية. ونشكر أيضا جميع موظفي إنتاج البروتين المؤتلف (P2R) ومنصات الأثر (INSERM 1232، الصحة فرنك سويسري، بيوجينويست، نانت) لتقديم الدعم التقني لهم. ونحن نشكر ستيت إيمانويل وريتشارد بريثناتش للتعليقات البناءة على المخطوطة. وأيد هذا العمل ماليا سيستي رامي المشروع الممول من قبل برنامج "الحكومة الفرنسية" «يشرف دعفينير»، تمكنت من الفرنسية الوطنية بحوث الوكالة (ANR-10-إيبهو-005). رامي-سيستي المشروع تدعمه أيضا نانت متروبول وضمور يدفع de la Loire. وأدرك هذا العمل في سياق البرنامج IGO لابيكس تدعمها الوكالة الوطنية للبحوث عن طريق استثمار البرنامج مستقبلا ANR-11-لابكس-0016-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		 Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Tags

علم المناعة، 132 قضية، علم المناعة، البيولوجيا الخلوية، أجسام بشرية، خلية ب، تيترامير، التدفق الخلوي، خلية مفردة، تخصيب مستضد على حدة، والمغناطيسية

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devilder, M. C., Moyon, M.,… More

Devilder, M. C., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter