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Immunology and Infection

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56508
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

ERRATUM NOTICE

Summary

Nous décrivons une méthode pour la production d’anticorps humains spécifiques pour un antigène d’intérêt, à partir de rares cellules B circulant dans le sang humain. Génération de ces anticorps naturels est efficace et rapide, et les anticorps obtenus peuvent distinguer les antigènes fortement connexes.

Abstract

Anticorps monoclonaux (ACM) sont de puissants outils utiles pour les deux la recherche fondamentale et en biomédecine. Leur spécificité élevée est indispensable lorsque l’anticorps doit faire la distinction entre les structures fortement connexes (p. ex., une protéine normale et une version mutée de celle-ci). La façon actuelle de générer ces mAbs discriminatif implique une vaste sélection de multiples cellules productrices de Ab B, qui est coûteux et fastidieux. Nous vous proposons ici une méthode rapide et rentable pour la génération de discriminatoire, mAbs entièrement humain à partir de sang humain, les lymphocytes B circulants. L’originalité de cette stratégie est due à la sélection des cellules de liaison B antigène spécifique combinée à la Counter-sélection de toutes les autres cellules, à l’aide de facilement disponible Peripheral Blood mononucléaires cellules (PBMC). Une fois que les cellules B spécifiques sont isolés, cDNA (l’acide désoxyribonucléique complémentaire) séquences codant pour le mAb correspondant sont obtenus utilisant la technologie de cellule unique Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) et par la suite exprimé en homme cellules. Dans aussi peu que 1 mois, il est possible de produire des milligrammes de hautement discriminatoires mAbs humain dirigé contre pratiquement n’importe quel antigène désiré naturellement détectée par le répertoire des cellules B.

Introduction

La méthode décrite ici permet la production rapide et versatile de pleinement humains anticorps monoclonaux (ACM) contre un antigène désiré (Ag). mAbs sont des outils essentiels dans beaucoup de demandes de recherche fondamentale in vitro et in vivo: flow cytometry, histologie, expériences western-blot et blocage par exemple. En outre, mAbs sont utilisés plus en médecine pour traiter les maladies auto-immunes, cancer et de contrôler le rejet de greffe1. Par exemple, ACM anti-CTLA-4 et anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) ont été récemment utilisés comme inhibiteurs de point de contrôle immunitaire cancer traitements2.

Le mAbs première ont été produit par les immunoglobulines (Ig)-sécrétant des hybridomes obtenus des cellules spléniques de souris immunisées ou de rats. Cependant, la forte réponse immunitaire contre ACM murin ou rat entrave leur utilisation thérapeutique chez l’humain, en raison de leur apurement rapide et l’induction probable d’hypersensibilité réactions3. Pour résoudre ce problème, des séquences de protéines animales du mAbs ont été partiellement remplacées par humain pour produire ce qu’on appelle anticorps chimériques de souris-humain ou humanisés. Toutefois, cette stratégie ne diminue que partiellement immunogénicité, tout en augmentant considérablement le coût et les délais de production. Une meilleure solution consiste à générer le mAbs humaine directement à partir de cellules B humaines et il existe plusieurs stratégies pour cela. L’un d’eux est l’utilisation de l’affichage bactériophage ou de la levure. Cela implique l’affichage variables domaines auprès d’une bibliothèque combinatoire d’aléatoire Ig humaine lourde et des chaînes de lumière sur les phages ou levures et effectuer une étape de sélection à l’aide de l’antigène spécifique d’intérêt. Un inconvénient majeur de cette stratégie est que les chaînes lourdes et légères sont aléatoirement associés, conduisant à une augmentation très importante de la diversité des anticorps générés. Les anticorps obtenus ne devraient pas correspondent à celles qu’induirait une réponse immunitaire naturelle contre une Ag particulier. En outre, le repliement des protéines humaines et modifications post-traductionnelles ne sont pas systématiquement reproduites chez les procaryotes ou même chez les levures. Une deuxième méthode de production de mAb humaine est l’immortalisation des cellules B humaines naturelles, par infection à virus Epstein - Barr ou expression des facteurs anti-apoptotique BCL-6 et BCL-XL4. Toutefois, cette méthode est applicable uniquement aux cellules B mémoire et est inefficace, exigeant que le dépistage des nombreux mAb immortalisées B cellules productrices d’identifier les clones mAb peu (ou pas) avec la spécificité antigénique désirée. La méthode est donc coûteuses et chronophages.

Un nouveau protocole a été décrite récemment pour la production du mAbs humaine de simple isolé de cellules B5. Elle s’appuie sur une optimisée unicellulaires Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour l’amplification des deux la lourds - et chaînes légères encodage des segments d’une seule cellule B triée. Il est suivi par le clonage et l’expression de ces segments dans un système d’expression eucaryote, permettant ainsi la reconstitution d’un mAb pleinement humain. Ce protocole a été utilisé avec succès à partir de cellules de B de donneurs vaccinés. Les cellules ont été récoltées plusieurs semaines après la vaccination pour obtenir des fréquences plus élevées des lymphocytes B dirigés contre le Ag souhaitée et de limiter ainsi le temps nécessaire pour le dépistage de6. Autres mAbs pleinement humaines ont également été produites de patients7 et mélanome les patients infectés par le VIH+ (Virus de l’immunodéficience humaine)8. Malgré ces avancées, toujours aucune procédure n’est disponible que permet l’isolement Ag spécifiques de cellules de B indépendamment de leur phénotype mémoire ou la fréquence.

La procédure décrite ici conduit à l’isolement efficace ex vivo de cellules B circulantes humaines fondée sur leur spécificité BCR, suivie par la production de pleinement humain mAbs antigène-spécifiques dans le rendement élevé et avec un temps de projection basse. La méthode ne se limite pas aux cellules B mémoire ou les cellules B sécrétant des anticorps induits après une immuno-réaction, mais peut également être appliquée pour le répertoire de cellules B naïves humaines. Qu’il fonctionne même à partir de cellules de B Ag spécifiques présents à très basses fréquences est une bonne indication de son efficacité. Le principe de la méthode est la suivante : les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) sont colorées avec deux tétramères présentant l’antigène d’intérêt, chacun marqué avec un fluorochrome différent (p. ex., phycoérythrine (PE) et Allophycocyanin (APC)), et un troisième tétramère présentant un antigène étroitement apparenté conjugué avec un fluorochrome tiers (p. ex., Brillant Violet 421 (BV421)). Pour enrichir pour cellules de liaison de l’antigène, les cellules sont ensuite incubées avec perles recouvertes d’anti-PE et Abs anti-APC et triés dans les colonnes de séparation cellulaire. La fraction de cellules APC PE+ + est sélectionnée, colorées avec une variété de mAbs spécifiques pour différents types de cellules PBMC permettre l’identification des cellules B et soumis à l’écoulement cytometry cellule Tri. Les lymphocytes B qui sont PE+ et APC+, mais brillant Violet-, sont isolés. Cette étape sélectionne dans les cellules qui ne sont pas des cellules B ou ne se lient pas à l’antigène tétramères, mais faire un bind PE ou APC (ces cellules sera PE+ – d’APC ou PE– APC+) ou à la partie non-antigène des tétramères utilisé (ces les cellules seront BV421+). Cellules B pas très spécifiques pour l’épitope d’intérêt sont également Counter-sélectionnés à cette étape (ces cellules seront également BV421+). Ainsi, cette méthode peut purifier hautement spécifique B cellules exprimant des récepteurs de B-cellule (RCO) capables de distinguer les deux antigènes très étroitement apparentées. Des cellules de B spécifiques uniques sont recueillis dans des tubes et leurs ADNc amplifié par PCR Ig (complémentaires acides désoxyribonucléiques) cloné et exprimé par une lignée cellulaire humaine comme sécrétées IgG mAbs.

Comme une preuve de concept, cette étude décrit la génération efficace du mAbs humaine, qui reconnaît un peptide présenté par une classe complexe majeur d’histocompatibilité I (MHC-je) molécule et peut distinguer ce peptide et d’autres peptides chargés sur le même MHC-j’ai allèle. Même si le niveau de complexité de cette Ag est important, cette méthode (i) permet la récupération de rendement élevé du mAbs Ag spécifiques ; (ii) la production du mAbs capables de distinguer deux Ags structurellement proches. Cette approche peut être étendue aux patients vaccinés ou infectés sans aucune modification du protocole et a également déjà été implémentée avec succès dans un système de rat humanisé9. Ainsi, cette étude décrit une approche polyvalente et efficace pour générer des mAbs entièrement humains qui peut être utilisés en immunothérapie et de la recherche fondamentale.

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Protocol

Tous les échantillons de sang périphérique humain proviennent de donneurs adultes anonymes après consentement éclairé, selon le Comité d’éthique local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procédure PLER NTS-2016-08).

1. isolement des cellules mononucléaires de sang périphérique humain

Remarque : Matériel de départ peut être du sang périphérique humain total ou échantillons de cytaphérèse. Échantillons ne soient pas plus de 8 h et complétée avec des anticoagulants (par exemple, héparine).

  1. Diluer le sang et 2 volumes (sang périphérique humain) ou 5 volumes (échantillon de cytaphérèse) du milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
  2. Soigneusement la couche 35 mL de suspension cellulaire dilué sur 15 mL de milieu de gradient de densité dans un tube conique de 50 mL. Faire des tubes autant que nécessaire pour distribuer tout le sang dilué. Centrifuger à 1 290 x g pendant 25 min à température ambiante dans un rotor oscillant-seau avec frein.
  3. Aspirer la couche de cellules mononucléées à l’interface entre le milieu de gradient de densité et de la couche de plasma avec précaution et les cellules de transfert dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  4. Remplir le tube avec milieu RPMI, mélanger et centrifuger à 1 290 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirer délicatement le surnageant.
  5. Resuspendre le culot dans 20 mL de milieu RPMI et centrifuger à 200 x g pendant 10 min enlever les plaquettes. Retirer délicatement le surnageant. Répétez cette opération une fois.
  6. Resuspendre le culot dans un milieu RPMI avec 10 % sérum bovin fœtal (SVF).
    Remarque : Passez directement a l’étiquetage tétramère ou maintenir les cellules à 4 ° C durant la nuit à une concentration de 107 cellules/mL.

2. tétramère associées à l’enrichissement magnétique des lymphocytes B spécifiques Ag

  1. Préparer, Ag-tétramères en ajoutant soit PE ou APC-étiqueté premium grade streptavidine ou streptavidine marquée BV421 à un rapport molaire de 1:4 aux monomères d’antigène biotinylé. Ajouter la quantité appropriée de conjugué streptavidine-en trois parties distinctes, ajoutant une aliquote de chaque 10 min à température ambiante.
  2. Distribuer des cellules (jusqu'à 3 x 108 par tube) dans les tubes coniques 15 mL et centrifuger à 460 x g pendant 5 min.
    Remarque : Le protocole suivant est pour un seul tube.
  3. Resuspendre le culot dans 200 µL de PBS (Phosphate Buffered Saline) avec 2 % FBS. Ajouter PE - APC- et BV421-conjugués tétramères, chacun à une concentration finale de 10 µg/mL. Bien mélanger et laisser incuber 30 min à température ambiante.
  4. Préparer le tampon de séparation cellule glacée (SB) à l’aide de PBS avec 0,5 % de BSA (albumine sérique Bovine) et EDTA (acide éthylènediamine tétra-acétique) 2 mM.
  5. Ajouter 10 mL de cellules SB. Pellet par centrifugation à 460 x g pendant 5 min.
  6. Remettre en suspension les cellules de 500 µL glacee SB. Ajouter 50 µL d’anti-PE et 50 µL de microbilles magnétiques anti-APC.
  7. Bien mélanger et laisser incuber 20 min à 4 ° C.
  8. Répétez l’étape 2.5 deux fois.
  9. Éliminer le liquide surnageant avec soin andresuspend le culot cellulaire à une concentration de 2 x 108 cellules/mL dans la glace froide SB.
  10. Equilibrer une longue colonne magnétique placée sur un aimant avec 3 mL de SB.
  11. Transfert en suspension cellulaire de 2,9 sur la partie supérieure de la colonne équilibrée et laissez-le s’égoutter complètement. ÉTAPE critique : Pour éviter les grumeaux de la colonne, passent des cellules par une maille en nylon de 70 µm.
  12. Rincer le tube qui contient les cellules avec 3 mL de glace froide SB et transférer le tampon directement sur la colonne (dans le cas d’une filtration, rinçage des 70 µm en nylon mesh).
  13. Lorsque le tampon est complètement vidangé dans la colonne, ajouter un autre 3 mL de SB froid de glace à la colonne.
  14. Répétez l’étape 2.13 pour un autre lavage de 3 mL.
  15. Supprimez la colonne de l’aimant et le déposer sur un tube collecteur conique de 15 mL.
  16. Ajouter 5 mL de glace froide SB sur le dessus de la colonne et rincer les cellules de la colonne à l’aide du piston. Répétez cette opération une fois.
  17. Centrifuger les cellules recueillies (fraction de cellules positives enrichi tétramère pertinentes) à 460 x g pendant 5 min et procéder à la coloration des anticorps supplémentaires.
    NOTE : Piscine recueilli les cellules de tous les tubes, le cas échéant.

3. la coloration des cellules B humaines Ag spécifiques et le tri des cellules

  1. Resuspendre le culot cellulaire avec un cocktail d’anticorps anti-humains CD3 (dilution finale : 01:20), CD19 (01:20), CD14 (01:50), CD16 (01:50) et 7AAD (1 : 1000) dans un volume final de 100 µL de PBS contenant 2 % FBS. Incuber 30 min à 4 ° C.
  2. Ajouter 10 mL de PBS aux cellules, centrifuger à 460 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Répétez cette opération une fois. Resuspendre le culot dans 200 µL de PBS, filtre sur les mailles de nylon 70 µm.
  3. Passez à trier des cellules B spécifiques au niveau de la cellule unique sur un cytomètre de trieur de cellules avec une buse 100 µm et une pression de 20 lb/po2 sans dépasser 1 000 événements/s9.
    Remarque : La stratégie de blocage utilisée est illustrée à la Figure 1. Cellules ont été tout d’abord bloquées sur CD14–CD16 7AAD–– cellules d’exclure des monocytes, NK et les cellules mortes (non illustrés dans la Figure 1). Puis CD19+ B cellules ont été sélectionnés avant déclenchement sur doubles cellules colorées par PE et APC pertinentes Ag-tétramères. Cellules B non spécifiques ont été exclues par blocage sur BV421 les cellules négatives (non souillées enregistrés par Ag-tétramère non pertinent).
  4. Prélever des cellules de B unique dans 8-bande PCR tubes précédemment rempli de 10 µL de solution 1 PBS x et 10 unités d’inhibiteur de RNAse et placés sur une étagère pour 96 microtubes. Geler immédiatement les tubes PCR à-80 ° C.
    Remarque : Les masques de tri choisis sur l’instrument cytomètre sont masque de rendement : 0, masque pureté : 32 et masque de phase : 0. ce dépôt de cellule unique pourrait être ajusté à une plaque PCR 96 ou 384 puits si nécessaire. Cellules B doivent être gelés aussi rapidement que possible et peuvent être laissés à-80 ° C pendant plusieurs semaines, si nécessaire.

4. cellule RT-PCR

  1. Lyse des cellules en chauffant directement les échantillons congelés dans les bandes PCR à 70 ° C pendant 5 min dans un bain sec.
  2. Transfert de bandes pour glace et procéder à la transcription (RT) inverse en ajoutant 10 µL par tube de 2 x mélange principal tampon contenant 1 mM dNTP, amorces de oligod(T) 25 µg/mL, 5 µM aléatoire hexamères, 20 unités d’inhibiteur de RNAse et 400 unités de la transcriptase inverse.
    Remarque : Après la cellule de décongélation, RT doit être effectuée rapidement afin d’éviter la dégradation de l’ARN.
  3. Incuber à 25 ° C pendant 5 min permettre au hasard hexamères à hybrider, puis incuber pendant 1 heure à 50 ° C et terminer par une incubation à 95 ° C pendant 3 min arrêter la réaction.
  4. Procéder à deux séries de l’amplification par PCR imbriquée pour chacune des régions codant pour la variable lourde (vH) et kappa (vLκ) ou chaînes légères lambda (vLλ).
    NOTE : Sinon, RT échantillons peuvent être congelés à-20 ° C et gardés pendant une semaine.
    1. Pour le premier tour de la PCR, ajouter 3 µL d’ADNc pour un volume final de 40 µL contenant 1,5 mM MgCl2dNTPs 0,25 mM, 2,5 unités de l’ADN polymérase et 200 nM d’amorces externes (voir la Figure 2 et Tableau des matières pour les séquences d’amorces).
      NOTE : Composition du mélange amorces externe. Pour l’amplification de la chaîne lourde : 4 avant amorces (HVG mix 5') et 2 marche arrière amorces (3' CµCγ mix). Pour l’amplification de chaîne légère kappa, 3 vers l’avant des amorces (5' LV | mix) et 1 marche arrière amorce (3' Cκ543-566). Pour l’amplification de chaîne légère lambda, 7 avant amorces (mélange de LVl 5') et 1 marche arrière amorce (3' Cl).
      NOTE : Les amorces ont été conçus par motoculteur et coll. pour l’amplification de tous les gènes de la famille des chaînes lourdes et légères5.
    2. Appliquer les conditions suivantes de cyclisme : 94 ° C pendant 4 min, suivie de 40 cycles de 30 s à 94 ° C, 30 s à 58 ° C pour VH VLκ (60 ° C pour les VLλ) et 55 s à 72 ° C, avec une élongation finale étape à 72 ° C pendant 7 min.
    3. Pour la deuxième ronde PCR, utiliser 3 µL du premier produit d’amplification pour un volume final de 40 µL contenant 1,5 mM MgCl2dNTPs 0,25 mM, 2,5 unités de l’ADN polymérase et 200 nM d’amorces internes contenant des enzymes de restriction des sites pour le clonage dans l’expression vecteurs (voir la Figure 2 et Tableau des matières pour les séquences d’amorces).
      NOTE : Composition du mélange amorces internes. Pour l’amplification de la chaîne lourde : 9 avance amorces (mélange de AgeIVH de 5') et 3 retour amorces (3' SalIJH mix). Pour l’amplification de chaîne légère kappa, 9 en avant des amorces (5' AgeIV | mélanger) et 3 marches arrière amorces (3' BsiWIJκ mix). Pour l’amplification de chaîne légère lambda, 6 avant amorces (mélange de AgeIVl de 5') et 1 marche arrière amorce (3' XhoICl).
      NOTE : Amorces ont été conçus par motoculteur et al., pour l’amplification de l’ensemble de la chaîne lourde et légère gènes de la famille5.
    4. Appliquer les conditions suivantes de cyclisme : 94 ° C pendant 4 min, suivie de 40 cycles de 30 s à 94° C, 30 s à 58 ° C pour VH et LCκ (60 ° C pour LCλ) et 45 s à 72 ° C avec une élongation finale étape à 72 ° C pendant 7 min.
  5. Identifier les puits positifs en migration 5 μL des produits PCR de vH, vLκ et vLλ sur un gel d’agarose de 1,5 % (500 produits de bp pour les segments encodage variable chaîne lourde) et un produit bp 350 pour la variable chaîne légère segments d’encodage.
  6. Purifier les produits PCR 35 restants de µL restants de puits positifs à l’aide de membranes d’ultrafiltration conçues pour la purification de produits PCR.
  7. Éluer les produits PCR avec 60 µL d’H2O.

5. expression clonage

  1. Préparer des Inserts
    NOTE : Digérer 60 µL de chaque PCR purifié produit dans un volume final de 100 µL contenant le tampon de l’enzyme de restriction appropriées.
    1. Pour les produits PCR vH, ajouter 50 unités de AgeI et 50 unités de SalI et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    2. Pour vLλ les produits PCR, ajouter 50 unités de AgeI et 50 unités de XhoI et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    3. Pour vLκ les produits PCR, ajouter 50 unités de AgeI et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Purifier les produits de digestion à l’aide de membranes PCR 96 et éluer avec 60 µL d’H2O. Digest éluat 60 µL dans un volume final de 100 µL de tampon d’enzyme de restriction BsiWI, ajouter 50 unités de BsiWI et incuber pendant 1 heure à 55 ° C.
    4. Inactiver les enzymes par chauffage à 80 ° C pendant 15 min.
  2. Préparation d’exprimer les vecteurs
    Remarque : les amplicons vH sont clonés dans un vecteur d’expression contenant la chaîne lourde de la constante Cγ1 de IgG1 (HCγ1). vLκ produits PCR sont clonés dans un vecteur d’expression contenant la chaîne légère constante Cκ (LCκ). vLλ produits PCR sont clonés dans un vecteur d’expression contenant la chaîne légère constante Cλ (LCλ).
    1. Effectuez les digestions suivantes :
      1. Mélanger 1 µg d’expression vector HCγ1 avec 10 unités de AgeI et 10 des endonucléases SalI dans un volume total de 20 µL de tampon de restriction recommandée par le fabricant et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
      2. Mélanger 1 µg de vecteur d’expression LCκ avec 10 unités d’enzyme de restriction AgeI dans un volume total de 20 µL de tampon de restriction recommandée par le fabricant et incuber pendant 1 heure à 37° C. Ajouter 10 unités d’enzyme de restriction BsiWI et incuber pendant 1 heure à 55 ° C.
      3. Mélanger 1 µg de vecteur d’expression LCλ avec 10 unités de AgeI et 10 des endonucléases XhoI dans un volume total de 20 µL de tampon de restriction recommandée par le fabricant et incuber pendant 1 heure à 37 ° C
    2. Faire chauffer chaque mélange de digestion à 65 ° C pendant 10 min inactiver les enzymes de restriction.
    3. Effectuer la ligature de 5 µL du produit PCR digéré avec 2 µL (100 ng) du vecteur d’expression linéarisé correspondante dans un volume total de 20 µL de 1 x tampon de DNA ligase avec 1 unité de T4 ADN-Ligase par incubation pendant une nuit à 4 ° C.
      NOTE : Vous pouvez également la ligature est effectuée pendant 3 h à 4° C.
  3. Le clonage
    1. Oligonucléotides 1 µL du mélange ligature 20 µL dans 45 µL de maison electrocompetent TOP10 e. coli (protocoles actuels en biologie moléculaire, section 1.8.4-1.8.8). Immédiatement ajouter 500 µL de milieu de YT X 2 et incuber dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 min. bactéries propagation transformée sur 2 x plaques ampicilline YT. Incuber une nuit à 37 ° C.
    2. Pour chaque transformation, écran huit colonies par PCR.
      1. Mettre en place un prémélange de réaction comme suit sur la glace : 45 µL de 5 x 12 µL de MgCl2 (25 mM), 4 µL des dNTPs (à partir d’un stock contenant 10 mM chacun), tampon PCR, 10 µL d’apprêt avant (stock de 10 µM) s’hybridant à la séquence de vecteur (amorce sens Ab-vec) et 10 µL d’apprêt inverse (stock de 10 µM) visant la région constante de chaîne lourde ou légère (voir Table des matières pour les séquences d’amorces). Maquillage pour un volume final de 200 µL avec H2O. Puis ajouter 4 µL d’enzyme ADN polymérase (5 U/µL).
      2. Distribuer 25 µL de prémélange de réaction par tube PCR 8-bande sur la glace.
      3. Utiliser un cure-dent stérile pour ramasser des colonies individuelles. Ensemencer le cure-dents sur une plaque d’ampicilline 2 x TY à constituer une plaque répétée et puis trempez-le dans un tube de réaction PCR.
      4. Effectuer le dépistage PCR dans les conditions suivantes de cyclisme : 94 ° C pendant 10 min, suivie de 25 cycles de 30 s à 94 ° C, 30 s à 55 ° C et 50 s à 72 ° C.
      5. Identifier les bactéries grampositives de migration 5 µL des produits PCR sur un gel d’agarose de 1,5 %.
        NOTE : Colonies positifs donnent un produit PCR environ 850 bp pour le vecteur de la chaîne lourde et 600 bp pour le vecteur de la chaîne légère.
    3. Ensemencer des quatre colonies positives de la plaque de répliquer dans 2 mL de milieu LB et incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min.
    4. Extraire les plasmides des cultures liquides à l’aide d’un kit de purification de plasmide, tel qu’indiqué par le fabricant.
    5. Vérifier la pose adéquate des domaines variables par Sanger séquençage des plasmides avec l’amorce de l’Ab-vec-sens.
      NOTE : Plasmides avec l’insert correct (codant pour le HC et la LC correspondant) doivent être cotransfectés dans des cellules 293 a de sécrétion. La spécificité de petite échelle-produit mAbs est analysée par ELISA. Puis, la production à grande échelle est exécutée le cas échéant.

6. la production d’ACM

  1. Production à petite échelle pour le contrôle de la spécificité
    1. La veille de la transfection, rein embryonnaire humain de semences 15 000 293 a (HEK 293 a) cellules dans 200 µL de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % FBS / puits dans les plaques à 96 puits. Incuber pendant la nuit dans un incubateur à CO2 (5 % CO2) à 37 ° C.
    2. Cotransfect 293 a cellules dans un milieu DMEM contenant 10 % BF utilisant un dérivé de polyéthylènimine linéaire comme réactif de transfection.
      Remarque : Effectuez la transfection dans réanalysés. Le protocole suivant est pour un puits d’une plaque de 96 puits de fond plat.
      1. Diluer 0,5 µL de réactif de transfection d’ADN en 10 µL de NaCl 150 mM. Diluer 0,125 µg de vH et 0,125 µg de vecteurs exprimant vL dans 10 µL de NaCl 150 mM. Vortex chaque dilution pour 10 s.
      2. Ajouter 10 µL dilué réactif de transfection d’ADN dans la solution d’ADN 10 µL. Vortex 15 s et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter le mélange de 20 µL goutte-à-goutte sur cellules 293 a et mélanger en agitant doucement la plaque.
    3. Remplacer le milieu 16 h après la transfection et cellules en culture pendant 5 jours dans un milieu sans sérum.
      NOTE : Utiliser un milieu sans sérum pour éviter sérum Igs contaminer les anticorps produits.
    4. Éliminer les cellules et les débris par centrifugation à 460 x g pendant 5 min.
    5. Récolter les surnageants par aspiration avec une pipette multicanaux et de les transférer dans une assiette à fond en V 96 puits.
    6. Manteau Ag pertinent durant la nuit à 4 ° C à 100 µL / puits de revêtement d’ELISA/ELISPOT reconstitué tampon 1 x à une concentration finale de 2 µg/mL en plaques ELISA 96 puits. Consultez les exemples dans 9.
    7. Puits de bloc avec milieu DMEM BF 10 % pendant 2 h à 37 ° C
    8. Ajouter 50 µL de surnageants de cellules transfectées 293 a partir de l’étape 6.1.5 et incuber pendant 2 h à température ambiante.
    9. Ajouter 100 µL d’une anti-humaine IgG Ab couplé à l’enzyme peroxydase de raifort (HRP) raifort à 1 µg/mL et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Ajoutez le substrat chromogénique de 50 µL (TMB) et incuber pendant 20 min.
    10. Lire la densité optique à 450 nm sur un spectrophotomètre.
      Remarque : Le mAbs spécifique révélé par l’analyse ELISA peut être également produit à grande échelle et purifié sur protéine une colonne présentant des affinités pour les IgG humaine.
  2. Production à grande échelle et la purification du mAbs spécifiques
    1. La veille de la transfection, rein embryonnaire humain de semences 6 x 106 293 a (HEK 293 a) des cellules dans des fioles de2 175 cm contenant 25 mL DMEM supplémenté de 10 % FBS. Incuber pendant la nuit dans un incubateur à CO2 (5 % CO2) à 37 ° C.
      Remarque : Les cellules doivent être anastomosé 70 % lorsque transfectées.
    2. Cotransfect 293 a cellules dans un milieu DMEM contenant 10 % BF utilisant un dérivé de polyéthylènimine linéaire comme réactif de transfection.
      1. Diluer 50 µL de réactif de transfection d’ADN en 450 µL de NaCl 150 mM. Diluer 10 µg de vH et 10 µg de vecteurs exprimant vL dans 500 µL de NaCl 150 mM. Vortex 10 s chaque dilution.
      2. Ajouter dilué réactif de transfection d’ADN à la solution d’ADN. Vortex 15 s et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter le mélange de 1 mL de titration aux cellules et mélanger en agitant doucement le flacon.
    3. Remplacer le milieu 16 h après la transfection et cellules en culture pendant 5 jours dans un milieu sans sérum.
    4. Moyen de récolte en aspirant avec une pipette 25 mL.
    5. Éliminer les cellules et les débris par centrifugation à 460 x g pendant 5 min.
    6. Purifier les anticorps en utilisant une colonne de 1 mL recouverte de protéine A un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide à 4 ° C.
      1. Equilibrer la protéine une colonne de Sépharose avec un tampon phosphate 20 mM (pH 7).
      2. Filtrer le milieu de culture cellulaire de 6.2.5 à l’aide d’un filtre de 1,22 m, puis un filtre de 0,45 µm.
      3. Charger le milieu filtré dans la colonne.
      4. Lavez avec un tampon phosphate 20 mM (pH 7) et éluer avec un tampon citrate de 0,1 M (pH 3,5).
      5. Lire les densités optiques à 280 nm sur un spectrophotomètre d’absorption et immédiatement neutraliser les fractions protéiques avec 1 M Tris tamponné (pH 9).
    7. Dialyser Ab purifié toute la nuit à 4 ° C dans une cassette avec un poids moléculaire de 3,5 K coupure contre tampon PBS (pH 7,4).
    8. Stériliser à 0,2 µm de filtration et contrôle de pureté par chromatographie d’exclusion stérique, telle qu’indiquée par le fabricant.

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Representative Results

À partir de PBMC de donneurs sains, ce présente projet la génération du mAbs humaine, qui reconnaît le peptide Pp65495 (Pp65, du cytomégalovirus humain) présentés par la classe complexe majeur d’histocompatibilité I (MHC-I) molécule HLA - A * 0201 () HLA-A2). Ces mAbs peuvent distinguer entre ce complexe et complexes qui représentent les autres peptides chargés sur le même MHC-I molécule.

PBMC ont été colorées avec HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC et tétramères HLA-A2/MelA2-BV421 comme décrit dans le protocole ci-dessus. Après enrichissement cellulaire d’immunomagnetic des cellules positives PE - et APC-tétramère, les cellules éluées ont été colorées avec le mAbs supplémentaires. Sur le trieur de cellules de cytométrie en flux, cellules magnétiquement enrichis ont été tout d’abord bloquées sur CD14 viable–CD16–CD3–CD19+ maillots de corps (cellules de B). La figure 1 illustre la stratégie de blocage utilisée pour isoler les cellules de B exprimant RCO capables de discriminer entre HLA-A2/Pp65 et d’autres associés complexes HLA-A2/peptide. Sélection de cellules de B d’intérêt ont été effectuée après blocage sur HLA-A2/Pp65 PE+ et HLA-A2/Pp65 APC+ double-positifs, pour exclure les fluorochrome spécifiques cellules de B qui ont été colorées individuellement PE+ ou APC+. Enfin, les cellules B hautement spécifiques ont été identifiés par blocage sur HLA-A2/MelA2-BV421 cellules négatives. Cela permet l’identification des cellules B exprimant RCO capable de se lier HLA-A2/Pp65, de façon dépendante de HLA-A2, peptide et distinguer ces cellules B et ceux dirigés contre β2 microglobuline, biotine, HLA-A2 ou ceux qui ne sont pas discriminatoires entre les peptides dans la rainure de liaison de MHC. Toutes ces cellules ce dernier sera BV421 les cellules positives. Comme précédemment indiqué et documenté plus loin d’autres types d’Ag, cette stratégie d’exclusion est plus importante en raison de l’augmentation de la capacité discriminative des cellules B pour l' Ag9.

Une fois que les cellules de B spécifiques uniques ont été triés, ADNc codant de lourds et lumière Ig-chaînes ont été amplifiées par RT-PCR. Paires de chaînes lourdes et légères codage segments ont été obtenus chez environ 50 % des cellules B simples testés (tableau 1). Domaine variable séquences ont été clonés puis en expression vecteurs contenant les séquences domaine constant correspondantes (lourde constant 1 et lumière constante κ ou λ). Les cellules embryonnaires de rein humain (HEK, cellules 293 a) ont été cotransfectés avec des vecteurs de chaînes lourdes et légères. Le mAbs sécrété d’isotype IgG1 ont été récolté sur les surnageants de culture de cellules 293 a 5 jours après la transfection (voir la Figure 3 pour la stratégie mondiale de production d’ACM entièrement humain). Cela réussi à produire un anticorps spécifique de HLA-A2/Pp65 à partir de 3 cellules seul lymphocyte B ce qui donne des paires de chaînes lourdes et légères codage secteurs (tableau 1). Tests ELISA a clairement démontré que cette mAb a été les deux MHC-peptide fonction et pour sa liaison à HLA-A2/Pp65 complexes (Figure 4 a), et plusieurs milligrammes de mAb ont été facilement produites pour une analyse plus approfondie (p. ex., analyses d’affinité, tests fonctionnels). Son affinité de liaison, déterminée par résonance plasmonique de surface (SPR), était d’environ 7 x 10-6 M (Figure 4 b).

Ainsi, cet article décrit une combinaison de méthodes sensibles et efficaces permettant la détection i) des cellules B Ag spécifiques pertinentes, même lorsqu’il est présent à très basses fréquences dans le sang des donneurs sains et ii) la création du mAbs humaine hautement discriminatoires.

Figure 1
Figure 1 : Détection des lymphocytes B spécifiques de HLA-A2/Pp65 de PBMC humaine.
3 x 108 PBMC ont été colorées avec HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC et tétramères HLA-A2/MelA2-BV421. Après enrichissement cellulaire d’immunomagnetic des cellules positives PE - et APC-tétramère, les cellules éluées ont été colorées avec le mAbs supplémentaires. Sur un trieur de cellules de cytométrie de flux, les cellules ont été bloquées tout d’abord sur viable singulet CD14–CD16 lymphocytes– (non représentés), puis sur CD19+CD3– cellules. Puis, cellules de B colorées avec des tétramères fois HLA-A2/Pp65-PE et HLA-A2/Pp65-APC ont été bloquées. Le tétramère de HLA-A2/MelA-BV421 a été utilisé pour exclure les cellules de B qui ne reconnaissent pas de HLA-A2/Pp65, un peptide et MHC-dépendant.

Figure 2
Figure 2 : stratégie pour l’amplification et le clonage de gènes Ig. Légère et lourde Ig-chaîne codage de gènes ont été amplifiées par RT-PCR nichée. Première PCR ont été effectuées avec un mélange d’amorces avant s’hybridant la région leader et inverse des amorces spécifiques pour les régions constantes de kappa approprié de lourd, léger ou de chaînes légères lambda. Deuxième PCRs ont été réalisées avec des amorces contenant des sites de restriction, amorces et inverses ont été respectivement spécifiques pour le début des segments V et pour la fin des segments J. Produits PCR ont été séquencés, digérés par les enzymes de restriction et clonés dans des vecteurs d’expression contenant des domaines constants appropriés. CMV : promoteur cytomégalovirus ; AmpR : gène de résistance à l’ampicilline.

Figure 3
Figure 3 : La stratégie globale de reconstruction du mAbs humaine recombinante.
Une stratégie axée sur le tétramère de tri permet de détecter des cellules B d’intérêt. Des cellules de B hautement spécifiques étaient unicellulaires triés. Segments de codage Ig-chaîne légères et lourdes ont été amplifiées par RT-PCR. Séquences de domaine variable ont été clonés dans des vecteurs d’expression eucaryote distincte dans le cadre avec des segments de gène codant constantes régions légers et lourdes. Le mAbs entièrement humain correspondant ont été exprimé par transfectées transitoirement des cellules HEK 293 a et purifié à partir du surnageant de culture. Ce chiffre a été modifié de Ouisse et al. (2017) 9.

Figure 4

Figure 4 : Caractérisation d’un représentant mAb hautement discriminatoire contre HLA-A2/Pp65 généré à partir du sang périphérique humain B cellules circulantes.
A) spécificité du mAb PC1.02 contre HLA-A2/Pp65 testés par ELISA. Plaques ont été recouverts de pertinentes (HLA-A2/Pp65) ou hors de propos HLA-A2 complexes contenant des peptides HLA-A2-limité : MelA, NS3 (VHC-1) et GagP17 (VIH-1) à 2 µg/mL, le mAb PC1.02 a été ajouté et un anti-homme IgG-HRP a été utilisé pour la détection. La densité optique (do) s’appliquait à 450 nm. B) détermination d’affinité de la mAb PC1.02 utilisant la résonance de Plasmon de Surface (SPR) en s’écoulant de différentes concentrations de HLA-A2/Pp65 complexes sur ACM de CM5 puce liée. Ce chiffre a été modifié de Ouisse et al. (2017) 9.

Nombre de PBMC Nombre de cellules PE + APC + après enrichissement Nombre de cellules (BV421 +) exclus Nombre de cellules individuelles triés Nombre de puits analysés Nombre de puits avec SC et LC associés (% de récupération) Nombre de mAbs produites Nombre de mAbs spécifiques
HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) 3 x 108 818 117 161 7 3 (43 %) 3 1

Tableau 1 : Analyse des lymphocytes B spécifiques de HLA-A2/Pp65.
L’impact de la stratégie d’exclusion des cellules de B non spécifiques, les rendements de l’amplification des gènes Ig et mAb production de cellules de B spécifiques de HLA-A2/Pp65 isolées ont été évalués/mesuré.

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Discussion

Le projet de protocole est une méthode puissante pour la production d’ACM humains directement à partir de cellules spécifiques Ag B circulant dans le sang. Il combine trois aspects importants : (i) l’utilisation d’un enrichissement magnétique tétramère-associés, qui permet une isolation ex vivo des cellules de B de liaison Ag même rares ; (ii) une stratégie de blocage qui utilise trois tétramères Ag (deux des plus pertinentes et un non pertinent) étiquetés avec trois fluorochromes différents d’isoler, par cytométrie en flux, seules les cellules B exprimant une spécifique BCR pour l’Ag désiré ; (iii) la reconstruction des ADNc mAb recombinante correspondante par RT-PCR au niveau de la cellule unique et expression des ADNc dans les cellules humaines.

Des études antérieures proposé d’utiliser un ou deux antigènes pertinents fluorescentes pour marquer les cellules B humaines avant production triage et suivantes du mAbs de la7,des6,de cellules isolées B8. Une analyse chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et l’autre dans un modèle de souris autoimmun, ont associé un antigène fluorescent non pertinent pour caractériser les cellules B autoréactives et déterminer leur fréquence10,11. Pour autant que nous le savons, utiliser une combinaison de deux tétramères d’antigène pertinentes fluorescent et un tétramère d’antigène non pertinent n’a pas été décrite précédemment pour l’enrichissement des cellules B spécifiques avant leur utilisation pour la production du mAbs pleinement humain. Cette méthode optimisée permet de pleinement humain mAbs discriminatoires en aussi peu qu’un mois et peut être réalisée avec succès même si à partir d’un répertoire de lymphocytes B naïfs. Ainsi, il n’a aucun des inconvénients majeurs de l’affichage de phage, immortalisation des cellules B humaines, ou autre décrite précédemment les interventions de reconstruction mAb axée sur la biologie moléculaire.

Cette cellule Tri stratégie se traduit par une reprise de rendement élevé du mAbs humaine Ag spécifiques. Paires de segments de chaînes lourdes et légères de simples cellules B isolées sont amplifiées avec un taux de réussite d’environ 50 %. Segments de chaînes légères sont presque toujours amplifiés, mais ce n’est pas le cas pour les segments de la chaîne lourde. Efficacité RT-PCR dépend fortement de respecter les points suivants : i) triés monocellules B doivent être gelés aussi rapidement que possible ; II) ajout de 30 unités d’inhibiteur de RNase et réduire le temps entre prendre les cellules B du congélateur et le lancement de la réaction de RT ; III) décongélation tous les apprêts sur glace ; IV) jamais gel/dégel amorces plus de trois fois ; v) Jersey amorces pour un maximum d’un an.

En ce qui concerne l’efficacité de la production des mAbs recombinante correspondante avec la spécificité requise, c’est environ 30 à 40 % de l’affaire pour SPHL mAbs spécifiques. Ces mAbs particuliers doivent reconnaître le peptide et la molécule MHC, qui est très exigeant, et nous avons déjà montré que le rendement global de récupération du mAbs spécifiques dirigés contre les antigènes plus conventionnels est supérieur, vers le haut à 100 % pour la Β-galactosidase antigène9. Il faut souligner que le choix d’un Ag appropriée pour le tétramère non pertinent est important d’augmenter la spécificité des mAbs produites.

L’affinité de l’ACM anti-HLA-A2/Pp65 (PC1.02) décrit dans le présent article est relativement faible, environ 7 x 10-6 M, semblable à l’affinité d’un TCR. Ce résultat était attendu, comme l’isolement de cellules B a été réalisée auprès de donateurs naïf. La plupart des cellules B tétramère+ étaient IgM+IgG-, ce qui réduit la probabilité d’obtenir bons Ag-lieuses. Néanmoins, cette méthode peut également rendre possible le tri de mémoire croisée B cellules contre une Ag désirée chez naïve des donneurs, en raison du passé immunologique des individus12. En outre, cette méthode est facilement applicable aux patients infectés ou vaccinés ou vaccinés des animaux humanisés, comme décrit dans 9, où la maturation en vivo affinité peut augmenter l’affinité du mAbs résultante d’environ 1 x 10-9 M. divers procédures ont également été décrites afin d’améliorer l’affinité du mAbs in vitro, en particulier grâce à reproduire le hypermutation somatique dans les cellules exprimant l’anticorps (évaluée à 13).

En conclusion, nous proposons une stratégie polyvalente pour la production d’ACM hautement discriminatoire qui peut être utilisée dans différents types de situation, d’un naïf individuel à un donneur vacciné ou un patient qui souffre d’une maladie auto-immune. MAbs entièrement humain généré de cette façon contre un épitope souhaitée pourrait être utile aussi bien pour l’immunothérapie et la recherche fondamentale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions la Cytometry Facility « CytoCell » (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) d’assistance technique d’experts. Nous remercions également tout le personnel de production de protéines recombinantes (P2R) et des plates-formes des IMPACT (INSERM 1232, Santé SFR, Biogenouest, Nantes) pour leur soutien technique. Nous remercions Emmanuel Scotet et Richard Breathnach pour des commentaires constructifs sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu financièrement par le projet IHU-Cesti, financé par le gouvernement Français « Investissements d’avenir », géré par l’Agence Français de la recherche nationale (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la Région Pays de la Loire. Ce travail a été réalisé dans le cadre du programme IGO LabEX pris en charge par l’Agence nationale de la recherche par l’intermédiaire de l’investissement du futur programme ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		 Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

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References

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Immunologie numéro 132 immunologie biologie cellulaire des anticorps humains lymphocytes B tétramère cytométrie en flux unicellulaire enrichissement spécifique de l’antigène magnétique

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang
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Devilder, M. C., Moyon, M.,… More

Devilder, M. C., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

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