Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट बी कोशिकाओं से रक्त में परिचालित में भेदभावपूर्ण मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56508
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

ERRATUM NOTICE

Summary

हम मानव रक्त में परिचालित दुर्लभ बी कोशिकाओं से शुरू करने, ब्याज की एक प्रतिजन के लिए विशिष्ट मानवीय एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए एक विधि का वर्णन । इन प्राकृतिक एंटीबॉडी की पीढ़ी कुशल और तेजी से है, और एंटीबॉडी प्राप्त उच्च संबंधित प्रतिजनों के बीच भेदभाव कर सकते हैं ।

Abstract

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) शक्तिशाली दोनों मौलिक अनुसंधान और चिकित्सा के लिए उपयोगी उपकरण हैं । उनके उच्च विशिष्टता अपरिहार्य है जब एंटीबॉडी को उच्च संबंधित संरचनाओं के बीच अंतर की जरूरत है (उदा., एक सामांय प्रोटीन और उसके संस्करण रूपांतरित) । इस तरह के भेदभाव mAbs पैदा करने के मौजूदा तरीके से कई एबी के व्यापक स्क्रीनिंग-बी कोशिकाओं का निर्माण शामिल है, जो दोनों महंगा है और समय लगता है । हम यहां एक तेजी से और लागत प्रभावी तरीका है, मानव रक्त संचारी बी लिम्फोसाइटों से शुरू भेदभाव, पूरी तरह से मानव mAbs की पीढ़ी के लिए विधि का प्रस्ताव । इस रणनीति की मौलिकता विशिष्ट प्रतिजन बंधन बी कोशिकाओं के चयन के लिए काउंटर के साथ संयुक्त सभी अंय कोशिकाओं के चयन के कारण है, आसानी से उपलब्ध परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं (PBMC) का उपयोग कर । एक बार विशिष्ट बी कोशिकाओं अलग कर रहे हैं, सीडीएनए (पूरक deoxyribonucleic एसिड) इसी मॉब के लिए कोडिंग जुगाड़ एकल सेल रिवर्स प्रतिलेखन का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं-पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) प्रौद्योगिकी और बाद में मानव में व्यक्त कोशिकाओं. के रूप में कम के रूप में 1 महीने के भीतर, यह उच्च भेदभावपूर्ण मानव mAbs की मिलीग्राम का उत्पादन करने के लिए संभव है स्वाभाविक रूप से बी सेल की प्रदर्शनियों द्वारा पता लगाया लगभग किसी भी वांछित प्रतिजन के खिलाफ निर्देश दिया ।

Introduction

विधि यहां वर्णित एक वांछित प्रतिजन (एजी) के खिलाफ पूरी तरह से मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) के तेजी से और बहुमुखी उत्पादन की अनुमति देता है । mAbs कई मौलिक अनुसंधान अनुप्रयोगों में इन विट्रो और vivo में: प्रवाह cytometry, प्रोटोकॉल, पश्चिमी सोख्ता, और उदाहरण के लिए अवरुद्ध प्रयोगों में आवश्यक उपकरण हैं । इसके अलावा, mAbs दवा में अधिक से अधिक इस्तेमाल किया जा रहा है स्व-प्रतिरक्षित रोग, कैंसर का इलाज, और ट्रांसप्लांटेशन अस्वीकृति को नियंत्रित करने के लिए1. उदाहरण के लिए, विरोधी CTLA-4 और विरोधी पीडी-1 (या विरोधी पीडी-L1) mAbs हाल ही में कैंसर के उपचार में प्रतिरक्षा चौकी अवरोधकों के रूप में इस्तेमाल किया गया था2.

पहला mAbs immunoglobulin (़) द्वारा उत्पादित किया गया-स्रावित hybridomas चूहों या चूहों की प्लीहा कोशिकाओं से प्राप्त प्रतिरक्षित. हालांकि, murine या चूहे mAbs के खिलाफ मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मनुष्यों में उनके चिकित्सीय उपयोग में बाधा, उनके तेजी से निकासी और अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं के संभावित प्रेरण के कारण3। इस समस्या से निपटने के लिए, mAbs के पशु प्रोटीन अनुक्रम आंशिक रूप से मानव लोगों द्वारा तथाकथित chimeric माउस-मानव या मानव एंटीबॉडी पैदा करने के लिए प्रतिस्थापित किया गया है । हालांकि, इस रणनीति केवल आंशिक रूप से immunogenicity कम हो जाती है, जबकि काफी लागत और उत्पादन के समय पैमाने दोनों बढ़ रही है । मानव बी कोशिकाओं से सीधे मानव mAbs उत्पन्न करने के लिए एक बेहतर समाधान है और इसके लिए कई रणनीतियों उपलब्ध हैं । उनमें से एक फेज या खमीर प्रदर्शन का उपयोग है । यह phages या खमीर पर यादृच्छिक मानव ़ भारी और प्रकाश श्रृंखला के एक मिश्रित पुस्तकालय से चर डोमेन प्रदर्शित शामिल है, और बाहर ले जाने के एक चयन कदम ब्याज की विशिष्ट प्रतिजन का उपयोग कर । इस रणनीति का एक प्रमुख दोष यह है कि भारी और हल्की चेन बेतरतीब ढंग से जुड़े हुए हैं, उत्पन्न एंटीबॉडी की विविधता में एक बहुत बड़ी वृद्धि करने के लिए अग्रणी. एंटीबॉडी प्राप्त की संभावना नहीं है कि उन है कि एक विशेष एजी के खिलाफ एक प्राकृतिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से उत्पंन होता है के अनुरूप हैं । इसके अलावा, मानव प्रोटीन तह और बाद के अनुवाद संशोधनों व्यवस्थित prokaryotes में या यहां तक कि खमीर में reproduced नहीं हैं । एक दूसरे मानव मॉब उत्पादन विधि प्राकृतिक मानव बी कोशिकाओं के immortalization है, Epstein-बर्र वायरस संक्रमण या विरोधी अपोप्तोटिक कारकों की अभिव्यक्ति द्वारा BCL-6 और BCL-XL4। हालांकि, इस विधि केवल स्मृति बी कोशिकाओं के लिए लागू है और अक्षम है, कई मॉब की स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है-के लिए कुछ की पहचान करने के लिए अमर बी कोशिकाओं का उत्पादन (यदि कोई हो) मॉब क्लोन वांछित प्रतिजनी विशिष्टता के साथ. विधि इस प्रकार महंगा और समय लेने वाली दोनों है ।

एक नया प्रोटोकॉल हाल ही में मानव mAbs के उत्पादन के लिए पृथक एकल बी कोशिकाओं से5का वर्णन किया गया है । यह एक अनुकूलित एकल सेल रिवर्स प्रतिलेखन-पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) दोनों भारी और हल्की श्रृंखला एक ही हल बी सेल से एंकोडिंग क्षेत्रों के प्रवर्धन के लिए पर निर्भर करता है । यह एक युकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणाली में इन क्षेत्रों की क्लोनिंग और अभिव्यक्ति के बाद, इस प्रकार एक पूरी तरह से मानव मॉब के पुनर्निर्माण की अनुमति है । इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया गया है सफलतापूर्वक टीके लगाए दाताओं से बी कोशिकाओं से शुरू । कोशिकाओं को कई हफ्तों के टीकाकरण के बाद बी की वांछित एजी के खिलाफ निर्देशित कोशिकाओं के उच्च आवृत्तियों प्राप्त करने के लिए काटा गया, और इस तरह6स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक समय सीमा । अन्य पूर्णतः मानव mAbs भी एचआईवी+ (ह्यूमन इम्यूनो वायरस) संक्रमित रोगियों7 और मेलेनोमा रोगियों8से उत्पादित किया गया है. इन अग्रिमों के बावजूद, वहां अभी भी कोई प्रक्रिया उपलब्ध है कि एजी-विशिष्ट बी उनकी स्मृति phenotype या आवृत्ति के स्वतंत्र कोशिकाओं के अलगाव में सक्षम बनाता है ।

यहां वर्णित प्रक्रिया उनके BCR विशिष्टता के आधार पर मानव परिसंचारी बी कोशिकाओं के कुशल पूर्व vivo अलगाव की ओर जाता है, उच्च उपज में पूरी तरह से मानव प्रतिजन विशेष mAbs के उत्पादन के बाद और एक कम स्क्रीनिंग समय के साथ । विधि स्मृति बी कोशिकाओं या एंटीबॉडी-स्रावित बी कोशिकाओं को एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बाद प्रेरित करने के लिए प्रतिबंधित नहीं है, लेकिन यह भी मानव भोली बी सेल प्रदर्शनों की प्रक्रिया के लिए लागू किया जा सकता है । यह भी काम करता है एजी से शुरू-विशिष्ट बी बहुत कम आवृत्तियों पर मौजूद कोशिकाओं अपनी कार्यकुशलता का एक अच्छा संकेत है । विधि का सिद्धांत इस प्रकार है: परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं (PBMC) दो tetramers के साथ दाग रहे है ब्याज की प्रतिजन पेश, प्रत्येक एक अलग fluorochrome के साथ लेबल (उदा, Phycoerythrin (पीई) और Allophycocyanin (APC)), और एक तीसरा tetramer एक तीसरे fluorochrome के साथ एक बारीकी से संबंधित प्रतिजन संयुग्मित पेश (उदा., प्रतिभाशाली वायलेट ४२१ (BV421)) । प्रतिजन-बाध्यकारी कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए, कोशिकाओं तो विरोधी पीई और विरोधी APC Abs के साथ लेपित मोतियों के साथ मशीन हैं, और सेल जुदाई कॉलम में हल । पीई+ APC+ सेल अंश चयनित है, बी कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देने के लिए विभिन्न PBMC सेल प्रकार के लिए विशिष्ट mAbs की एक किस्म के साथ दाग, और प्रवाह cytometry सेल छंटाई के अधीन । बी कोशिकाओं है जो पीई+ और APC+हैं, लेकिन शानदार वायलेट-, अलग कर रहे हैं । यह चरण काउंटर-उन कक्षों का चयन करता है जो B कक्ष नहीं है या tetramerized antigen को बाइंड नहीं करते हैं, लेकिन या तो पीई या apc (इन कोशिकाओं पे+ apc- या पीई- apc+) या tetramers उपयोग के गैर-प्रतिजनी भाग करने के लिए बाइंड कर (इन कक्षों को BV421+) किया जाएगा । B कक्ष रुचि के epitope के लिए अत्यधिक विशिष्ट नहीं हैं, इस चरण में भी काउंटर-चयनित हैं (ये कोशिकाएं BV421+भी होंगी) । इस प्रकार, इस विधि अत्यधिक विशिष्ट बी कोशिकाओं को शुद्ध कर सकते है बी-सेल रिसेप्टर्स (BCRs) दो बहुत बारीकी से संबंधित प्रतिजनों के बीच भेदभाव करने में सक्षम व्यक्त । एकल विशिष्ट बी कोशिकाओं ट्यूबों में एकत्र कर रहे है और उनकी पीसीआर-प्रवर्धित ़ cDNAs (पूरक deoxyribonucleic एसिड) क्लोन और गुप्त आईजीजी mAbs के रूप में एक मानव कोशिका लाइन द्वारा व्यक्त की ।

अवधारणा का एक प्रमाण के रूप में, इस अध्ययन मानव mAbs, जो एक प्रमुख histocompatibility जटिल वर्ग मैं (MHC-i) अणु द्वारा प्रस्तुत पेप्टाइड पहचान और एक ही पर लोड इस पेप्टाइड और अन्य पेप्टाइड्स के बीच भेदभाव कर सकते हैं की कुशल पीढ़ी का वर्णन MHC-मैं एलील । हालांकि इस एजी की जटिलता का स्तर महत्वपूर्ण है, इस विधि की अनुमति देता है (i) एजी-विशिष्ट mAbs के उच्च उपज वसूली; (ii) दो संरचनात्मक रूप से बंद Ags के बीच भेदभाव करने में सक्षम mAbs का उत्पादन । यह दृष्टिकोण किसी भी प्रोटोकॉल संशोधन के बिना टीका लगाए या संक्रमित रोगियों के लिए बढ़ाया जा सकता है, और भी पहले से ही सफलतापूर्वक एक मानवतावादी चूहे प्रणाली में लागू किया गया है9। इस प्रकार, इस अध्ययन के एक बहुमुखी और कुशल दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए पूरी तरह से मानव mAbs कि बुनियादी अनुसंधान और immunotherapy में इस्तेमाल किया जा सकता उत्पंन ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

स्थानीय नैतिकता समिति (Etablissement Français du ओरिजिनल, EFS, नांत, सामा PLER एनटीएस-2016-08) के अनुसार सभी मानव परिधीय रक्त नमूनों को सूचित सहमति के बाद अनाम वयस्क दाताओं से प्राप्त किया गया ।

1. मानव परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं का अलगाव

नोट: शुरू सामग्री कुल मानव परिधीय रक्त या cytapheresis नमूने हो सकता है । नमूने 8 एच से अधिक पुराने नहीं होना चाहिए और थक्का के साथ पूरक (उदा., हेपरिन) ।

  1. 2 खंड (मानव परिधीय रक्त) या RPMI (रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान) माध्यम के 5 खंड (cytapheresis नमूना) के साथ रक्त पतला ।
  2. ध्यान से एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में घनत्व ढाल मध्यम के 15 मिलीलीटर पर पतला सेल निलंबन के ३५ मिलीलीटर परत । सभी पतला रक्त वितरित करने के लिए आवश्यक के रूप में के रूप में कई ट्यूबों बनाओ । एक झूलते-ब्रेक के साथ बाल्टी रोटर में कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए १,२९० x g पर केंद्रापसारक ।
  3. ध्यान से घनत्व ढाल मध्यम और प्लाज्मा परत के बीच अंतरफलक पर mononuclear कोशिका परत महाप्राण, और एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
  4. RPMI माध्यम के साथ ट्यूब भरें, मिश्रण और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए १,२९० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को सावधानीपूर्वक निकालें ।
  5. RPMI मध्यम के 20 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड और २०० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए प्लेटलेट्स हटाने के लिए केंद्रापसारक । supernatant को सावधानीपूर्वक निकालें । इस चरण को एक बार दोहराएं ।
  6. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ RPMI माध्यम में सेल गोली reसस्पेंड ।
    नोट: tetramer लेबलिंग के लिए सीधे आगे बढ़ें या 107 कोशिकाओं की एकाग्रता पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को रखें/

2. Tetramer-एजी-विशिष्ट बी कोशिकाओं के संबद्ध चुंबकीय संवर्धन

  1. या तो पीई या APC-लेबल प्रीमियम ग्रेड streptavidin या BV421-लेबल streptavidin के एक दाढ़ अनुपात में 1:4 biotinylated प्रतिजन मोनोमर के लिए जोड़कर एजी-tetramers तैयार करते हैं । कमरे के तापमान पर हर 10 मिनट में एक aliquot जोड़ने, तीन अलग भागों में streptavidin-संयुग्म की उचित मात्रा में जोड़ें ।
  2. कोशिकाओं को वितरित (अप करने के लिए 3 एक्स 108 प्रति ट्यूब) 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में और 5 मिनट के लिए ४६० x g पर केंद्रापसारक ।
    नोट: निंनलिखित प्रोटोकॉल एक ट्यूब के लिए है ।
  3. 2% FBS के साथ पंजाब के २०० µ एल (फास्फेट बफर खारा) में सेल गोली reसस्पेंड । पीई जोड़ें-, APC-, और BV421-संयुग्मित tetramers, प्रत्येक के लिए एक अंतिम एकाग्रता 10 µ g/एमएल । अच्छी तरह से मिश्रण और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गर्मी ।
  4. ०.५% BSA (गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन) और EDTA (Ethylenediaminetetraacetic एसिड) 2 मिमी के साथ पंजाब का उपयोग करके आइस-कोल्ड सेल पृथक्करण बफर (एसबी) तैयार करें ।
  5. 5 मिनट के लिए ४६० x g पर केंद्रापसारक द्वारा SB. गोली कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. ५०० में कोशिकाओं reसस्पेंड बर्फ-ठंडा SB के µ एल । एंटी-पे के ५० µ एल और एंटी-APC चुंबकीय microbeads के ५० µ एल जोड़ें ।
  7. अच्छी तरह से मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए गर्मी ।
  8. दोहराएं चरण २.५ दो बार ।
  9. बर्फ ठंडा SB में 2 x 108 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर supernatant ध्यान से andresuspend सेल गोली को खत्म ।
  10. Equilibrate एक बड़े चुंबकीय SB के 3 मिलीलीटर के साथ एक चुंबक पर तैनात कॉलम ।
  11. equilibrated कॉलम के शीर्ष पर २.९ से स्थानांतरण सेल निलंबन और यह पूरी तरह से नाली के लिए अनुमति देते हैं । महत्वपूर्ण कदम: कॉलम के झुरमुट से बचने के लिए, एक ७० µm नायलॉन जाल के माध्यम से कोशिकाओं को पारित ।
  12. ट्यूब जो बर्फ ठंडा SB के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को समाहित कुल्ला और बफर सीधे कॉलम पर स्थानांतरण (निस्पंदन के मामले में, ७० µm नायलॉन जाल कुल्ला) ।
  13. जब बफर कॉलम में पूरी तरह से सूखा है, एक और 3 मिलीलीटर बर्फ शीत SB के कॉलम में जोड़ें ।
  14. एक और 3 एमएल धोने के लिए २.१३ कदम दोहराएं ।
  15. चुंबक और जगह से एक 15 मिलीलीटर शंकु इकट्ठा ट्यूब पर कॉलम निकालें ।
  16. स्तंभ के शीर्ष पर बर्फ ठंड SB के 5 मिलीलीटर जोड़ें और तुरंत सवार का उपयोग कर स्तंभ से बाहर कोशिकाओं फ्लश । इस चरण को एक बार दोहराएं ।
  17. एकत्र कोशिकाओं को (समृद्ध प्रासंगिक tetramer सकारात्मक कोशिका अंश) ४६० x g पर 5 मिनट के लिए और अतिरिक्त एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए आगे बढ़ना ।
    नोट: पूल सभी ट्यूबों से एकत्र कोशिकाओं, अगर उचित है ।

3. एजी के धुंधला-विशिष्ट मानव बी कोशिकाओं और सेल छंटाई

  1. CD3 के खिलाफ विरोधी मानव एंटीबॉडी के एक कॉकटेल (अंतिम कमजोर पड़ने: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), और 7AAD (1:1000) के खिलाफ एक अंतिम मात्रा में के साथ सेल गोली reसस्पैंड 2% µ के साथ पंजाब के १०० FBS एल । 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  2. पंजाब के 10 मिलीलीटर कोशिकाओं को जोड़ें, 5 मिनट के लिए ४६० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant को खत्म करने । इस चरण को एक बार दोहराएं । २०० पंजाब के µ एल में सेल गोली reसस्पेंड, ७० µm नायलॉन जाल पर फिल्टर ।
  3. किसी कक्ष पर एकल कक्ष स्तर पर विशिष्ट B कक्षों को सॉर्ट करने के लिए आगे बढ़ें सॉर्टर cytometer के साथ एक १०० µm नोक और 20 साई के दबाव से अधिक १,००० घटनाओं/एस9
    नोट: गेटिंग कार्यनीति का उपयोग चित्र 1में दिखाया गया है। कक्ष पहले CD14-CD16-7AAD- कक्षों को monocytes, NK, और मृत कक्षों को छोड़ने के लिए gated थे ( चित्र 1में नहीं दिखाए गए) । फिर CD19+ बी कोशिकाओं के पीई और APC प्रासंगिक एजी-tetramers द्वारा डबल सना हुआ कोशिकाओं पर गेटिंग से पहले चयन किया गया । गैर विशिष्ट बी कोशिकाओं BV421 नकारात्मक कोशिकाओं पर गेटिंग द्वारा बाहर रखा गया (अप्रासंगिक एजी-tetramer द्वारा दाग) ।
  4. 8 पट्टी पीसीआर ट्यूबों में एक बी कोशिकाओं को इकट्ठा पहले 1x पंजाबियों के 10 µ एल और RNAse अवरोध करनेवाला के 10 इकाइयों के साथ भरा और ९६ microtubes के लिए एक रैक पर रखा । तुरंत-८० डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर ट्यूबों फ्रीज ।
    नोट: cytometer साधन पर चुना सॉर्ट मास्क उपज मुखौटा हैं: 0, शुद्धता मास्क: ३२, और चरण मास्क: 0. इस एकल सेल जमा एक ९६-या ३८४ अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट अगर जरूरत को समायोजित किया जा सकता है । एकल बी कोशिकाओं के रूप में जल्दी संभव के रूप में जम जाना चाहिए और कई हफ्तों के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर छोड़ा जा सकता है, अगर जरूरत है ।

4. सिंगल सेल आरटी-पीसीआर

  1. लाइसे कोशिकाओं को सीधे एक सूखी स्नान में 5 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर स्ट्रिप्स में जमे हुए नमूनों हीटिंग ।
  2. बर्फ के लिए स्ट्रिप्स स्थानांतरण और 1 मिमी dNTP युक्त एक 2x मास्टर मिश्रण बफर के ट्यूब प्रति 10 µ एल जोड़ने के द्वारा प्रतिलेखन (आरटी) रिवर्स करने के लिए आगे बढ़ना, 25 µ जी/एमएल oligod (टी) प्राइमरों, 5 µ एम रैंडम hexamers, RNAse अवरोध करनेवाला की 20 इकाइयों, और रिवर्स transcriptase की ४०० इकाइयों ।
    नोट: सेल गल जाने के बाद, आर सी आरएनए गिरावट से बचने के लिए जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
  3. 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन संकरण करने के लिए यादृच्छिक hexamers अनुमति देने के लिए, तो ५० ° c पर 1 ज के लिए गर्मी, और 3 मिनट के लिए ९५ ° c पर एक मशीन के साथ खत्म करने के लिए प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ।
  4. चर हेवी (vH) और कापा (vLκ) या लैंब्डा लाइट चेन (vLλ) के लिए एंकोडिंग क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए नेस्टेड पीसीआर प्रवर्धन के दो दौर के साथ आगे बढ़ें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, आर टी नमूने पर जम जा सकता है-20 ° c और एक सप्ताह के लिए रखा.
    1. पीसीआर के पहले राउंड के लिए ४० µ एल अंतिम खंड के लिए सीडीएनए के 3 µ l जोड़ें १.५ mm MgCl2, ०.२५ mm dNTPs, डीएनए पोलीमरेज़ के २.५ इकाइयों, और बाहरी प्राइमरों के २०० एनएम (देखें चित्रा 2 और प्राइमरी दृश्यों के लिए सामग्री की मेज ) ।
      नोट: बाहरी प्राइमरों की रचनाएं मिक्स । भारी श्रृंखला के लिए प्रवर्धन: 4 फॉरवर्ड प्राइमरों (5 ' LVH मिश्रण) और 2 रिवर्स प्राइमरों (3 ' सी µc γ मिश्रण) । लाइट कापा चेन प्रवर्धन के लिए, 3 फॉरवर्ड प्राइमरों (5 ' LV. mix) और 1 रिवर्स प्राइमर (3 ' cκ 543-566) । प्रकाश लैंब्डा श्रृंखला प्रवर्धन के लिए, 7 फॉरवर्ड प्राइमरों (5 ' LVl मिश्रण) और 1 रिवर्स प्राइमर (3 ' सीएल) ।
      नोट: प्राइमर्स टिलर एट अल द्वारा डिजाइन किए गए सभी भारी और प्रकाश श्रृंखला परिवार के प्रवर्धन के लिए5जीन ।
    2. निंनलिखित सायक्लिंग शर्तें लागू करें: ९४ ° c 4 मिनट के लिए, ९४ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के ४० चक्र के बाद, 30 एस VH और VLκ के लिए ५८ डिग्री सेल्सियस पर (VLλ के लिए ६० डिग्री सेल्सियस), और ५५ ° c पर एक अंतिम बढ़ाव कदम के साथ, ७२ ° c 7 मिनट के लिए ।
    3. दूसरा दौर पीसीआर के लिए, ४० µ एल की एक अंतिम मात्रा के लिए पहले प्रवर्धन उत्पाद के 3 µ एल का उपयोग १.५ mM MgCl2, ०.२५ mm dNTPs, डीएनए पोलीमरेज़ की २.५ इकाइयों, और इनर प्राइमरों के २०० समुद्री मील दूर अभिव्यक्ति में क्लोनिंग के लिए प्रतिबंध एंजाइम साइटों युक्त वैक्टर (देखें चित्रा 2 और प्राइमरी दृश्यों के लिए सामग्री की तालिका ) ।
      ध्यान दें: इनर प्राइमरों के मिश्रण की रचना । भारी श्रृंखला के लिए प्रवर्धन: 9 फॉरवर्ड प्राइमरों (5 ' AgeIVH मिश्रण) और 3 रिवर्स प्राइमरों (3 ' SalIJH मिश्रण) । लाइट कापा चेन प्रवर्धन के लिए 9 फॉरवर्ड प्राइमरी (5 ' AgeIV | मिक्स) और 3 रिवर्स प्राइमर (3 ' BsiWIJκ मिक्स) । प्रकाश लैंब्डा श्रृंखला प्रवर्धन के लिए, 6 फॉरवर्ड प्राइमरों (5 ' AgeIVl मिश्रण) और 1 रिवर्स प्राइमर (3 ' XhoICl) ।
      नोट: प्राइमर्स टिलर एट अलद्वारा डिजाइन किए थे, भारी और प्रकाश श्रृंखला परिवार के सभी के प्रवर्धन के लिए जीन5।
    4. निंनलिखित सायक्लिंग शर्तें लागू करें: ९४ ° c 4 मिनट के लिए, 94 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के ४० चक्र के बाद, VH और LCκ के लिए ५८ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस (LCλ के लिए ६० डिग्री सेल्सियस), और ४५ पर ७२ ° c पर एक अंतिम बढ़ाव कदम के साथ ७२ ° c 7 मिनट के लिए ।
  5. vH, vLκ और vLλ के पीसीआर प्रॉडक्ट्स की 5 μL को १.५% agarose जेल (चर हेवी चेन एंकोडिंग सेगमेंट के लिए ५०० बीपी प्रॉडक्ट्स और चर लाइट चेन एंकोडिंग सेगमेंट के लिए ३५० बीपी प्रोडक्ट) पर माइग्रेट करके पॉजिटिव वेल्स की पहचान करें ।
  6. पीसीआर उत्पादों की शुद्धि के लिए बनाए गए ultrafiltration झिल्ली का उपयोग करते हुए शेष ३५ µ एल पीसीआर उत्पादों को सकारात्मक कुओं से शुद्ध करना ।
  7. Elute पीसीआर प्रॉडक्ट्स विथ ६० µ एल ऑफ एच2ओ.

5. अभिव्यक्ति क्लोनिंग

  1. सम्मिलित करें तैयार
    नोट: एक अंतिम मात्रा में १०० µ एल के उचित प्रतिबंध एंजाइम बफर युक्त प्रत्येक शुद्ध पीसीआर उत्पाद के ६० µ एल डाइजेस्ट ।
    1. vH पीसीआर उत्पादों के लिए, AgeI और SalI की ५० इकाइयों की ५० इकाइयां जोड़ें, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
    2. vLλ पीसीआर उत्पादों के लिए, AgeI की ५० इकाइयों और XhoI की ५० इकाइयों को जोड़ने, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
    3. vLκ पीसीआर उत्पादों के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए AgeI की ५० इकाइयों और मशीन जोड़ें । H2O के ६० µ l के साथ ९६ पीसीआर झिल्ली और elute का उपयोग करके डाइजेस्टर को शुद्ध करें । µ प्रतिबंध एंजाइम बफर के १०० BsiWI एल की एक अंतिम मात्रा में ६० µ एल eluate डाइजेस्ट, BsiWI की ५० इकाइयों को जोड़ने, और 1 के लिए मशीन ५५ डिग्री सेल्सियस पर ।
    4. 15 मिनट के लिए ८० ° c पर हीटिंग द्वारा एंजाइमों को निष्क्रिय ।
  2. वैक्टर व्यक्त करने की तैयारी
    नोट: vH पीसीआर उत्पादों IgG1 की लगातार भारी श्रृंखला Cγ1 युक्त एक अभिव्यक्ति वेक्टर (HCγ1) में क्लोन कर रहे हैं । vLκ पीसीआर उत्पादों एक अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन कर रहे है (LCκ) निरंतर प्रकाश श्रृंखला Cκ युक्त । vLλ पीसीआर उत्पादों एक अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन कर रहे है (LCλ) निरंतर प्रकाश श्रृंखला Cλ युक्त ।
    1. निम्नलिखित पाचक प्रदर्शन:
      1. मिश्रण 1 अभिव्यक्ति के µ जी HCγ1 AgeI की 10 इकाइयों और SalI endonucleases की 10 इकाइयों के साथ 20 µ एल के एक कुल मात्रा में प्रतिबंध बफर के निर्माता द्वारा अनुशंसित है, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए मशीन ।
      2. मिश्रण 1 µ जी अभिव्यक्ति वेक्टर LCκ की 10 इकाइयों के साथ AgeI प्रतिबंध एंजाइम की कुल मात्रा में 20 µ एल के प्रतिबंध बफर के निर्माता द्वारा अनुशंसित है, और के लिए 1 ज मशीन 37 ° c. BsiWI प्रतिबंध एंजाइम की 10 इकाइयों जोड़ें, और ५५ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
      3. मिश्रण 1 µ जी की अभिव्यक्ति वेक्टर LCλ की 10 इकाइयों के साथ AgeI और XhoI endonucleases की 10 इकाइयों की कुल मात्रा में 20 µ एल के प्रतिबंध बफर के निर्माता द्वारा अनुशंसित, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए मशीन
    2. ६५ ° c पर प्रत्येक पाचन मिश्रण गर्मी 10 मिनट के लिए प्रतिबंध एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए ।
    3. 2 µ l (१०० एनजी) के साथ पचता पीसीआर उत्पाद के 5 µ एल के बंधाव प्रदर्शन 4 ° c पर रात भर गर्मी से ligase-टी-6 डीएनए की 1 इकाई के साथ 1x डीएनए ligase बफर के 20 µ एल की कुल मात्रा में सदिश ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, बंधाव 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए किया जाता है ।
  3. क्लोनिंग
    1. Electroporate 1 µ एल के 20 µ एल बंधाव मिश्रण के ४५ µ एल में घर का बना electrocompetent TOP10 ई. कोलाई (आणविक जीव विज्ञान में वर्तमान प्रोटोकॉल, धारा 1.8.4-1.8.8). तुरंत 2x YT मध्यम के ५०० µ एल जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान में गर्मी 30 मिनट के लिए 2x YT एम्पीसिलीन प्लेटों पर फैले बैक्टीरिया बदल । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    2. प्रत्येक परिवर्तन के लिए, पीसीआर द्वारा आठ कॉलोनियों स्क्रीन ।
      1. एक प्रतिक्रिया premix सेट अप के रूप में बर्फ पर इस प्रकार है: ४५ µ 5x पीसीआर बफर की एल, 12 µ l के MgCl2 (25 मिमी), dNTPs के 4 µ l (प्रत्येक के 10 मिमी युक्त स्टॉक से), 10 µ एल के फॉरवर्ड प्राइमरी (स्टॉक 10 µ मी) वेक्टर अनुक्रम (प्राइमरी Ab-hybridizing-नब्ज) को vec , और रिवर्स प्राइमर के 10 µ एल (शेयर 10 µ एम) लगातार भारी या हल्की श्रृंखला क्षेत्र लक्ष्यीकरण (प्राइमर दृश्यों के लिए सामग्री की तालिका देखें) । एच2ओ के साथ २०० µ एल के एक अंतिम मात्रा तक बनाओ । इसके बाद DNA पोलीमरेज़ एंजाइम (5 U/µ l) के 4 µ l को जोड़ें ।
      2. बर्फ पर 8 पट्टी पीसीआर ट्यूब के प्रति प्रतिक्रिया premix के 25 µ l को वितरित करें ।
      3. एक बाँझ दंर्तखोदनी का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत कालोनियों उठाओ । एक 2x TY एम्पीसिलीन प्लेट पर दंर्तखोदनी लकीर को दोहराने की थाली का गठन और फिर यह एक पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में डुबकी ।
      4. निम्नलिखित सायक्लिंग शर्तों के तहत स्क्रीनिंग पीसीआर प्रदर्शन: ९४ ° c 10 मिनट के लिए, ९४ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 25 चक्र के बाद, ५५ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, और ५० एस ७२ डिग्री सेल्सियस पर ।
      5. पीसीआर प्रॉडक्ट्स के 5 µ l को १.५% agarose जेल पर माइग्रेट करके पॉजिटिव बैक्टीरिया की पहचान करें ।
        नोट: धनात्मक कालोनियों भारी श्रृंखला वेक्टर और ६०० बीपी के लिए प्रकाश श्रृंखला वेक्टर के लिए ८५० बीपी के आसपास एक पीसीआर उत्पाद दे ।
    3. लगाना पौंड मध्यम के 2 मिलीलीटर में दोहराने की थाली से चार सकारात्मक कालोनियों और २०० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    4. एक प्लाज्मिड शोधन किट का उपयोग कर तरल संस्कृतियों से plasmids निकालें, के रूप में निर्माता द्वारा संकेत दिया ।
    5. अटल बिहारी vec-नब्ज प्राइमर के साथ plasmids के सैंज अनुक्रमण द्वारा चर डोमेन की सही प्रविष्टि की जाँच करें ।
      नोट: सही डालने के साथ Plasmids (एचसी और इसी नियंत्रण रेखा एंकोडिंग) को स्राव के लिए 293A कोशिकाओं में cotransfected हो रहे हैं । छोटे पैमाने पर उत्पादित mAbs की विशिष्टता एलिसा द्वारा परख की जाती है । फिर, यदि लागू हो तो बड़े पैमाने पर उत्पादन किया जाता है ।

6. mAbs का उत्पादन

  1. विशिष्टता की जाँच के लिए लघु पैमाने पर उत्पादन
    1. अभिकर्मक के पहले दिन, बीज १५,००० मानव भ्रूण गुर्दे 293A (HEK 293A) µ के संशोधित ईगल मध्यम (Dulbecco) के २०० DMEM एल में कोशिकाओं ९६ अच्छी तरह से प्लेटों में प्रति 10% FBS के साथ पूरक । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन (5% सह2) में रातोंरात मशीन ।
    2. Cotransfect 293A कोशिकाओं DMEM माध्यम में 10% FBS polyethylenimine एजेंट के रूप में एक रैखिक अभिकर्मक व्युत्पंन का उपयोग कर ।
      नोट: triplicates में अभिकर्मक निष्पादित करें । निंनलिखित प्रोटोकॉल एक फ्लैट नीचे ९६ अच्छी तरह से प्लेट की अच्छी तरह से एक के लिए है ।
      1. १५० mM NaCl के 10 µ l में डीएनए अभिकर्मक रिएजेंट का पतला ०.५ µ एल. vH के ०.१२५ µ g को पतला करना और वीएल के ०.१२५ µ g को 10 µ l के १५० mM NaCl में वेक्टर्स में व्यक्त करना । भंवर प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए 10 एस ।
      2. 10 µ l डीएनए सॉल्यूशन में 10 µ l पतला डीएनए अभिकर्मक रिएजेंट जोड़ें । भंवर 15 एस और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए गर्मी । 293A कोशिकाओं पर 20 µ एल मिक्स ड्रॉप वार जोड़ें, और धीरे थाली घूमता द्वारा मिश्रण ।
    3. सीरम मुक्त माध्यम में 5 दिनों के लिए अभिकर्मक और संस्कृति कोशिकाओं के बाद मध्यम 16 एच बदलें ।
      नोट: सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग करने के लिए उत्पादन एंटीबॉडी प्रदूषित serum Igs से बचने के.
    4. 5 मिनट के लिए ४६० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं और मलबे को हटा दें ।
    5. एक मल्टी चैनल पिपेट के साथ आकांक्षा द्वारा हार्वेस्ट supernatants और एक वी नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली में उन्हें हस्तांतरण.
    6. कोट प्रासंगिक एजी में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात १०० µ पुनर्गठन के प्रति अच्छी तरह से गठित एलिसा/ELISPOT कोटिंग बफर 1x के एक अंतिम एकाग्रता में 2 µ g/mL में ९६-वेल एलिसा प्लेट । 9में उदाहरण देखें ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 10% FBS DMEM माध्यम के साथ कुओं ब्लॉक
    8. कदम 6.1.5 से transfected 293A कोशिकाओं के supernatants के ५० µ एल जोड़ें, और आरटी पर 2 एच के लिए मशीन ।
    9. एक विरोधी के १०० µ एल जोड़ें मानव आईजीजी एबी संयुग्मित के लिए सहिजन peroxidase (एचआरपी) 1 µ जी पर एंजाइम/एमएल और 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । जोड़ें ५० µ l chromogenic सब्सट्रेट (TMB), और 20 मिनट के लिए मशीन ।
    10. एक spectrophotometer पर ४५० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें ।
      नोट: एलिसा परख द्वारा पता चला विशिष्ट mAbs आगे बड़े पैमाने पर उत्पादन किया जा सकता है और प्रोटीन पर शुद्ध एक मानव आईजीजी के लिए अपनत्व पेश कॉलम ।
  2. बड़े पैमाने पर उत्पादन और विशिष्ट mAbs का शुद्धिकरण
    1. अभिकर्मक के पहले दिन, बीज 6 x 106 मानव भ्रूण गुर्दे 293A (HEK 293A) कोशिकाओं में १७५ सेमी2 कुप्पी 25 मिलीलीटर DMEM 10% FBS के साथ पूरक युक्त । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन (5% सह2) में रातोंरात मशीन ।
      नोट: transfected जब कोशिकाओं ७०% धाराप्रवाह होना चाहिए ।
    2. Cotransfect 293A कोशिकाओं DMEM माध्यम में 10% FBS polyethylenimine एजेंट के रूप में एक रैखिक अभिकर्मक व्युत्पंन का उपयोग कर ।
      1. १५० मिमी NaCl के ४५० µ एल में डीएनए अभिकर्मक रिएजेंट के ५० µ एल पतला । vH के 10 µ g को पतला करना और वीएल के 10 µ g को १५० mM µ के ५०० NaCl l में वैक्टर व्यक्त करना । भंवर 10 प्रत्येक कमजोर पड़ने एस ।
      2. डीएनए समाधान के लिए पतला डीएनए अभिकर्मक एजेंट जोड़ें । भंवर 15 एस और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए गर्मी । कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर मिक्स ड्रॉप वार जोड़ें, और धीरे कुप्पी घूमता द्वारा मिश्रण ।
    3. सीरम मुक्त माध्यम में 5 दिनों के लिए अभिकर्मक और संस्कृति कोशिकाओं के बाद मध्यम 16 एच बदलें ।
    4. एक 25 मिलीलीटर पिपेट के साथ aspirating द्वारा हार्वेस्ट मध्यम ।
    5. 5 मिनट के लिए ४६० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं और मलबे को हटा दें ।
    6. एक 1 एमएल स्तंभ 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली पर एक प्रोटीन के साथ लेपित का उपयोग कर एंटीबॉडी शुद्ध ।
      1. Equilibrate 20 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 7) के साथ एक sepharose कॉलम प्रोटीन ।
      2. एक १.२२ µm फ़िल्टर का उपयोग 6.2.5 से सेल संस्कृति माध्यम फ़िल्टर, तो एक ०.४५ µm फिल्टर ।
      3. फ़िल्टर्ड माध्यम को स्तंभ पर लोड करना ।
      4. 20 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 7) और एक ०.१ एम साइट्रेट बफर (पीएच ३.५) के साथ elute के साथ धो लें ।
      5. एक अवशोषण spectrophotometer पर २८० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें और तुरंत 1 एम Tris बफर (पीएच 9) के साथ प्रोटीन युक्त अंश बेअसर ।
    7. Dialyze शुद्ध अटल बिहारी एक कैसेट में 4 ° c पर रातोंरात एक 3.5 k के साथ एक साथ आणविक भार के लिए पंजाबियों बफर (पीएच ७.४) कटऑफ ।
    8. ०.२ µm निस्पंदन द्वारा बंध्याकरण और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा नियंत्रण शुद्धता, के रूप में निर्माता द्वारा संकेत दिया ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रस्तावित प्रोटोकॉल मानव mAbs की पीढ़ी के लिए एक शक्तिशाली विधि है सीधे रक्त में घूम एजी विशेष बी कोशिकाओं से । यह तीन महत्वपूर्ण पहलुओं को जोड़ती है: (i) एक tetramer के उपयोग-एसोसिएटेड चुंबकीय संवर्धन, जो भी दुर्लभ एजी-बाध्यकारी बी कोशिकाओं के एक पूर्व vivo अलगाव की अनुमति देता है; (ii) एक गेटिंग रणनीति है कि तीन एजी tetramers का उपयोग करता है (दो प्रासंगिक और एक अप्रासंगिक एक) तीन अलग fluorochromes के साथ लेबल को अलग करने के लिए, प्रवाह cytometry द्वारा, केवल बी एक वांछित एजी के लिए विशिष्ट BCR व्यक्त कोशिकाओं; (iii) एकल कोशिका स्तर और मानव कोशिकाओं में cDNAs की अभिव्यक्ति पर RT-पीसीआर द्वारा इसी संयोजक मॉब cDNAs का पुनर्निर्माण.

पिछले अध्ययन एक या दो फ्लोरोसेंट प्रासंगिक प्रतिजनों छंटाई और अलग बी कोशिकाओं से mAbs के बाद उत्पादन6,7,8से पहले मानव बी कोशिकाओं लेबल का उपयोग प्रस्तावित । रुमेटी गठिया के साथ रोगियों में एक विश्लेषण, और एक प्रतिरक्षा माउस मॉडल में एक, एक अप्रासंगिक फ्लोरोसेंट प्रतिजन जुड़े है के लिए प्रतिक्रिया बी कोशिकाओं की विशेषता और उनके आवृत्ति10,11निर्धारित करते हैं । जहां तक हम जानते हैं, दो फ्लोरोसेंट प्रासंगिक प्रतिजन tetramers और एक अप्रासंगिक प्रतिजन tetramer का एक संयोजन का उपयोग पहले से विशिष्ट बी कोशिकाओं के संवर्धन के लिए नहीं बताया गया है पूरी तरह से मानव mAbs के उत्पादन के लिए उनके उपयोग से पहले । इस अनुकूलित विधि पूरी तरह से मानव भेदभाव mAbs के रूप में एक महीने के रूप में कम से प्राप्त किया जा अनुमति देता है, और सफलतापूर्वक भी प्रदर्शन किया जा सकता है जब एक भोली बी सेल की प्रदर्शनियों से शुरू । इस प्रकार, यह फेज प्रदर्शन, मानव बी सेल immortalization, या अंय पहले से वर्णित आणविक जीव विज्ञान मॉब पुनर्निर्माण प्रक्रियाओं के प्रमुख कमियों में से कोई नहीं है ।

इस सेल एजी के एक उच्च उपज वसूली विशिष्ट मानव mAbs में रणनीति के परिणाम छंटाई । एकल अलग बी कोशिकाओं से भारी और प्रकाश श्रृंखला क्षेत्रों के जोड़े लगभग ५०% की सफलता दर के साथ परिलक्षित कर रहे हैं । प्रकाश श्रृंखला क्षेत्रों लगभग हमेशा परिलक्षित होते हैं, लेकिन यह भारी श्रृंखला क्षेत्रों के लिए मामला नहीं है । RT-पीसीआर दक्षता निंनलिखित बिंदुओं का संमान करने पर भारी निर्भर करता है: i) एकल बी कोशिकाओं के रूप में संभव के रूप में जल्दी जमे हुए किया जाना चाहिए; ii) RNase अवरोधक की 30 इकाइयों को जोड़ने और बी कोशिकाओं को फ्रीजर से बाहर ले जाने और आरटी प्रतिक्रिया शुरू करने के बीच के समय को कम करना; iii) बर्फ पर सभी प्राइमरों गल; iv) कभी भी तीन बार से अधिक ठंड नहीं लगना; v) एक वर्ष की अधिकतम के लिए मोजा प्राइमरों ।

वांछित विशिष्टता के साथ इसी संयोजक mAbs की उत्पादन क्षमता के विषय में, यह pMHC विशिष्ट mAbs के लिए मामले के बारे में 30-40% है । इन विशेष mAbs के लिए दोनों पेप्टाइड और MHC अणु है, जो काफी मांग है पहचान है, और हम पहले से पता चला है कि विशिष्ट mAbs अधिक पारंपरिक एंटीजन के खिलाफ निर्देश की वसूली की समग्र उपज बेहतर है, के लिए १००% तक β-galactosidase antigen9. यह है कि अप्रासंगिक tetramer के लिए एक उपयुक्त एजी के विकल्प का उत्पादन mAbs की विशिष्टता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है पर जोर दिया जाना चाहिए ।

anti-एचएलए-A2/Pp65 मॉब (pc 1.02) के संबध वर्तमान आलेख में वर्णित अपेक्षाकृत कम है, के बारे में 7 x 10-6 M, एक TCR के संबध के समान । इस परिणाम की उंमीद थी, के रूप में बी सेल अलगाव भोले दाताओं से प्रदर्शन किया गया । अधिकांश tetramer+ बी कोशिकाओं आईजीएम+आईजीजी-थे, जो अच्छा एजी-bindings प्राप्त करने की संभावना कम कर देता है । बहरहाल, इस विधि भी संभव पार से बाहर छंटाई कर सकते है भोली दाताओं से एक वांछित एजी के खिलाफ प्रतिक्रियाशील स्मृति बी कोशिकाओं, क्योंकि12व्यक्तियों के प्रतिरक्षा अतीत की । इसके अलावा, इस विधि आसानी से टीका लगाए या संक्रमित रोगियों या प्रतिरक्षित मानव जानवरों के लिए लागू है, के रूप में 9में वर्णित है, जहां vivo संबंध परिपक्वता में जिसके परिणामस्वरूप mAbs के संबंध में वृद्धि कर सकते है के बारे में 1 x 10-9 एम. विभिंन प्रक्रियाओं को भी इन विट्रो मेंmAbs के संबध में सुधार करने के लिए वर्णित किया गया है, विशेष रूप से कोशिकाओं में reproducing दैहिक hypermutation के माध्यम से एंटीबॉडी व्यक्त ( 13में समीक्षा की).

अंत में, हम अत्यधिक भेदभावपूर्ण mAbs उत्पादन के लिए एक बहुमुखी रणनीति का प्रस्ताव है कि स्थिति के विभिंन प्रकार में इस्तेमाल किया जा सकता है, एक भोले व्यक्ति से एक टीका दाता या एक स्व-प्रतिरक्षित रोग से पीड़ित मरीज को । पूरी तरह से मानव एक वांछित epitope के खिलाफ इस तरह से उत्पंन mAbs बुनियादी अनुसंधान और immunotherapy के लिए दोनों उपयोगी हो सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Cytometry सुविधा "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, नांत) का शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी सभी संयोजक प्रोटीन उत्पादन (P2R) और प्रभाव प्लेटफार्मों (INSERM १२३२, SFR Santé, Biogenouest, नांत) के कर्मचारियों को उनके तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद । हम पांडुलिपि पर रचनात्मक टिप्पणी के लिए Emmanuel Scotet और रिचर्ड Breathnach धंयवाद । यह काम आर्थिक रूप से इहु-Cesti परियोजना द्वारा समर्थित था «Investissements d'Avenir» फ्रांसीसी सरकारी कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित, फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR) द्वारा प्रबंधित (ANR-10-IBHU-005) । इहु-Cesti परियोजना भी नांत Métropole द्वारा समर्थित है और Région de la लॉयर भुगतान करता है । यह काम भविष्य के कार्यक्रम ANR-11-LABX-0016-01 के निवेश के जरिए राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी द्वारा समर्थित LabEX इगो कार्यक्रम के संदर्भ में महसूस किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		 Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक १३२ इम्यूनोलॉजी सेलुलर जीवविज्ञान मानव एंटीबॉडी बी सेल tetramer फ्लो cytometry एकल सेल प्रतिजन-विशिष्ट चुंबकीय संवर्धन

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट बी कोशिकाओं से रक्त में परिचालित में भेदभावपूर्ण मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devilder, M. C., Moyon, M.,… More

Devilder, M. C., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter