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Summary
希少な B 細胞人間の血液循環から始まって、興味の抗原のために特定の抗体の生産のための手法について述べる。これらの自然抗体の生成は効率的かつ迅速、得られた抗体関連性の高い抗原の間で区別することができます。
Abstract
モノクローナル抗体 (Mab) は、両方の基礎研究および生体医に役立つ強力なツールです。抗体は (例えば、正常な蛋白質およびその変異バージョン) の関連性の高い構造を区別する必要がある場合、高い特異性が必要不可欠です。このような差別の Mab を生成する現在の方法には高価な時間のかかる複数の Ab-産生 B 細胞のスクリーニングが含まれます。提案する迅速かつコスト効果の高い方法の識別、生成のため B リンパ球を循環血液から始まって完全ひと抗体.この戦略の独創性は、容易に利用可能な末梢血単核細胞 (PBMC) を使用して、他のすべてのセルのカウンターの選択を組み合わせる特異抗原結合 B セルの選択によるものです。単一のセルを逆転写ポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) 技術を使用して人間で表されるその後に対応する mAb のコーディング (相補的デオキシリボ核酸) cDNA シーケンスを取得特定の B 細胞が分離されたら、セルです。わずか 1 ヶ月で、内自然 B 細胞レパートリーによって検出されたあらゆる目的の抗原に対して指示される高い識別人間 Mab のミリグラムを生成することが可能です。
Introduction
ここで説明する方法は、目的の抗原 (Ag) に対するモノクローナル抗体 (Mab) を完全に人間の迅速かつ汎用性の高い生産を可能します。Mab は、多くの基礎研究アプリケーションin vitroとin vivoで不可欠なツール: たとえばフローサイトメトリー、組織学、西部のしみを付けおよびブロックの実験の流れ。さらに、自己免疫疾患、がん、治療し、移植拒絶反応1を制御する Mab をより多くに医学で使用されています。たとえば、反 ctla の条項 4、抗 PD 1 (またはアンチ PD L1) Mab は最近がん治療2免疫チェックポイント阻害剤として使用されました。
免疫グロブリン (Ig) で作り出された最初のモノクローナル抗体-免疫マウスまたはラットの脾臓細胞から得られたハイブリドーマを分泌します。ただし、マウスまたはラット モノクローナル抗体と強い免疫反応は、その急速なクリアランスと過敏反応3のありそうな誘導のための人間の彼らの治療上の使用を妨げます。この問題に取り組むため、Mab の動物性タンパク質シーケンス部分的に取って代わられましたいわゆるキメラ マウス ヒトやヒト化抗体を生成する人間の物。ただし、この戦略は部分的にしかコストと生産時間規模の両方を大幅に増加させながら、免疫原性を減少します。よい解決策はヒト B 細胞から直接人間の抗体を生成する、このためのいくつかの戦略があります。それらの 1 つは、ファージや酵母のディスプレイの使用です。これは含まランダム人間 Ig 重のコンビナトリアル ライブラリから可変領域を表示し、光チェイン ファージや酵母と興味の特定の抗原を用いた選択のステップを実施します。この方法の主な欠点は、重く、軽鎖がランダムに関連付けられ、生成された抗体の多様性の非常に大きな増加につながることです。抗体は特定 Ag に対する自然免疫応答から生じるだろっているものに対応しています。また、人間のタンパク質の折りたたみおよびポスト翻訳の修正、複製は、体系的に原核生物や酵母。2 番目の人間 mAb 生産方法は、エプスタイン ‐ バーウイルス感染や抗アポトーシス因子 BCL 6 および BCL-XL4発現によって自然の人間の B 細胞の不死化です。ただし、このメソッドは、メモリー B 細胞にのみ適用され、多数 mAb 生産不死化 B 細胞が目的の抗原特異性と (もしあれば) いくつかの mAb のクローンを識別するためにスクリーニングを必要とする、効率的ではありません。メソッドはこのように高価な時間のかかるです。
新しいプロトコルは、隔離された単一 B 細胞5から人間の抗体の生産の最近記載されています。最適化された単一セル逆転写-ポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) の増幅の両方、重と光-鎖のセグメントを単一の並べ替えられた B 細胞からのエンコードを依存しています。真核生物発現系、完全に人間の mAb の再構築をできるように、クローニングと発現のこれらのセグメントのこの続きますです。このプロトコルは、ワクチン接種ドナーからの B 細胞から正常に使用されています。セルを目的の Ag に対して指示される B 細胞の高い周波数を取得し、6をスクリーニングするために必要な時間を制限するワクチン接種後数週間収穫されました。他の完全ひと抗体は、HIV+ (ひと免疫不全ウイルス) 感染患者7と黒色腫患者8から生産されています。これらの進歩にもかかわらずプロシージャがないまだ利用可能メモリ表現型や頻度の独立した Ag 固有の B 細胞の分離ができます。
手順ここで効率的な前のヴィヴォ完全ひと抗原特異的モノクローナル抗体低上映時間と高収率で生産が続く、BCR 特異性に基づいて人間の循環 B 細胞の分離につながる。メソッドは、メモリー B 細胞や抗体産生 B 細胞免疫反応を誘導する制限されていないが、人間ナイーブ B 細胞レパートリーにも適用することができます。Ag 特定 B 細胞は非常に低い周波数で存在からでも動作する、効率の良い指標です。法の原理は次のように: 末梢血単核細胞 (PBMC) は興味の抗原を提示 2 テトラマーと汚れる、それぞれ異なる蛍光色素 (例えば、フィコエ リスリン (PE)、アロフィコシアニン (APC))、というラベルの付いた密接に関連抗原提示第 3 四量体共役 3 蛍光色素 (例えば、ブリリアント バイオレット 421 (BV421))。抗原結合セルの豊かにする細胞は、抗 PE をコートしたビーズと孵化させると反 APC Abs、細胞分離カラムでソートします。PE+ APC+細胞画分が選択されます種類 PBMC 細胞 B 細胞の同定を許可するために特定の抗体の様々 なステンド グラスと受ける流れ cytometry 細胞選別します。PE+と APC+、鮮やかなバイオレット-、しかしである B 細胞は分離されています。この手順は、カウンター B 細胞ではないまたは tetramerized の抗原にはバインドしませんが、PE/APC (PE+ APC-または PE- APC+これらの細胞になる) または使用されるテトラマー (これらの非抗原部分にバインドを行うセルを選択しますセルになります BV421+)。B 細胞の高い関心のエピトープに固有ではないがこのステップでも反選択されます (これらの細胞に BV421 なるも+)。したがって、このメソッドは、表現する B 細胞受容体 (BCRs) 2 つの非常に密接に関連抗原の間で区別することができる非常に特定の B 細胞を浄化できます。チューブに収集され、単一の特定の B 細胞と、Ig の PCR 増幅 Cdna (相補的デオキシリボ核酸) を複製し、分泌された IgG 抗体としてのひと細胞ラインで表現。
概念の証拠としてこの調査は記述するペプチドが提示主要な組織適合性の複雑なクラスによって認識される人間の抗体の効率的な生成 (MHC-私) 分子とを区別することができますこのペプチドと同じで読み込まれる他のペプチドMHC-私の対立遺伝子。このメソッドは (i) に Ag 固有 Mab; の高収量回復を可能この Ag の複雑さのレベルは重要ですが、(ii) 構造的に 2 つを区別することができるモノクローナル抗体の生産は、Ags を閉じます。このアプローチは、プロトコルのままには、ワクチン接種や感染患者に拡張することができます、ヒト化ラット システム9にもすでに、正常に実装されています。したがって、本研究は基礎研究と免疫療法で使用することができます完全ひと抗体を生成する汎用性と効率的なアプローチについて説明します。
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Protocol
すべてのひと末梢血サンプルはローカル倫理委員会 (エタブリセモン Français デュを歌った、EFS、ナント、プロシージャ PLER NTS-2016-08) に基づき、インフォームド コンセント後匿名成人ドナーから得られました。
1. ひと末梢血単核細胞の分離
注: 開始材料合計ひと末梢血や樹形サンプルできます。サンプルは、8 h 以上べきではないと、抗凝固剤 (例えばヘパリン) を添加しました。
- 2 つの容積 (ひと末梢血) とは、血液や RPMI (ロズウェル パーク記念研究所) 中の 5 冊 (樹形サンプル) を希釈します。
- 慎重に層の密度勾配 50 mL の円錐管中の 15 mL に希釈した細胞懸濁液 35 mL。すべての希釈した血液を配布する必要に応じて、多くの管を行います。オフ ブレーキ付けスイング バケツの回転子に室温で 25 分 1,290 × g で遠心分離機します。
- 慎重に密度勾配媒体とプラズマ層の界面に単核細胞層を吸引し、細胞を新しい 50 mL の円錐管に転送します。
- RPMI 培地で管を埋める、混合し、室温で 10 分間 1,290 × g で遠心分離機します。上清を慎重に取り外します。
- RPMI 培地および血小板を削除に 10 分間、200 × g で遠心分離の 20 mL の細胞ペレットを再懸濁します。上清を慎重に取り外します。この手順をもう一度繰り返します。
- 10 %rpmi 培地で細胞ペレットを再懸濁します胎仔ウシ血清 (FBS)。
注: テトラマー ラベルに直接進むまたは 107セル/mL の濃度で一晩 4 ° C で細胞を保ちます。
2 Ag 特定の B 細胞の四量体関連磁気濃縮
- Ag テトラマーを準備するには、いずれかの PE を追加 APC ラベル プレミアム グレード ストレプトアビジンまたはビオチン標識抗原モノマーを 1:4 のモル比で BV421 標識ストレプトアビジンです。室温で 10 分ごと 1 つの因数を追加する 3 つの独立した部分にストレプトアビジン共役の適切な量を追加します。
- 15 mL の円錐管の細胞 (最大 3 × 108チューブあたり) を配布し、5 分 460 × g で遠心分離機します。
注: 次のプロトコルは、1 つの管です。 - 2% で 200 μ L の PBS (リン酸緩衝生理食塩水) で細胞ペレットを再懸濁します FBS。PE ・ APC ・各 10 μ G/ml の最終的な集中に BV421 共役テトラマーを追加します。よく混合し、室温で 30 分間インキュベートします。
- 0.5 %bsa (ウシ血清アルブミン) と EDTA (エチレンジアミン四酢酸) PBS を使用して冷たい細胞分離バッファー (SB) の準備 2 mM。
- 5 分 460 × g で遠心分離によって SB. ペレット セルの 10 mL を追加します。
- 500 μ L 抗 PE と 50 μ L マイクロ アンチ APC 磁気ビーズの冷たい SB. 追加 50 μ の細胞を再懸濁します。
- よく混合し、4 ° C で 20 分間インキュベート
- 2.5 の手順を 2 回繰り返します。
- 上清を慎重に排除 andresuspend 氷冷 SB で 2 x 108セル/ml の濃度で細胞ペレット。
- SB の 3 mL で磁石に配置されている大規模な磁気列を平衡します。
- 2.9 釣合い列の一番上から細胞懸濁液を転送し、完全に排水すること。重要なステップ: 列の凝集を避けるために、70 μ m のナイロン メッシュを細胞を通過します。
- 3 ml の氷冷 SB の細胞を含んでいたチューブを洗浄し、(場合にろ過、洗浄、70 μ m ナイロン メッシュ) 列に直接バッファーを転送します。
- バッファーが列に排水している完全に別の 3 mL の氷冷 sb を列に追加します。
- 別の 3 mL 洗浄手順 2.13.
- 15 mL コニカル収集管磁石と場所から列を削除します。
- 列の一番上に氷冷 SB の 5 mL を追加し、プランジャーを使用して、列からセルをすぐにフラッシュします。この手順をもう一度繰り返します。
- 遠心分離機の 460 x g で 5 分で集められたセル (濃縮関連テトラマー陽性細胞分画)、追加抗体の汚損に進みます。
注: プールすべてのチューブから必要に応じて細胞を収集しました。
3. Ag 固有ヒト B 細胞・細胞のソーティングの染色
- 抗 CD3 抗体のカクテルが細胞ペレットを再懸濁します (最終希釈: 1:20)、CD19 (1:20)、CD14 (1:50)、CD16 (1:50)、および 7AAD (1: 1000) 2 %100 μ L の PBS の最終巻で政府短期証券。4 ° C で 30 分間インキュベートします。
- 10 mL の PBS を加える細胞、460 x g で 5 分間遠心、上清を除去します。この手順をもう一度繰り返します。200 μ L の PBS、70 μ m ナイロン メッシュ フィルターで細胞ペレットを再懸濁します。
- 1,000 イベント/秒9を超えることがなく 100 μ m ノズルと 20 psi の圧力細胞ソーター cytometer の単一セルのレベルで特定の B 細胞を並べ替えるに進みます。
メモ: 使用されるゲートの戦略は、図 1.に示されてセルされた CD14 のゲート最初-CD16-7AAD-細胞単球、NK と死んだ細胞 (図 1には表示されていません) を除外します。その後、CD19+ B 細胞は PE と APC 関連 Ag テトラマーを二重染色細胞のゲート前に選択されました。非特異 B 細胞は (無関係な Ag テトラマーにより無染色) BV421 否定的な細胞のゲーティングによって除外されました。 - 8 ストリップ PCR チューブ 96 マイクロ チューブ用ラックの配置、以前に 10 μ L の 1 x PBS と RNAse 阻害剤の 10 単位記入に単一 B 細胞を収集します。-80 ° C で PCR チューブを直ちに凍結します。
注: cytometer 楽器選択ソート マスク、収量マスク: 0、純度マスク: 32、および位相マスク: 0。 必要な場合は 96 または 384 ウェル PCR プレートに調整されるこの単一セルの預金。単一 B 細胞は、できるだけ早く冷凍する必要があり、必要な場合は、数週間のためにおけます-80 ° c。
4. 単一細胞 RT-PCR
- 直接 PCR ストリップ乾燥お風呂で 5 分の 70 ° c で凍結試料を加熱することによって細胞を溶解させます。
- 1 mM dNTP、25 μ G/ml oligod(T) プライマー、5 μ M ランダム hexamers、RNAse 阻害剤 20 台、逆転写酵素の 400 台を含むマスター ミックス バッファー x 2 のチューブあたり 10 μ L の追加によって転写 (RT) を逆に進むし、氷にストリップを転送します。
注: 後細胞融解、RT する必要があります実行するすぐに RNA の劣化を避けるために。 - ランダム hexamers 交配、50 ° C で 1 時間インキュベートし、反応を停止する 3 分 95 ° C で培養が完了するを許可するように 5 分 25 ° C で孵化させなさい。
- 各変数重 (vH) とカッパ (vLκ) またはラムダ軽鎖 (vLλ) のエンコーディングの領域のネストされた PCR の拡大の 2 つのラウンドに進みます。
注: また、RT サンプル-20 ° C で凍ってでき 1 週間続けた。- PCR の最初のラウンドの 1.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs、DNA ポリメラーゼの 2.5 単位、200 を含む 40 μ L の最終巻の cDNA の 3 μ L を追加外側のプライマー (プライマー シーケンスの材料の表と図 2を参照) の nM。
注: 外側プライマー ミックスの組成物。重鎖増幅用: 4 転送プライマー (5' LVH ミックス) と 2 逆プライマー (3' CµCγ ミックス)。3 光カッパ鎖増幅用プライマーに転送 (5' LV | ミックス) と 1 逆プライマー (3' Cκ543 566)。光ラムダ チェーン増幅用プライマー (5' LVl ミックス) 前進の 7 と 1 逆プライマー (3' Cl)。
注: プライマーは、すべての重鎖および軽鎖遺伝子5の増幅の分げつらによって設計されていた。 - 次のサイクリング条件を適用: 94 ° C、4 分 30 の 40 のサイクルが続く 94 ° c、30 秒 58 ° C、VH と VLκ (VLλ の 60 ° C)、および 55 で s 最終伸長の 72 ° c s ステップ 7 分の 72 ° c。
- 2 番目のラウンドの PCR のため 40 の最終巻の最初の増幅産物の 3 μ L を使用して含む 1.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs、DNA ポリメラーゼの 2.5 単位、200 μ L 式にクローニングに制限酵素サイトを含む内部のプライマーの nMベクトル (プライマー シーケンスの材料の表と図 2を参照)。
注: 内部プライマー ミックスの組成物。重鎖増幅用: 9 転送プライマー (5' AgeIVH ミックス) と 3 逆プライマー (3' SalIJH ミックス)。9 光カッパ鎖増幅用プライマーに転送 (5' AgeIV | ミックス) と 3 逆プライマー (3' BsiWIJκ ミックス)。光ラムダ チェーン増幅 6 転送プライマー (5' AgeIVl ミックス) と 1 逆プライマー (3' XhoICl)。
注: プライマーは分げつら、重鎖および軽鎖遺伝子5のすべての増幅によって設計されていた。 - 次のサイクリング条件を適用: 94 ° C、4 分 30 の 40 のサイクルが続く 94 ° c、30 秒 58 ° C、VH と LCκ (LCλ の 60 ° C)、および 45 秒最終伸長 72 ° c s ステップ 7 分の 72 ° c。
- PCR の最初のラウンドの 1.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs、DNA ポリメラーゼの 2.5 単位、200 を含む 40 μ L の最終巻の cDNA の 3 μ L を追加外側のプライマー (プライマー シーケンスの材料の表と図 2を参照) の nM。
- VH、vLκ および vLλ (変数の重鎖エンコード セグメントの 500 bp 製品) と可変軽鎖セグメントのエンコードの 350 bp 製品 1.5% の agarose のゲルの PCR の製品の 5 μ L 移行によって肯定的な井戸を識別します。
- PCR の製品の浄化のために設計された限外ろ過膜を使用して肯定的な井戸から残り残りの 35 μ L の PCR の製品を浄化します。
- H2o. の 60 μ L の PCR の製品を溶出します。
5. 発現クローニング
-
挿入を準備します。
注意: ダイジェスト 60 μ L 各精製 PCR の製品の適切な制限酵素バッファーを含んでいる 100 μ L の最終巻。- VH PCR の製品、上井の 50 台、50 台・ サリを追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート
- VLλ PCR の製品、上井の 50 台、XhoI、50 台を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート
- VLκ PCR の製品、上井の 50 単位を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート96 PCR 膜を用いたダイジェストを浄化、BsiWI、50 単位を追加して BsiWI 制限酵素バッファーの 100 μ L の最終巻で 60 μ L の溶出液 60 μ L H2O をダイジェストで溶出、55 ° C で 1 時間インキュベート
- 15 分で 80 ° C に加熱することにより酵素を不活性化します。
-
ベクトルを表現する準備
注: vH PCR の製品が一定の重鎖特異的な IgG1 の Cγ1 を含む発現ベクター (HCγ1) に複製されます。vLκ PCR の製品は、Cκ 定数の軽鎖を含む発現ベクター (LCκ) に複製されます。vLλ PCR の製品は、Cλ 定数の軽鎖を含む発現ベクター (LCλ) に複製されます。- 次の消化力に従います。
- 式のミックス 1 μ g 上井 10 台、制限バッファー、製造元の推奨の 20 μ L の総ボリュームで SalI エンドヌクレアーゼの 10 台の HCγ1 をベクターし、37 ° C で 1 時間インキュベート
- 上井制限酵素バッファー制限の 20 μ L の総ボリュームの 10 単位を発現ベクター LCκ のミックス 1 μ g は、メーカーの推奨し、37 ° C で 1 時間インキュベートBsiWI 制限の酵素、10 単位を追加し、55 ° C で 1 時間インキュベート
- 上井 10 台、バッファー制限の 20 μ L の総ボリュームの XhoI エンドヌクレアーゼの 10 台と発現ベクター LCλ のミックス 1 μ g は、製造元の推奨し、37 ° C で 1 時間インキュベート
- 制限酵素を不活化する 10 分の 65 ° C でそれぞれ消化の混合物を加熱します。
- 2 μ L で消化液の PCR の製品の 5 μ L の結紮を実行 (100 ng) の 1 ユニット T4 DNA リガーゼの 4 ° C で一晩培養による DNA リガーゼ バッファー x 1 の 20 μ L の容量に対応する線形表現のベクトル
注: また、結紮実行は 4 ° C で 3 h
- 次の消化力に従います。
-
クローン作成
- 自家製 electrocompetent TOP10エシェリヒア属大腸菌(セクション 1.8.4-1.8.8 分子生物学の現在のプロトコル) の 45 μ L に 20 μ L 結紮混合物の Electroporate 1 μ L。すぐに 2 X YT 媒体を 500 μ l 添加し、YT アンピシリン プレート × 2 に変換拡散細菌で 37 ° C で 30 分間湯せんで孵化させなさい。37 ° C で一晩インキュベートします。
- 変換ごとに 8 つのコロニー PCR による画面します。
- 氷の上次のように反応のプレミックスを設定: 45 μ L の PCR のバッファー、MgCl2 (25 mM) の 12 μ L、(それぞれのストック含む 10 の mM) からの dNTPs の 4 μ L、前方プライマー (在庫 10 μ M) ベクトル シーケンス (プライマー Ab vec 感覚) に交配させることの 10 μ L x 5、と逆プライマー (在庫 10 μ M) 一定の重いまたは軽い鎖領域をターゲットの 10 μ L (プライマー シーケンスの材料表を参照してください)。200 μ L H2o. の最終的なボリュームを構成します。4 μ L の DNA ポリメラーゼの酵素 (5 U/μ L) を追加します。
- 氷の上の 8 ストリップ PCR チューブごと反応プレミックスの 25 μ L を配布します。
- 生殖不能のつまようじを使用して、個々 のコロニーをピックアップします。レプリケート プレートを構成し、PCR の反作用の管にそれをつける 2 x TY アンピシリン プレート上につまようじを連勝します。
- 次のサイクリング条件スクリーニング PCR を行う: 94 ° C 10 分の 30 の 25 サイクル順 94 ° c、30 秒 55 ° c、s と 50 s 72 ° C で
- 1.5% の agarose のゲルの PCR の製品の 5 μ L 移行によって肯定的な細菌を識別します。
注: 陽性コロニー PCR の製品の約 850 を与える重鎖ベクトルと 600 bp 軽鎖ベクトル bp。
- LB 培地 2 mL にレプリケートのプレートから 4 つの肯定的なコロニーを接種して 200 rpm で振とうしながら 37 ° C で一晩インキュベートします。
- 製造元によって示されるプラスミド精製キットを使用して液体の文化からプラスミドを抽出します。
- サンガーによる可変ドメインの正しい挿入を確認 Ab vec 感覚プライマーとプラスミドのシーケンスします。
注: (エンコード HC および対応する LC) 正しい挿入プラスミドは cotransfected 293A 分泌細胞にします。小さなスケール生産モノクローナル抗体の特異性は ELISA によって試金します。その後、該当する場合、大規模な生産が実行されます。
6. モノクローナル抗体の生産
-
特異性をチェックするための小規模な生産
- 200 μ L のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% における細胞のトランスフェクション、種 15,000 人間の萌芽期の腎臓 293A 前日 (HEK 293A) 短期国債/ウェルの 96 ウェル プレートで。37 ° C で CO2インキュベーター (5% CO2) で一晩インキュベートします。
- 293A 10% を含む DMEM 培地で細胞を cotransfect FBS トランスフェクション試薬として線形ポリエチレンイミン誘導体を使用しています。
メモ: は、トリプリケートで遺伝子導入を行います。次のプロトコルは、底が平らな 96 ウェル プレートのウェル 1 個です。- 150 mM の NaCl を 10 μ l 添加に 0.5 μ L の DNA トランスフェクション試薬を希釈します。0.125 μ g の vH と vL 表現するベクトルの 0.125 μ g を 150 mM の NaCl の 10 μ L に希釈します。渦各希釈 10 s。
- 10 μ L に 10 μ L の DNA の解決の DNA トランスフェクション試薬の希釈を追加します。渦 15 s と室温で 15 分間インキュベートします。293A 細胞 drop-wise 20 μ L ミックスを追加し、ミックス プレートを軽く旋回します。
- 無血清培地で 5 日間および培養細胞をトランスフェクション後中 16 h を交換してください。
注: は、血清 Igs 産生される抗体の汚染を避けるために、無血清培地を使用します。 - 5 分 460 × g で遠心分離によって細胞および残骸を排除します。
- マルチ チャンネル ピペットで吸引により培養上清を収穫し、V 底 96年ウェル プレートに転送。
- 一晩で再構成しなさい ELISA/コーティングのウェルあたり 100 μ L 4 ° C コート関連する Ag は、96 ウェル ELISA プレートで 2 μ G/ml の最終的な集中で 1 x をバッファーします。9の例を参照してください。
- 37 ° C で 2 時間 10% FBS DMEM 培地でブロック井戸
- 6.1.5 のステップから transfected 293A 細胞の培養上清の 50 μ L を追加し、室温 2 時間インキュベート
- 1 μ G/ml で西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 酵素抗ひと IgG Ab 共役の 100 μ L を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。50 μ L の発色基質 (TMB) を追加し、20 分間インキュベートします。
- 450 の光学密度を読む nm の分光光度計です。
注: 特定の抗体 ELISA の試金によって明らかにさらに大規模で生産することができます、精製タンパク質で人間の igg 抗体の親和性を示す列。
-
大規模な生産および特定の抗体の浄化
- 25 mL の 10% を DMEM を含む 175 cm2フラスコに細胞のトランスフェクション、シード 6 x 106ひと胎児腎臓 293A 前日 (HEK 293A) FBS。37 ° C で CO2インキュベーター (5% CO2) で一晩インキュベートします。
注: セル 70% 合流トランスフェクションするときをする必要があります。 - 293A 10% を含む DMEM 培地で細胞を cotransfect FBS トランスフェクション試薬として線形ポリエチレンイミン誘導体を使用しています。
- 150 mM の NaCl の 450 μ L に 50 μ L の DNA トランスフェクション試薬を希釈します。10 μ g の vH と vL 表現するベクトルの 10 μ g を 150 mM の NaCl の 500 μ L に希釈します。渦 10 s 各希釈。
- DNA 溶液を希釈した DNA トランスフェクション試薬を追加します。渦 15 s と室温で 15 分間インキュベートします。Drop-wise 細胞に 1 mL ミックスを加え、フラスコを軽く旋回で混ぜます。
- 無血清培地で 5 日間および培養細胞をトランスフェクション後中 16 h を交換してください。
- 25 mL ピペットで吸引によって収穫中。
- 5 分 460 × g で遠心分離によって細胞および残骸を排除します。
- 4 ° C でのタンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムに蛋白質 A をコーティングした 1 mL カラムを使用して抗体を浄化します。
- タンパク質に 20 mM リン酸バッファー (pH 7) セファローズ列を平衡します。
- 6.2.5 1.22 μ m フィルター 0.45 μ m のフィルターを使用してから細胞培養液をフィルター処理します。
- 列にフィルターが適用された媒体を読み込みます。
- 20 mM リン酸緩衝液 (7) で洗うし、0.1 M クエン酸バッファー (pH 3.5) を溶出します。
- 280 の光学密度を読む nm 吸光度とすぐに中和 1 M トリス緩衝液 (9) 分数のタンパク質を含みます。
- 3.5 K の分子量 PBS バッファー (pH 7.4) に対するカットオフのカセットの 4 ° C で一晩浄化された Ab を dialyze します。
- 製造元によって示されるとして、サイズ排除クロマトグラフィーによる 0.2 μ m のろ過とコントロールの純度によって殺菌しなさい。
- 25 mL の 10% を DMEM を含む 175 cm2フラスコに細胞のトランスフェクション、シード 6 x 106ひと胎児腎臓 293A 前日 (HEK 293A) FBS。37 ° C で CO2インキュベーター (5% CO2) で一晩インキュベートします。
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Representative Results
このプロジェクトでは、ペプチド Pp65495を認識する人間の Mab の世代に健康なドナーから PBMC から始まって主要な組織適合性の複雑なクラスによって (Pp65、ヒトサイトメガロから) 提示私 (MHC-私) 分子 HLA A * 0201 (HLA-A2)。これらの Mab を区別このコンプレックスと同じ MHC に読み込まれる他のペプチドを表す複合体-私の分子。
PBMC は、HLA A2 Pp65 PE、HLA-A2/Pp65-APC、HLA A2/MelA2 BV421 テトラマー上記プロトコルで説明したようと染色.PE と APC テトラマー陽性細胞の免疫細胞濃縮後、溶出細胞は追加モノクローナル抗体で染色しました。流れ cytometry セルソーターの磁気濃縮細胞が実行可能な CD14 のゲート最初-CD16-CD3-CD19+シングレット (B 細胞)。BCRs HLA-A2/Pp65 と他を区別することができるを発現する B 細胞を隔離するゲート戦略関連 HLA-A2 ・ ペプチド複合体を図 1に示します。ゲーティング HLA-A2/Pp65 PE+と HLA-A2/Pp65 APC+ PE+または APC+単独で染色した螢光色素の特定の B 細胞を除外するのには、二重陽性後興味の B セルの選択を行った。最後に、非常に特定の B 細胞は HLA A2/MelA2 BV421 否定的な細胞のゲーティングによって識別されました。これにより、BCRs ペプチドと HLA A2 依存的 HLA-A2/Pp65 をバインドできないこれらの B 細胞と β 2 ミクログロブリン、ビオチン、HLA-A2、または差別しないそれらに対して指示されるそれらの間差別を発現する B 細胞の同定MHC バインディングの溝にペプチド。すべてのこれらの後者のセル BV421 陽性細胞になります。先ほどさらに Ag の他の種類の文書化と、この除外戦略は Ag9の B 細胞の識別能力の増加によるより重要です。
単一の特定の B 細胞がソートされた後は、RT-PCR により増幅した Cdna が重いと光 Ig チェーンのエンコーディングします。重いと光の鎖セグメントのコーディングのペアは、単一 B 細胞テスト (表 1) の約 50% で得られました。シーケンスは、式に複製された可変ベクトル一定のドメインの対応するシーケンスが含む (重い定数 1 と光定数 κ または λ)。人間の萌芽期の腎臓の細胞 (HEK、293A 細胞) は、重鎖および軽鎖のベクトル cotransfected でした。IgG1 アイソタイプの分泌された抗体は、トランスフェクション (完全ひと抗体生産のグローバル戦略の図 3参照) 後 5 日 293A 細胞の培養上清から収穫されました。これは正常に重いと光の鎖セグメント (表 1) をコーディングのペアを降伏 3 の単一の B リンパ球細胞から始まって 1 つの HLA-A2/Pp65 特定の抗体を生産しました。ELISA の試金が明らかになった、この mAb は両方 MHC とペプチドに依存 (図 4 a)、HLA-A2/Pp65 錯体にそのバインドと mAb の数ミリグラムが (例えば、親和性の分析、分析を進めるため容易に作り出されました。機能試金)。その結合親和性、表面プラズモン共鳴 (SPR) によって決定された約 7 × 10-6 M (図 4 b)。
したがって、この記事は i) 関連する Ag 特定の B 細胞の検出を可能にする敏感かつ効率的なメソッドの組み合わせを表す、さらに健常者の血と高い識別人間 Mab の二世代で非常に低い周波数で現在とき。
図 1: 人間の PBMC から HLA-A2/Pp65 特定の B 細胞の検出。
3 × 10 の8 PBMC HLA A2 Pp65 PE、HLA-A2/Pp65-APC、HLA A2/MelA2 BV421 テトラマーと染色.PE と APC テトラマー陽性細胞の免疫細胞濃縮後、溶出細胞は追加モノクローナル抗体で染色しました。流れの cytometry セルソーターのセルは実行可能な一重項 CD14 の最初ゲートが-CD16、CD19 の-のリンパ球の (表示されていません)+CD3-細胞。その後、B 細胞の HLA A2 Pp65 PE と HLA A2 Pp65 APC テトラマーで染色されたゲート。HLA A2/メラ BV421 テトラマーはペプチドと MHC 依存的 HLA-A2/Pp65 を認識していない B 細胞を除外する使用されました。
図 2: 増幅と Ig 遺伝子のクローニングのための戦略。光と重い遺伝子 Ig チェーンは、入れ子になった RT-PCR により増幅しました。リーダー地域および逆プライマー適切な重い、軽いカッパまたは光ラムダ チェーンの定数領域の特定を交配させること前方のプライマーの組み合わせで最初の Pcr を行った。制限のサイトを含むプライマー第 2 Pcr を行った、前方および逆プライマー V セグメントの先頭のと J セグメントの終わりのためにそれぞれ固有。PCR の製品は制限の酵素と消化と適切な一定のドメインを含む発現ベクターにクローンとして作られたシーケンスに配置されました。CMV: サイトメガロ ウイルス プロモーター。アンピシリンの AmpR: 抵抗性遺伝子。
図 3: 組換えヒト抗体の再構築の全体的な戦略。
四量体ベースの並べ替え方法では、興味の B 細胞の検出をことができます。非常に特定の B 細胞は単一セルの並べ替え.光と重い Ig チェーン エンコード セグメントは、RT-PCR を使用して増幅されました。変数の領域のシーケンスは、一定の光と重い領域をエンコードする遺伝子セグメントでフレームに別の真核生物発現ベクターにクローンしました。対応する完全ひと抗体は、一過性トランスフェクション HEK 293A 細胞によって表現され、培養上清より精製しました。この図は、Ouisseらから変更されました。(2017)9。
図 4: HLA-A2/Pp65 ひと末梢血 B 細胞を循環から生成に対する代表的な高い弁別 mAb の性格描写。
A) elisa 法による特異性モノクローナル抗体 HLA-A2/Pp65 に対して PC1.02 のテストします。プレートは関連する (HLA-A2/Pp65) または HLA A2 制限ペプチドを含む無関係な HLA A2 複合体でコーティングした: メラ、NS3 (c 型肝炎ウイルス-1)、および GagP17 (HIV-1) で 2 μ g/mL、PC1.02 が追加されたモノクローナル抗体、抗ひと IgG HRP Ab が検出のために使用されました。光学密度 (OD) を読んだ時 450 nm。B) PC1.02 表面プラズモン共鳴 (SPR) の CM5 チップ バインド mAb 流れる濃度 HLA-A2/Pp65 錯体を用いたモノクローナル抗体の親和性決定。この図は、Ouisseらから変更されました。(2017)9。
| PBMC の数 | PE + APC + 濃縮後細胞数 | 除外 (BV421 +) セルの数 | 並べ替えられた単一セルの数 | 分析された井戸数 | HC と LC の井戸の数 (% 回復) を関連付けられています。 | Mab 生産数 | 特定の抗体の数 | |
| HLA-A2/Pp65 モノクローナル抗体 (PC1.02) | 3 × 10 の8 | 818 | 117 | 161 | 7 | 3 (43%) | 3 | 1 |
表 1: HLA-A2/Pp65 特定の B 細胞の解析。
不明確な B 細胞、Ig 遺伝子増幅と mAb 生産分離 HLA-A2/Pp65 特定 B 細胞からの利回りの除外戦略の効果は、評価測定でした。
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Discussion
提案プロトコルは血で循環 Ag 特定の B 細胞から直接人間の抗体の生成のための強力な方法です。それは 3 つの重要な側面を組み合わせた: (i)、四量体関連磁気濃縮、まれな Ag-結合 B 細胞の前のヴィヴォ分離ができるの使用(cytometry 流れによって、BCR に関する必要な Ag; を発現する B 細胞のみを分離する 3 つの異なる蛍光色素で標識 3 つの Ag テトラマー (2 つの関連するものと無関係なものを 1 つ) を使用して ii) のゲートの戦略(iii) RT-PCR 単一セルのレベルで人間の細胞の Cdna の発現によって対応する組み換え mAb Cdna の再建。
以前の研究は、1 つまたは 2 つの蛍光関連抗原を使用して分離された B セル6,7,8から Mab の並べ替えおよびそれ以降の生産の前に人間の B 細胞をラベルする.関節リウマチ患者の 1 つの分析と自己免疫マウス モデルで 1 つは、自己反応性 B 細胞の特徴し、その周波数10,11を決定する無関係な蛍光抗原を関連付けられています。私たちが知っている限りでは、2 つの蛍光関連抗原テトラマーの組み合わせを使用し、1 つの無関係な抗原の四量体が完全ひと抗体の生産のため、使用前に特定の B 細胞の濃縮のため以前記載されていません。この最適化手法により、一ヶ月ほどで取得する完全に人間差別 Mab とナイーブ B 細胞レパートリーの中から始まる場合でも正常に実行できます。したがって、それはバクテリオファージの表示、ヒト B 細胞の不死化の主要な欠点のどれもまたは他前述の mAb の分子生物学的再建術。
このセルソーター戦略 Ag 固有人間 Mab の高収量の回復で起因します。単一の隔離された B セルの重鎖および軽鎖セグメントのペアは約 50% の成功率で増幅されます。軽鎖セグメントがほとんど常に増幅され、しかし、これは重鎖セグメントの場合ではないです。RT-PCR の効率は、次の点を尊重するのに大きく依存: 私) 並べ替えられた単一 B 細胞を限り早く冷凍する必要がありますii) RNase 阻害剤と B 細胞を取り出し、冷凍庫と RT の反作用を進水間の時間を最小限に抑えることの 30 単位を追加します。iii) 融解氷; すべてプライマーiv) 決して凍結/融解プライマー 3 倍以上。v) ストッキング最長 1 年のためのプライマー。
必要な特異性に対応する組換え抗体の生産効率に関する pMHC 特定の抗体のためのケースの約 30-40% です。特定クローンのモノクローナル抗体、ペプチドとはかなり厳しい、MHC 分子を認識する、我々 は以前より従来の抗原に対して指示される特定の Mab の回復の全体的な収率が 100% を優れているに、Β-ガラクトシダーゼの抗原9。それは無関係な四量体の適切な Ag の選択は生産モノクローナル抗体の特異性を上げることは重要ことを強調する必要があります。
本稿で説明した抗 HLA-A2/Pp65 モノクローナル抗体 (PC1.02) の親和性は比較的低い、約 7 × 10-6 M、TCR のアフィニティに類似。B 細胞の分離は素朴なドナーから行われたように、この結果は予想されました。ほとんどの四量体+ B 細胞は IgM+IgG-、良い Ag バインダーの取得の確率を減らす.それにもかかわらず、このメソッドすることも可能な並べ替え交差反応性メモリ B から素朴なドナーから必要な Ag に対する細胞免疫学的過去個人12のため。また、このメソッドは、ワクチン接種や感染の患者または免疫ヒト動物に簡単に適用できる9の説明に従って体内親和性成熟が約 1 × 10-9結果モノクローナル抗体の親和性を増やすことができます m. 様々 な手順は、モノクローナル抗体の in vitro、特にを通じて再現体性 hypermutation (文献13) 抗体を発現する細胞での親和性を改善するためにも記載されています。
結論としては、素朴なワクチン接種ドナーまたは自己免疫疾患に苦しむ患者個々 の状況の様々 なタイプで使用できる高い弁別 Mab 生産のため汎用性の高い戦略を提案する.目的エピトープに対してこの方法で生成された完全ひと抗体は、免疫療法の基礎研究とも役に立つ可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
専門的な技術支援ありがとうフローサイトメトリー施設"CytoCell"(SFR 健康、Biogenouest、ナント)。彼らのテクニカル サポートもすべてのスタッフが組換えタンパク質の生産 (P2R) とプラットフォームの影響 (INSERM 1232、SFR 健康、Biogenouest、ナント) にありがちましょう。原稿の建設的なコメント、エマニュエル Scotet とリチャード ・ ブレスナックに感謝します。この仕事財政的に、IHU セスタス プロジェクトで、フランス国立研究機関 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) を管理する «Investissements d'Avenir» フランス政府プログラムによって資金を供給によって支えられました。IHU セスタス プロジェクトはナントとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地方でもサポートされます。この作品は、将来プログラム ANR-11-LABX-0016-01 の投資を通して国立研究機関によってサポートされて LabEX 囲碁プログラムのコンテキストで実現しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll - lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
References
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免疫学、問題 132、免疫学、細胞生物学、人間の抗体、B 細胞、四量体、フローサイトメトリー、単一のセル、抗原特異的、磁気濃縮Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France
