Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Summary

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Abstract

Anticorpos monoclonais (mAbs) são poderosas ferramentas úteis para ambas as pesquisas fundamentais e em biomedicina. Sua alta especificidade é indispensável quando o anticorpo precisa distinguir entre estruturas altamente relacionadas (por exemplo, uma proteína normal e uma versão mutante respectivas). A maneira atual de gerar tais discriminatórios mAbs envolve extensa seleção de várias células B produtoras de Ab, que é caro e demorado. Propomos aqui um método rápido e econômico para a geração de discriminativa, mAbs plenamente humano a partir de sangue humano circulam os linfócitos B. A originalidade desta estratégia é devido a seleção de células de ligação B antígeno específico combinado com a Counter-seleção de todas as outras células, usando prontamente disponível periférico sangue mononucleares células (PBMC). Uma vez que células B específicas são isoladas, sequências de cDNA (complementar ácido desoxirribonucleico) que codifica para o mAb correspondente são obtidas usando a tecnologia de célula única reverso transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) e posteriormente expressos em humanos células. Dentro de menos de 1 mês, é possível produzir miligramas de mAbs humana altamente discriminativa, dirigido contra praticamente qualquer antígeno desejado naturalmente detectado pelo repertório de células B.

Introduction

O método descrito aqui permite a produção rápida e versátil de totalmente humanas-anticorpos monoclonais (mAbs) contra um antígeno desejado (Ag). Celia é ferramentas essenciais em muitas aplicações de investigação fundamental em vitro e em vivo: fluxo cytometry, histologia, mancha ocidental, bloqueio e experimentos, por exemplo. Além disso, mAbs estão sendo usados cada vez mais na medicina para tratar doenças auto-imunes, câncer e controle de rejeição de transplante¹. Por exemplo, mAbs anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) foram recentemente usados como inibidores de ponto de verificação imune em tratamentos de câncer².

Os primeiros mAbs foram produzidos por imunoglobulinas (Ig)-secretoras de hibridomas obtidos a partir das células no baço de ratos imunizados ou ratos. No entanto, a forte resposta imune contra murino ou rato mAbs dificulta seu uso terapêutico em humanos, devido a sua rápida liberação e a provável indução de reações de hipersensibilidade³. Para resolver este problema, sequências de proteína animal de mAbs foram parcialmente substituídas por dos humanos para gerar anticorpos chamados de rato-humano ou humanizados quiméricoes. No entanto, esta estratégia apenas parcialmente diminui imunogenicidade, aumentando substancialmente tanto o custo e o tempo-escala de produção. Uma solução melhor é gerar mAbs humano diretamente de células humanas de B e várias estratégias para isso estão disponíveis. Um deles é o uso do fago ou fermento de exibição. Isto envolve exibindo domínios variáveis de uma biblioteca combinatorial de Ig humana aleatória pesado e luz encadeia no fago ou leveduras e realização de uma etapa de seleção usando o antígeno específico de interesse. Uma grande desvantagem dessa estratégia é que correntes pesadas e claras são aleatoriamente associadas, levando a um aumento muito grande na diversidade de anticorpos gerados. Anticorpos obtidos são improváveis corresponder a aqueles que surgem de uma resposta imune natural contra um particular Ag. Além disso, dobradura de proteína humana e modificações borne-translational não são sistematicamente reproduzidas em procariontes ou mesmo em leveduras. Um segundo método de produção humana mAb é o immortalization de células B humanas naturais, pela infecção do vírus Epstein - Barr ou expressão dos fatores anti apoptótica BCL-6 e BCL-XL⁴. No entanto, este método é aplicável apenas às células de memória B e ineficiente, que exige triagem de numerosos mAb imortalizado B células que produzem a identificar os clones mAb poucos (se houver) com a especificidade antigênica desejada. O método é, portanto, caro e demorado.

Recentemente foi descrito um novo protocolo para produção de mAbs humano isolado único B células⁵. Baseia-se em um otimizado monocelulares reverter transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) para amplificação de ambos os pesados e luz-cadeia codificação segmentos a partir de uma única célula B classificada. Isto é seguido pela clonagem e expressão desses segmentos em um sistema de expressão eucarióticos, permitindo assim a reconstrução de um mAb plenamente humano. Este protocolo tem sido usado com sucesso a partir de células B de doadores vacinados. As células foram colhidas várias semanas após a vacinação para obter frequências mais altas de células B dirigidas contra o Ag desejado e, portanto, limitar o tempo necessário para a seleção de⁶. Também foram produzidos outros mAbs plenamente humanos de infectados pelo HIV⁺ (vírus de imunodeficiência humana) pacientes⁷ e melanoma pacientes⁸. Apesar destes avanços, ainda não há nenhum procedimento disponível que permite o isolamento de células B Ag específico independentes de seu fenótipo de memória ou frequência.

O procedimento descrito aqui leva a isolamento eficiente ex vivo de células humanas de B circulantes, com base na sua especificidade BCR, seguida pela produção de plenamente humano mAbs antígeno-específicas em alto rendimento e com um tempo de rastreio de baixo. O método não está restrita a células B de memória ou pilhas de B de desegregação induzidas após uma resposta imune, mas também pode ser aplicado ao repertório B célula humana ingênua. Que funciona mesmo a partir de células B Ag específicos presentes em muito baixas frequências é uma boa indicação de sua eficiência. O princípio do método é como segue: células mononucleares de sangue periférico (PBMC) estão manchadas com dois tetrâmeros apresentando o antígeno de interesse, cada um marcado com um fluorocromo diferente (por exemplo, ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e um terceiro tetrâmero apresentando um antígeno estreitamente relacionado conjugados com um fluorocromo terceiro (por exemplo, Brillant violeta 421 (BV421)). Para enriquecer para ligação de antígeno de células, as células então são incubadas com pérolas revestidas com anti-PE e Abs anti-APC e classificada em colunas de separação de células. A fração de célula APC PE^{+ +} é selecionada, manchadas com uma variedade de mAbs específicos para diferentes tipos de células PBMC permitir a identificação de células B e sujeito a classificação de célula de citometria de fluxo. Células B, que são PE⁺ e APC⁺, mas violeta brilhante^-, são isoladas. Esta etapa Counter-seleciona as células que não são células B ou que não se ligam ao antígeno tetramerized, mas vincular a PE ou APC (estas células serão PE⁺ APC^– ou PE^– APC⁺) ou a parte não-antígeno dos tetrâmeros usado (estas as células serão BV421⁺). Células B não altamente específicas para o epítopo de interesse também são Counter-Selecionadodas para esta etapa (estas células também será BV421⁺). Assim, este método pode purificar altamente específicas B celulas que expressam receptores de células B (BCRs) capazes de discriminar entre dois antígenos muito aparentados. Única células B específicas são colhidas em tubos e suas PCR amplificados Ig cDNAs (os ácidos desoxirribonucleico complementares) clonado e expressa por uma linhagem de células humanas como secretada mAbs IgG.

Como uma prova de conceito, este estudo descreve a geração eficiente de mAbs humana, que reconhecem um peptídeo apresentado por uma classe de complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula e podem discriminar entre este peptídeo e outros peptídeos carregados na mesma MHC-eu alelo. Embora o nível de complexidade deste Ag é importante, esse método permite que (i) recuperação de alto rendimento de mAbs Ag-específicos; (ii) produção de mAbs capaz de discriminar entre dois estruturalmente fechar Ags. Esta abordagem pode ser estendida para pacientes infectados ou vacinados sem qualquer modificação do protocolo e também já foi implementada com sucesso em um rato humanizado sistema⁹. Assim, este estudo descreve uma abordagem versátil e eficiente para gerar mAbs totalmente humana que pode ser usado em pesquisa básica e imunoterapia.

Protocol

Todas as amostras de sangue periférico humano foram obtidas de doadores anônimos adultos após consentimento informado, em conformidade com o Comitê de ética local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedimento PLER NTS-2016-08).

1. isolamento de células mononucleares de sangue periférico humano

Nota: A partir de material pode ser sangue periférico humano total ou cytapheresis amostras. As amostras não devem ter mais de 8 h e suplementado com anticoagulantes (por exemplo, heparina).

1. Dilua o sangue com 2 volumes (sangue periférico humano) ou 5 volumes (cytapheresis exemplo) de meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
2. Cuidadosamente camada 35 mL de suspensão de células diluído em 15 mL de meio de gradiente de densidade em um tubo cónico de 50 mL. Faça como muitos tubos conforme necessário para distribuir o sangue diluído. Centrifugar a 1.290 x g, durante 25 min à temperatura ambiente em um rotor balançando-balde com freio fora.
3. Cuidadosamente Aspire a camada de células mononucleares na interface entre o meio de gradiente de densidade e a camada de plasma e as células de transferência para um novo tubo cónico de 50 mL.
4. Encha o tubo com meio RPMI, misturar e centrifugar a 1.290 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
5. Ressuspender as células em 20 mL de meio RPMI e centrifugar a 200 x g durante 10 minutos remover as plaquetas. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
6. Ressuspender as células em meio RPMI com 10% soro Fetal bovino (FBS).
   Nota: Proceda diretamente a rotulagem do tetrâmero ou manter células a 4 ° C durante a noite em uma concentração de 10⁷ células/mL.

2. tetrâmero associada magnético enriquecimento das células B Ag-específicos

1. Prepare Ag-tetrâmeros, acrescentando qualquer PE ou prêmio APC-rotulados classe streptavidin ou BV421-rotulado streptavidin em uma relação molar de 1:4 para monômeros de antígeno biotinilado. Adicione a quantidade apropriada de streptavidin-conjugado em três partes separadas, adicionando uma alíquota de cada 10 min à temperatura ambiente.
2. Distribuir as células (até 3 x 10⁸ por tubo) em tubos de 15ml cónico e centrifugar a 460 x g por 5 min.
   Nota: O seguinte protocolo é para um tubo.
3. Ressuspender as células em 200 µ l de PBS (fosfato Buffered Saline) com 2% FBS. Adicione PE - APC- e BV421-conjugados tetrâmeros, cada um a uma concentração final de 10 µ g/mL. Misture bem e incube por 30 min à temperatura ambiente.
4. Preparar o buffer de separação de células gelada (SB) usando PBS com 0,5% de BSA (albumina de soro bovino) e EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) 2 mM.
5. Adicione 10 mL de células SB da pelota por centrifugação a 460 x g durante 5 min.
6. Ressuspender as células em 500 µ l de gelada SB adicionar 50 μl, de anti-PE e 50 µ l de anti-APC microbeads magnéticos.
7. Misture bem e incube por 20 min a 4 ° C.
8. Repita a etapa 2.5 duas vezes.
9. Eliminar o sobrenadante cuidadosamente andresuspend o centrifugado em uma concentração de 2 x 10⁸ células/mL em gelo frio SB.
10. Equilibrar uma grande coluna de magnética posicionada sobre um ímã com 3 mL de SB.
11. Suspensão de células de transferência de 2,9 na parte superior da coluna equilibrada e permitir que ele seja completamente. PASSO fundamental: Para evitar a aglutinação da coluna, passe as células através de uma malha de nylon 70 µm.
12. Enxaguar o tubo que continha as células com 3 mL de gelo frio SB e transferir a reserva diretamente sobre a coluna (em caso de filtração, engranzamento de nylon enxaguar a 70 µm).
13. Quando o buffer foi completamente drenado na coluna, adicione mais 3 mL de gelo frio SB à coluna.
14. Repita a etapa 2.13 para outra lavagem de 3 mL.
15. Remova a coluna o ímã e coloque sobre um tubo de coletando cônico de 15 mL.
16. Adicionar 5 mL de gelo frio SB na parte superior da coluna e lave imediatamente as células da coluna usando o êmbolo. Repita este passo uma vez.
17. Centrifugar as células coletadas (fração de células positivas enriquecido tetrâmero relevantes) a 460 x g por 5 min e prossiga para anticorpos adicionais.
    Nota: Piscina coletadas células de todos os tubos, se for o caso.

3. coloração de células humanas B Ag-específicos e classificação de célula

1. Ressuspender as células com um coquetel de anticorpos anti-humanos CD3 (diluição final: 01:20), CD19 (01:20), CD14 (01:50), CD16 (01:50) e 7AAD (1: 1000) em um volume final de 100 µ l de PBS com 2% FBS. Incubar durante 30 min a 4 ° C.
2. Adicionar 10 mL de PBS para células, centrifugar 460 x g por 5 min e eliminar o sobrenadante. Repita este passo uma vez. Ressuspender as células em 200 µ l de PBS, filtro em malha de nylon 70 µm.
3. Proceda para classificar células B específicas a nível de célula única sobre um citômetro de classificador de célula com um 100 µm-bocal e uma pressão de 20 psi sem exceder 1.000 eventos/s⁹.
   Nota: A estratégia associada usada é mostrada na Figura 1. As células foram primeiro condomínio fechadas no CD14^–CD16 7AAD^–– células para excluir os monócitos, NK e células mortas (não mostradas na Figura 1). Então CD19⁺ B células foram Selecionadodas antes gating no duplas células coradas pelo PE e APC relevantes Ag-tetrâmeros. As células B não-específicos foram excluídas por retenção na BV421 de células negativas (inocente por Ag-tetrâmero irrelevante).
4. Colete células únicas B em 8-tira da polimerase anteriormente preenchida com 10 µ l de 1X PBS e 10 unidades de inibidor de RNAse e colocado em um rack para 96 microtubos. Congelar imediatamente os tubos PCR a-80 ° C.
   Nota: As máscaras do tipo escolhidas no citômetro instrumento são máscara de rendimento: 0, máscara de pureza: 32 e máscara de fase: 0. este depósito de célula única poderia ser ajustado para um prato PCR de 96 ou 384 poços, se necessário. Pilhas de B única devem ser congeladas tão rapidamente quanto possível e podem ser deixadas a-80 ° C durante várias semanas, se necessário.

4. única célula RT-PCR

1. Lyse pilhas diretamente aquecendo as amostras congeladas em tiras PCR a 70 ° C por 5 min em um banho seco.
2. Transferi as tiras para gelo e proceder ao reverter a transcrição (RT) pela adição de 10 µ l pelo tubo de um 2x buffer de mestre mistura contendo 1 mM dNTP, 25 µ g/mL oligod(T) as primeiras demão, 5 µM aleatório hexâmeros, 20 unidades de inibidor de RNAse e 400 unidades de transcriptase reversa.
   Nota: Após o descongelamento de células, RT deve ser executado rapidamente para evitar a degradação do RNA.
3. Incube a 25 ° C por 5 min permitir hexâmeros aleatórios cruzar, então incubar durante 1 h a 50 ° C e terminar com uma incubação a 95 ° C por 3 min parar a reação.
4. Proceda com duas rodadas de amplificação por PCR aninhada para cada uma das regiões de codificação para variável pesado (vH) e kappa (vLκ) ou cadeias leves lambda (vLλ).
   Nota: Como alternativa, RT amostras podem ser congeladas a-20 ° C e mantidas por uma semana.
   1. Para a primeira rodada de PCR, adicionar 3 µ l de cDNA para um volume final de 40 µ l contendo 1,5 mM MgCl₂, dNTPs de 0,25 mM, 2,5 unidades de DNA polimerase e 200 nM de primers externas (ver Figura 2 e Tabela de materiais para sequências da primeira demão).
      Nota: Composição do mix de cartilhas exterior. Para a amplificação da cadeia pesada: 4 encaminhar as primeiras demão (mistura de hve 5') e 2 reverter primeiras demão (mistura CµCγ de 3'). Para a amplificação de cadeia leve kappa, 3 encaminhar as primeiras demão (5' LV | misturar) e 1 reverso da primeira demão (3' Cκ543-566). Para a amplificação de cadeia leve lambda, 7 encaminhar Cartilhas (5' mistura de LVl) e 1 reverso da primeira demão (3' Cl).
      Nota: Os Primers foram desenhados por leme et al . para amplificação de toda a cadeia leve e pesada família genes⁵.
   2. Aplicam-se as seguintes condições de ciclismo: 94 ° C por 4 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 58 ° C para 55 e VLκ (60 ° C para VLλ) e VH s a 72 ° C, com um alongamento final passo a 72 ° C por 7 min.
   3. Para a segunda rodada PCR, use 3 µ l do primeiro produto de amplificação para um volume final de 40 µ l contendo 1,5 mM MgCl₂, dNTPs de 0,25 mM, 2,5 unidades de DNA polimerase e 200 nM de primers internas contendo sites de enzima de restrição para clonagem em expressão vetores (veja a Figura 2 e Tabela de materiais para sequências da primeira demão).
      Nota: A composição do mix de primeiras demão interna. Para a amplificação da cadeia pesada: 9 encaminhar Cartilhas (5' AgeIVH mistura) e 3 reverter primeiras demão (3' SalIJH mix). Para a amplificação de cadeia leve kappa, 9 encaminhar as primeiras demão (5' AgeIV | misturar) e 3 reverter primeiras demão (3' BsiWIJκ mix). Para a amplificação de cadeia leve lambda, 6 encaminhar as primeiras demão (5' AgeIVl mix) e 1 reverso da primeira demão (3' XhoICl).
      Nota: Os Primers foram desenhados por leme et al, para a amplificação de toda a família de genes de cadeia leve e pesada⁵.
   4. Aplicam-se as seguintes condições de ciclismo: 94 ° C por 4 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94° C, 30 s a 58 ° C para VH e LCκ (60 ° C para LCλ) e 45 s a 72 ° C, com um alongamento final passo a 72 ° C por 7 min.
5. Identifica poços positivos por migração 5 μL de produtos PCR de vH, vLκ e vLλ em um gel de agarose 1,5% (500 produtos de bp para segmentos de codificação de variável da cadeia pesada) e um produto bp 350 para variável cadeia leve codificação segmentos.
6. Purifica os restantes 35 µ l produtos do PCR remanescentes de poços positivos usando membranas de ultrafiltração, projetadas para a purificação de produtos PCR.
7. Eluir os produtos de PCR com 60 µ l de H₂O.

5. a expressão clonagem

1. Preparar as inserções
   Nota: Digerir 60 µ l de cada PCR purificado produto em um volume final de 100 µ l contendo o buffer de enzima de restrição apropriada.
   1. Para os produtos PCR vH, adicione 50 unidades da AgeI e 50 unidades de SalI e incubar durante 1 h a 37 ° C.
   2. Para vLλ os produtos de PCR, adicione 50 unidades da AgeI e 50 unidades de XhoI e incubar durante 1 h a 37 ° C.
   3. Para vLκ os produtos de PCR, adicionar 50 unidades da AgeI e incubar durante 1 h a 37 ° C. Purificar o digere usando 96 PCR de membranas e eluir com 60 µ l de H₂O. Digest o eluato de 60 µ l em um volume final de 100 µ l de tampão de enzima de restrição BsiWI, adicionar 50 unidades de BsiWI e incubar durante 1 h a 55 ° C.
   4. Inactivar as enzimas por aquecimento a 80 ° C por 15 min.
2. Preparação de expressar vetores
   Nota: os produtos de PCR vH são clonados em um vetor de expressão (HCγ1) que contém a cadeia pesada constante Cγ1 de IgG1. vLκ produtos PCR são clonados em um vetor de expressão (LCκ) que contém a cadeia de luz constante Cκ. vLλ produtos PCR são clonados em um vetor de expressão (LCλ) que contém a cadeia de luz constante Cλ.
   1. Execute as digestões seguintes:
      1. Misturar 1 µ g de expressão vetorial HCγ1 com 10 unidades de AgeI e 10 unidades de SalI endonucleases em um volume total de 20 µ l de tampão de restrição recomendado pelo fabricante e incubar durante 1 h a 37 ° C.
      2. Misturar 1 µ g de vetor de expressão LCκ com 10 unidades de enzima de restrição AgeI em um volume total de 20 µ l de tampão de restrição recomendado pelo fabricante e incubar durante 1 h a 37° C. Adicionar 10 unidades de BsiWI enzima de restrição e incubar durante 1 h a 55 ° C.
      3. Misturar 1 µ g de vetor de expressão LCλ com 10 unidades de AgeI e 10 unidades de endonucleases XhoI em um volume total de 20 µ l de tampão de restrição recomendado pelo fabricante e incubar durante 1 h a 37 ° C
   2. Aqueça cada mistura de digestão a 65 ° C por 10 min inactivar as enzimas de restrição.
   3. Realizar a ligadura de 5 µ l de produto PCR digerido com 2 µ l (100 ng) do correspondente vetor de expressão linear em um volume total de 20 µ l de tampão de DNA ligase 1x com 1 unidade de T4 DNA-Ligase por incubação durante a noite a 4 ° C.
      Nota: Como alternativa, a ligadura é executada por 3 h a 4° C.
3. Clonagem
   1. Electroporate 1 µ l da mistura de ligadura de 20 µ l em 45 µ l de electrocompetent caseiro TOP10 Escherichia coli (protocolos atuais em Biologia Molecular, seção 1.8.4-1.8.8). Imediatamente adicione 500 µ l de 2 médias X YT e incubar em banho-maria a 37 ° C por 30 min. bactérias propagação transformada em 2 x placas de ampicilina YT. Incubar durante uma noite a 37 ° C.
   2. Para cada transformação, tela oito colônias pelo PCR.
      1. Configurar um premix de reação como segue no gelo: 45 µ l de 5 x tampão de PCR, 12 µ l de MgCl₂ (25 mM), 4 µ l de dNTPs (a partir de uma estoque contendo 10 mM de cada um), 10 µ l de primer para a frente (estoque 10 µM) hybridizing à sequência de vetor (cartilha Ab-vec-sentido) e 10 µ l de primer reverso (estoque 10 µM) visando a região constante da cadeia leve ou pesado (consulte Tabela de materiais para sequências da primeira demão). Perfaz-se um volume final de 200 µ l com H₂O. Em seguida, adicione 4 µ l da enzima DNA polimerase (5 U / µ l).
      2. Distribua 25 µ l de pré-mistura de reação por tubo PCR 8-tira no gelo.
      3. Use um palito de dente estéril para pegar colônias individuais. Marcam o palito em um prato de ampicilina 2 x TY por constituir uma placa replicar e em seguida mergulhá-lo em um tubo de reação de PCR.
      4. Realizar a triagem do PCR, sob as seguintes condições de ciclismo: 94 ° C por 10 min, seguido de 25 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 55 ° C e 50 s a 72 ° C.
      5. Identifica as bactérias positivas por migração 5 µ l dos produtos PCR em um gel de agarose 1,5%.
         Nota: Colônias positivos dão um produto PCR por volta de 850 bp para o vetor de cadeia pesada e 600 bp para o vetor de cadeia leve.
   3. Inocular a quatro colônias positivas da placa de replicar em 2 mL de meio LB e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação a 200 rpm.
   4. Extrai o plasmídeo de culturas líquidas usando um kit de purificação de plasmídeo, conforme indicado pelo fabricante.
   5. Verificar a correcta inserção dos domínios variáveis por Sanger sequenciamento do plasmídeo com o primer Ab-vec-sentido.
      Nota: Plasmídeos com a inserção correta (codificação o HC e a LC correspondente) devem ser cotransfected em 293A células de secreção. A especificidade de pequena escala-produzido mAbs é analisada por ELISA. Então, a produção em larga escala é executada se aplicável.

6. produção de mAbs

1. Produção de pequena escala para a verificação da especificidade
   1. No dia anterior o transfection, rim embrionário humano 293A de semente 15.000 (HEK 293A) em 200 µ l de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de células FBS por bem em placas de 96 poços. Incubar durante uma noite em uma incubadora de CO₂ (5% CO₂) a 37 ° C.
   2. Cotransfect 293A células em meio DMEM contendo 10% FBS usando um derivado o polyethylenimine linear como reagente de transfeccao.
      Nota: Execute o transfeccao triplica. O seguinte protocolo é para um bem de uma placa de 96 poços de fundo plano.
      1. Dilua 0,5 µ l de reagente de Transfeccao de DNA em 10 µ l de 150 mM de NaCl. Dilua a 0,125 µ g de vH e 0,125 µ g de vetores expressando vL em 10 µ l de 150 mM de NaCl. Vórtice cada diluição por 10 s.
      2. Adicione 10 µ l diluída reagente de Transfeccao de DNA em solução do ADN de 10 µ l. Vórtice 15 s e incube por 15 min à temperatura ambiente. Adicione a mistura de 20 µ l de drop-wise em células 293A e misturar suavemente agitando a placa.
   3. Substitua o médio 16 h após transfection e células de cultura durante 5 dias em meio livre de soro.
      Nota: Use meio livre de soro para evitar soro Igs contaminando os anticorpos produzidos.
   4. Elimine as células e restos por centrifugação a 460 x g durante 5 min.
   5. Sobrenadantes de colheita por aspiração com uma pipeta multicanal e transferi-los para uma placa de 96 V-fundo.
   6. Casaco Ag relevante durante a noite a 4 ° C, em 100 µ l por alvéolo de revestimento de ELISA/ELISPOT reconstituído buffer 1x em uma concentração final de 2 µ g/mL em placas de 96 poços ELISA. Consulte exemplos de ⁹.
   7. Bloco de poços com meio DMEM FBS de 10% para 2 h a 37 ° C
   8. Adicionar 50 µ l de sobrenadantes de células transfectadas 293A de passo 6.1.5 e incubar durante 2 h em RT
   9. Adicione 100 µ l de um anti-humano Conjugado IgG Ab a enzima peroxidase (HRP) de rábano 1 µ g/ml e incubar por 1h à temperatura ambiente. Adicionar o substrato cromogênico de 50 µ l (TMB) e incube por 20 min.
   10. Leia as densidades ópticas a 450 nm em um espectrofotômetro.
       Nota: Os mAbs específicos revelados pelo ensaio de ELISA pode ser ainda mais produzido em larga escala e purificado na proteína uma coluna apresentando afinidade com IgG humana.
2. Produção em larga escala e purificação de mAbs específicos
   1. No dia anterior o transfeccao, semente 6 x 10⁶ embrionárias rim humano 293A (HEK 293A) células em frascos de² 175 cm, contendo 25 mL DMEM suplementado com 10% FBS. Incubar durante uma noite em uma incubadora de CO₂ (5% CO₂) a 37 ° C.
      Nota: As células devem ser 70% confluente quando transfectadas.
   2. Cotransfect 293A células em meio DMEM contendo 10% FBS usando um derivado o polyethylenimine linear como reagente de transfeccao.
      1. Dilua 50 µ l de reagente de Transfeccao de DNA em 450 µ l de 150 mM de NaCl. Dilua 10 µ g de vH e 10 µ g de vetores expressando vL em 500 µ l de 150 mM de NaCl. Vórtice 10 s cada diluição.
      2. Adicione o reagente de Transfeccao de DNA diluído para a solução de DNA. Vórtice 15 s e incube por 15 min à temperatura ambiente. Adicione a mistura de 1 mL de drop-wise para as células e misturar suavemente agitando o balão.
   3. Substitua o médio 16 h após transfection e células de cultura durante 5 dias em meio livre de soro.
   4. Médio de colheita por aspiração com uma pipeta de 25 mL.
   5. Elimine as células e restos por centrifugação a 460 x g durante 5 min.
   6. Purificar os anticorpos usando uma coluna de 1 mL revestida com proteína A, em um sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida a 4 ° C.
      1. Equilibrar a proteína uma sepharose coluna com 20 mM de tampão de fosfato (pH 7).
      2. Filtre o meio de cultura celular de 6.2.5 usando um filtro de 1,22 µm e, em seguida, um filtro de 0,45 µm.
      3. Carrega o meio filtrado na coluna.
      4. Lavar com 20 mM de tampão de fosfato (pH 7) e eluir com um tampão de citrato de 0,1 M (pH 3,5).
      5. Leia as densidades ópticas em 280 nm em um Espectrofotômetro de absorção e imediatamente neutralizar proteicos fracções com 1 M Tris tampão (pH 9).
   7. Dialize Ab purificado durante a noite a 4 ° C, em uma gaveta com um peso molecular de 3,5 K corte contra tampão PBS (pH 7,4).
   8. Esterilize por pureza de filtragem e controle de 0,2 µm por cromatografia de exclusão de tamanho, conforme indicado pelo fabricante.

Representative Results

Partir de PBMC de doadores saudáveis, presentes neste projeto a geração de mAbs humana, que reconhece o peptídeo Pp65₄₉₅ (Pp65, do citomegalovírus humano) apresentado pela classe complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula HLA - A * 0201 ( HLA-A2). Esses mAbs podem discriminar entre este complexo e complexos que representam outros peptídeos carregados no mesmo MHC-eu molécula.

PBMC foram corados com HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC e tetrâmeros de HLA-A2/MelA2-BV421, conforme descrito no protocolo acima. Após o enriquecimento da célula Fima de células positivas PE - e APC-tetrâmero, as células eluted estavam manchadas com Celia adicionais. No classificador de célula de citometria de fluxo, magneticamente enriquecido de células foram primeiro condomínio fechadas no viável CD14^–CD16^–CD3^–CD19⁺ camisolas (células B). A Figura 1 mostra a estratégia associada usada para isolar as células B expressando BCRs capazes de discriminar entre HLA-A2/Pp65 e outros relacionados com complexos de HLA-A2/peptídeo. Seleção de células B de interesse foi realizada após retenção na HLA-A2/Pp65 PE⁺ e HLA-A2/Pp65 APC⁺ de duplo-positivos, para excluir o fluorocromo específicas células B que foram coradas isoladamente PE⁺ ou APC⁺. Finalmente, células B altamente específicas foram identificadas pelo gating no negativas células HLA-A2/MelA2-BV421. Isto permite a identificação de células B expressando BCRs acoplou HLA-A2/Pp65, em um peptídeo e HLA-A2-dependente, discriminar entre estas células B e aquelas dirigidas contra β2 microglobulina, biotina, HLA-A2 ou que não discriminam entre peptídeos na ranhura de vinculação de MHC. Todas essas células este último será BV421 células positivas. Como mostrado anteriormente e mais documentado com outros tipos de Ag, esta estratégia de exclusão é mais importante devido os aumentos na capacidade discriminativa das células B para o Ag⁹.

Depois de células B específicas únicas foram separadas, cDNAs codificação para pesados e luz Ig-correntes foram amplificados por RT-PCR. Pares de cadeia leve e pesada, segmentos de codificação foram obtidos em cerca de 50% de B células únicas testadas (tabela 1). Domínio variável sequências foram então clonadas em expressão vetores contendo sequências de domínio constante correspondente (pesado constante 1 e luz constante κ ou λ). Células de rim humano embrionário (HEK, 293A células) foram cotransfected com vetores de cadeia leve e pesada. Os mAbs secretados de isotipo IgG1 foram colhidos os sobrenadantes de cultura de células 293A 5 dias depois do transfection (ver Figura 3 para a estratégia global de produção de mAbs plenamente humano). Isto produziu com sucesso um anticorpo específico HLA-A2/Pp65 a partir de 3 células de único linfócito B, produzindo pares de cadeia leve e pesada, codificação segmentos (tabela 1). Ensaios de ELISA demonstraram claramente que o mAb foi ambos MHC e peptídeo-dependente para a sua ligação com HLA-A2/Pp65 complexos (Figura 4A), e vários miligramas de mAb prontamente foram produzidas para uma análise mais profunda (por exemplo, análises de afinidade, ensaios funcionais). Sua afinidade obrigatória, determinada pela ressonância de plasmon de superfície (SPR), foi cerca de 7 x 10^-6 M (Figura 4B).

Assim, este artigo descreve uma combinação de métodos sensíveis e eficientes permitindo i) deteção de pilhas de B de Ag-específicas relevantes, mesmo quando presente em muito baixas frequências no sangue de doadores saudáveis e ii) a geração de mAbs humana altamente discriminativa.

Figura 1: Deteção de HLA-A2/Pp65 células específicas de B de PBMC humano.
3 x 10⁸ PBMC foram corados com HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC e HLA-A2/MelA2-BV421 tetrâmeros. Após o enriquecimento da célula Fima de células positivas PE - e APC-tetrâmero, as células eluted estavam manchadas com Celia adicionais. Em um classificador de pilha de citometria de fluxo, as células foram fechadas primeiro na viável singlet CD14^–CD16 linfócitos^– (não mostrados), então na CD19⁺CD3 células^– . Então, células B manchadas com tanto HLA-A2/Pp65-PE e HLA-A2/Pp65-APC tetrâmeros foram bloqueadas. O tetrâmero de HLA-A2/MelA-BV421 foi usado para excluir células B que não reconhecia HLA-A2/Pp65, em um peptídeo e MHC-dependente.

Figura 2: estratégia para amplificação e clonagem de genes Ig. Leve e pesado Ig-cadeia de codificação de genes foram amplificados por RT-PCR aninhado. Primeiros PCRs foram realizadas com uma mistura de primers para a frente, hybridizing a região líder e reversos primers específicos para as regiões constantes de kappa pesado, luz adequada, ou cadeias leves lambda. Segundo PCRs foram realizados com primers que contém sítios de restrição, frente e verso cartilhas foram respectivamente específicas para início de segmentos V e para o fim dos segmentos de J. Produtos PCR foram sequenciados, digerido com enzimas de restrição e clonado em vetores de expressão contendo domínios apropriados constantes. CMV: promotor de citomegalovírus; AmpR: gene de resistência para a ampicilina.

Figura 3: Estratégia de geral de reconstrução de mAbs humano recombinante.
Uma estratégia de classificação baseada em tetrâmero permite a detecção de células B de interesse. Células B altamente específicas foram classificados monocelulares. Segmentos de codificação Ig-cadeia leves e pesados foram ampliados usando RT-PCR. Sequências de domínio variável foram clonadas em vetores de expressão eucarióticos separado no quadro com segmentos de gene codificação constantes regiões leves e pesadas. Os correspondentes mAbs plenamente humanos foram expressos por células de 293A HEK transitoriamente transfectadas e purificados a partir da sobrenadante de cultura. Esta figura foi modificada de Ouisse et al . (2017) ⁹.

Figura 4: Caracterização de um representante mAb altamente discriminatórios contra HLA-A2/Pp65 gerados a partir de sangue periférico humano circulantes de células B.
A) especificidade de mAb PC1.02 contra HLA-A2/Pp65 testado por ELISA. As placas foram revestidas com relevantes (HLA-A2/Pp65) ou irrelevantes complexos de HLA-A2 contendo peptídeos HLA-A2-restrito: MelA, NS3 (HCV-1) e GagP17 (HIV-1) em 2 µ g/mL, o mAb PC1.02 foi adicionado e um anti-humano IgG-HRP Ab foi usado para a deteção. Densidades ópticas (OD) foram lidos a 450 nm. B) determinação de afinidade do mAb PC1.02 usando ressonância de Plasmon de superfície (SPR) por fluindo as diferentes concentrações de complexos de HLA-A2/Pp65 sobre CM5 ligados a microplaqueta mAb. Esta figura foi modificada de Ouisse et al . (2017) ⁹.

	Número de PBMC	Número de células PE + APC + depois de enriquecimento	Número de células excluídos (BV421 +)	Número de células únicas classificadas	Número de poços analisados	Número de poços com HC e LC associado (% de recuperação)	Número de mAbs produzidos	Número de mAbs específicos
HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02)	3 x 108	818	117	161	7	3 (43%)	3	1

Tabela 1: Análise de HLA-A2/Pp65 células específicas de B.
O impacto da estratégia de exclusão de pilhas de B inespecíficas, os rendimentos de amplificação do gene de Ig e produção de mAb, desde células isoladas, HLA-A2/Pp65 específicas B foram avaliados/medido.

Discussion

O protocolo proposto é um método poderoso para a geração de mAbs humano diretamente de células B Ag específicos circulantes no sangue. Ele combina três aspectos importantes: (i) a utilização de um enriquecimento magnético tetrâmero-associados, que permite um isolamento ex vivo de mesmo raras células B Ag-ligação; (ii) uma estratégia associada que usa três tetrâmeros de Ag (dois entes relevantes e um irrelevante) rotulados com três diferentes fluorochromes para isolar, por citometria de fluxo, apenas as células B expressando um BCR específico para a Ag desejado; (iii) a reconstrução dos cDNAs mAb recombinantes correspondentes por RT-PCR no nível de célula única e expressão dos cDNAs em células humanas.

Estudos anteriores propuseram usando um ou dois antígenos relevantes fluorescentes para rotular humanas células B antes da classificação e subsequente produção de mAbs das células B isolado^6,7,8. Uma análise em pacientes com artrite reumatoide e um em um modelo de rato auto-imune, têm associado um antígeno fluorescente irrelevante para caracterizar as células B auto-reativas e determinar sua frequência^10,11. Tanto quanto sabemos, use uma combinação de dois tetrâmeros fluorescente antígeno relevante e um tetrâmero de antígeno irrelevante não foi descrito anteriormente para o enriquecimento de células específicas de B antes da sua utilização para a produção de mAbs plenamente humano. Esse método otimizado permite mAbs discriminativa totalmente humano ser obtido em menos de um mês e pode ser realizado com sucesso, mesmo quando a partir de um repertório de células B de ingênuo. Assim, ele não tem nenhum dos principais inconvenientes da exposição do fago, célula B humana immortalization, ou outro anteriormente descrito os procedimentos de reconstrução do mAb baseados em biologia molecular.

Esta célula classificação estratégia resulta em uma recuperação de alto rendimento de mAbs humana Ag-específicos. Pares de segmentos de cadeia leve e pesada de simples células B isoladas são amplificados com uma taxa de sucesso de cerca de 50%. Segmentos de cadeia leve quase sempre são amplificados, mas isto não é o caso dos segmentos da cadeia pesada. Eficiência RT-PCR depende fortemente do respeitando os seguintes pontos: eu) única classificada B células devem ser congeladas mais rapidamente possível; II) adicionando 30 unidades de inibidor de RNase e minimizando o tempo entre tomar as células B do congelador e lançando a reação de RT; III) descongelar todos os iniciadores no gelo; IV) nunca congelar/descongelar as primeiras demão mais de três vezes; v) factor primers para um máximo de um ano.

No que diz respeito a eficiência da produção dos mAbs recombinantes correspondentes com a especificidade desejada, é cerca de 30-40% do caso para pMHC mAbs específicos. Esses mAbs particulares tem que reconhecer o peptídeo e a molécula de MHC, o que é bastante exigente, e mostramos anteriormente que o rendimento global de recuperação de mAbs específicos dirigidos contra antígenos mais convencionais é superior, acima de 100% para o Β-galactosidase antígeno⁹. Importa sublinhar que a escolha de um Ag apropriado para o tetrâmero irrelevante é importante para aumentar a especificidade dos mAbs produzidos.

A afinidade do mAb anti-HLA-A2/Pp65 (PC1.02), descrito no presente artigo é relativamente baixa, cerca de 7 x 10^-6 M, semelhante a afinidade de um TCR. Este resultado era esperado, como isolamento de células B foi realizado de doadores de ingênuo. A maioria das células B de tetrâmero⁺ foram IgM⁺IgG^-, que reduz a probabilidade de se obter boas Ag-ligantes. No entanto, esse método também pode fazer possível a classificação de memória cross-reactive B células contra um Ag desejada de doadores de ingênuo, por causa do passado imunológico dos indivíduos¹². Além disso, este método é facilmente aplicável para pacientes infectados ou vacinados ou imunizados animais humanizados, conforme descrito em ⁹, onde na vivo maturação de afinidade pode aumentar a afinidade dos mAbs resultante para cerca de 1 x 10^-9 M. vários também foram descritos os procedimentos para melhorar a afinidade de mAbs em vitro, nomeadamente através de reprodução somática nas células expressando o anticorpo (revisto em ¹³).

Em conclusão, propomos uma estratégia versátil para produção de mAbs altamente discriminatórios que pode ser usada em vários tipos de situação, de um ingênuo individual para um doador vacinado ou um paciente que sofre de uma doença auto-imune. MAbs plenamente humano gerado desta forma contra um epítopo desejado poderia ser útil tanto para a pesquisa básica e imunoterapia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003