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Immunology and Infection

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56508

ERRATUM NOTICE

Summary

Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.

Abstract

Anticuerpos monoclonales (mAbs) son poderosas herramientas útiles para tanto investigación fundamental y en biomedicina. Su alta especificidad es indispensable cuando el anticuerpo tiene que distinguir entre estructuras muy relacionadas (por ejemplo, una proteína normal y su una versión mutada). La actual forma de generar estos mAbs discriminativa implica investigación extensa de múltiples células B productoras de AC, que es costosa y consume tiempo. Proponemos aquí un método rápido y rentable para la generación de discriminativo, mAbs plenamente humana a partir de linfocitos B circulantes de sangre humana. La originalidad de esta estrategia es debido a la selección de antígeno específico células de Unión B combinada con la selección contra de todas las otras células, usando disponible periféricos sanguíneos mononucleares células (PBMC). Una vez que las células B específicas aisladas, secuencias de ADNc (complementario ácido desoxirribonucleico) que codifica para el mAb correspondiente se obtienen utilizando la tecnología de reacción en cadena de la transcripción-polimerasa reversa (RT-PCR) unicelular y expresado posteriormente en humanos células. Dentro de tan poco como 1 mes, es posible producir miligramos de mAbs humano altamente discriminativo contra prácticamente cualquier antígeno deseado naturalmente detectado por el repertorio de células B.

Introduction

El método aquí descrito permite la producción rápida y versátil de anticuerpos monoclonales completamente humanos (mAbs) contra un antígeno deseado (Ag). mAbs son herramientas esenciales en muchas aplicaciones de investigación básica in vitro e in vivo: flujo cytometry, histología, experimentos de western-blotting y bloqueo, por ejemplo. Además, mAbs se utilizan más en medicina para tratar enfermedades autoinmunes, cáncer y para el control de rechazo de trasplante1. Por ejemplo, mAbs anti-CTLA-4 y anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recientemente fueron utilizados como inhibidores de control inmune en cáncer tratamientos2.

Los mAbs primeros fueron producidos por inmunoglobulina (Ig)-secretoras de hibridomas obtienen de las células esplénicas de ratones inmunizados o ratas. Sin embargo, la fuerte respuesta inmune contra mAbs murino o rata impide su uso terapéutico en humanos, debido a su rápida separación y el probable inducción de reacciones de hipersensibilidad3. Para abordar este problema, secuencias de la proteína animal de mAbs han sido parcialmente reemplazadas por los humanos para generar anticuerpos de ratón-humano o humanizados quiméricos llamados. Sin embargo, esta estrategia sólo parcialmente disminuye la inmunogenicidad, aumentando substancialmente el costo y la escala de tiempo de producción. Hay varias estrategias para esto y una mejor solución es generar mAbs humana directamente de las células B humanas. Uno de ellos es el uso de la visualización de fagos o levadura. Se trata de mostrar los dominios variables de una biblioteca combinatoria de Ig humana al azar pesado y luz cadenas en fagos o levaduras y llevar a cabo un paso de selección utilizando el antígeno específico de interés. Un gran inconveniente de esta estrategia es que las cadenas pesadas y ligeras están aleatoriamente asociadas, llevando a un incremento muy grande en la diversidad de los anticuerpos generados. Anticuerpos obtenidos no corresponden a las que surgirían de una respuesta inmune natural contra un Ag particular. Por otra parte, plegamiento de la proteína humana y modificaciones postraduccionales no son sistemáticamente reproducidas en procariotas o en levaduras. Un segundo método de producción humana mAb es la inmortalización de células B humanas naturales, por infección del virus Epstein - Barr o expresión de los factores anti-apoptótica BCL-6 y BCL-XL4. Sin embargo, este método sólo es aplicable a las células de memoria B y es ineficiente, que requieren la proyección de numerosos mAb inmortalizado B células productoras para identificar los clones de mAb pocos (si cualquier) con la especificidad antigénica deseada. El método es costoso y desperdiciador de tiempo.

Un nuevo protocolo recientemente se ha descrito para la producción de mAbs humano aislado solo de células B5. Se basa en un optimizado unicelular revertir la transcripción-polimerasa reacción en cadena (RT-PCR) para la amplificación de ambos la pesada luz cadena y codificación de segmentos de una sola célula B ordenado. Esto es seguido por la clonación y expresión de estos segmentos en un sistema de expresión eucariotas, lo que permite la reconstrucción de un mAb plenamente humana. Este protocolo se ha utilizado con éxito a partir de las células de B de donantes vacunados. Las células se cosecharon varias semanas después de la vacunación para obtener frecuencias más altas de las células B contra el Ag deseado y así limitar el tiempo requerido para la detección del6. También se han producido otros mAbs plenamente humanas de infectados por el VIH+ (Virus de inmunodeficiencia humana) pacientes7 y melanoma pacientes8. A pesar de estos avances, todavía hay no hay procedimiento disponible que permite el aislamiento de células B Ag específica independientemente de su fenotipo de memoria o de frecuencia.

El procedimiento aquí descrito conduce a aislamiento eficiente ex vivo de las células B humanas circulantes basados en su especificidad BCR, seguido por la producción de plenamente humana mAbs específicos de antígeno en alto rendimiento y con un tiempo de proyección baja. El método no se limita a las células de memoria B o células B secretoras de anticuerpos inducidas después de una respuesta inmune, pero puede aplicarse también al repertorio de células B humanos ingenuos. Que funciona incluso a partir de las células B Ag-específica presentes en muy baja frecuencia es un buen indicador de su eficacia. El principio del método es como sigue: se tiñen las células mononucleares periféricas en sangre (PBMC) con dos tetrámeros que presentan el antígeno de interés, cada uno marcado con un fluorocromo diferente (por ejemplo, ficoeritrina (PE) y Allophycocyanin (APC)), y un tercer tetrámero que presenta un antígeno estrechamente relacionado conjugado con un fluorocromo terceros (p. ej., brillante violeta 421 (BV421)). Para enriquecer las células de antígeno-que ata, las células se incuban luego con bolas recubiertas con anti-PE y Abs anti-APC y ordenados en columnas de separación celular. La fracción de células APC PE+ + es seleccionada, manchadas con una variedad de mAbs específicos para diferentes tipos de células PBMC permitir la identificación de las células B y sometida a clasificación de celda de citometría de flujo. Las células de B PE+ y APC+, pero brillante violeta-, están aisladas. Este paso selecciona en células que no son las células de B o no se unen al antígeno tetramerized, pero unen a PE o APC (estas células serán PE+ APCo PE APC+) o a la parte no-antígeno de los tetrámeros usado (estos las células serán BV421+). Las células de B no altamente específicas para el epitopo de interés también se seleccionan en este paso (estas células también será BV421+). Por lo tanto, este método puede purificar células B altamente específicas expresan receptores de las células B (BCR) capaces de discriminar entre antígenos relacionados muy de cerca conexos dos. Las células B específicas se recogen en tubos y su cDNAs de la polimerización en cadena-amplificados de la Ig (los ácidos desoxirribonucleico complementarios) clonado y expresado por una línea de células humanas como mAbs IgG secretada.

Como una prueba de concepto, este estudio describe la generación eficiente de mAbs humanos, que reconoce un péptido presentado por una clase complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) molécula y puede discriminar entre este péptido y otros péptidos cargados en el mismo MHC-I alelo. Aunque el nivel de complejidad de este Ag es importante, este método permite (i) recuperación de alto rendimiento de mAbs específicos de Ag; (ii) producción de mAbs capaces de discriminar entre dos estructuralmente cerca de Ags. Este enfoque puede ser extendido a pacientes infectados o vacunados sin ninguna modificación del protocolo y también ya ha sido implementado con éxito en un sistema humanizado de la rata del9. Por lo tanto, este estudio describe un enfoque versátil y eficiente para generar mAbs plenamente humana que pueden ser utilizados en la inmunoterapia y la investigación básica.

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Protocol

Todas las muestras de sangre periférica fueron obtenidas de donantes adultos anónimos después de consentimiento informado, según el Comité de ética local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedimiento Sampler NTS-2016-08).

1. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica

Nota: Material de partida puede ser sangre total periférica o cytapheresis muestras. Las muestras no deben ser mayores de 8 h y complementan con los anticoagulantes (p. ej., heparina).

  1. Diluir la sangre con 2 volúmenes (sangre periférica) o 5 volúmenes (cytapheresis muestra) del Medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
  2. Cuidadosamente la capa 35 mL de suspensión celular diluido en 15 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo cónico de 50 mL. Hacer tantos tubos como sea necesario para distribuir toda la sangre diluida. Centrifugue a 1.290 x g durante 25 minutos a temperatura ambiente en un rotor que hace pivotar-cubo con freno apagado.
  3. Cuidadosamente y aspirar la capa de células mononucleares en la interfase entre el medio de gradiente de densidad y de la capa de plasma y transferir las células a un nuevo tubo cónico de 50 mL.
  4. Llenar el tubo con Medio RPMI, mezcle y centrifugue a 1.290 x g por 10 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante.
  5. Resuspender el precipitado de células en 20 mL de Medio RPMI y centrifugue a 200 x g durante 10 min eliminar las plaquetas. Retire con cuidado el sobrenadante. Repita este paso una vez.
  6. Resuspender el precipitado de células en Medio RPMI con 10% suero bovino Fetal (FBS).
    Nota: Vaya directamente a la etiqueta de tetrámero o mantener a las células a 4 ° C durante la noche en una concentración de 107 células/mL.

2. asociados de tetrámero enriquecimiento magnético de las células B específicas de Ag

  1. Preparar Ag tetrámeros agregando o PE o estreptavidina de grado premium marca APC o estreptavidina marcada con BV421 en una proporción molar de 1:4 a los monómeros de antígeno biotinilado. Añadir la cantidad apropiada de conjugado estreptavidina en tres porciones separadas, añadiendo una alícuota cada 10 min a temperatura ambiente.
  2. Distribución de las células (hasta 3 x 108 por tubo) en tubos cónicos de 15 mL y centrifugar a 460 x g durante 5 minutos.
    Nota: El siguiente protocolo es para un tubo.
  3. Resuspender el precipitado de células en 200 μL de PBS (fosfato tampón salino) con 2% FBS. Añadir PE, APC y tetrámeros conjugado con BV421, cada uno a una concentración final de 10 μg/mL. Mezclar bien e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  4. Preparar el tampón de separación celular helada (SB) con PBS con 0,5% BSA (albúmina de suero bovino) y EDTA (ácido etilendiaminotetracético) 2 mM.
  5. Añadir 10 mL de células SB pellets por centrifugación a 460 x g durante 5 minutos.
  6. Resuspender las células en 500 μl de helada código añadir 50 μl de anti-PE y 50 μl de microesferas magnéticas anti-APC.
  7. Mezclar bien e incubar por 20 min a 4 ° C.
  8. Repita el paso 2.5 dos veces.
  9. Eliminar el sobrenadante con cuidado andresuspend el precipitado de células a una concentración de 2 x 108 células/mL de hielo frío SB.
  10. Equilibrar una columna magnética grande colocada sobre un imán con 3 mL de SB.
  11. Transferencia de suspensión celular de 2.9 en la parte superior de la columna equilibrada y permitir que drene completamente. PASO crítico: Para evitar la aglutinación de la columna, pasar las células a través de una malla de nylon de 70 μm.
  12. Enjuague el tubo que contenía las células con 3 mL de hielo frío SB y transferir el buffer directamente a la columna (en caso de filtración, enjuague el 70 μm de malla de nylon).
  13. Cuando el buffer ha drenado totalmente en la columna, añadir otro 3 mL de hielo frío SB a la columna.
  14. Repita el paso 2.13 para otro lavado con 3 mL.
  15. Retire la columna del imán y lugar sobre un tubo colector cónico de 15 mL.
  16. Añadir 5 mL de hielo frío SB en la parte superior de la columna y lavar inmediatamente las células de la columna utilizando el émbolo. Repita este paso una vez.
  17. Centrifugar las células recogidas (fracción de positivo de la célula de tetrámero pertinentes enriquecido) a 460 x g durante 5 minutos y proceder a la coloración del anticuerpo adicional.
    Nota: Piscina recoge las células de todos los tubos, si procede.

3. tinción de las células B humanas específicas de Ag y clasificación celular

  1. Resuspender el precipitado de células con un cóctel de anticuerpos anti-humanos contra CD3 (dilución final: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50) y 7AAD (1: 1000) en un volumen final de 100 μl de PBS con 2% FBS. Incubar durante 30 min a 4 ° C.
  2. Añadir 10 mL de PBS a las células, centrifugar a 460 x g durante 5 min y eliminar el sobrenadante. Repita este paso una vez. Resuspender el precipitado de células en 200 μL de PBS, filtro en malla de nylon de 70 μm.
  3. Proceder a clasificar las células B específicas a nivel unicelular en un citómetro de clasificador de células con una boquilla de 100 μm y una presión de 20 psi sin sobrepasar los 1.000 eventos/s9.
    Nota: La estrategia bloquea utilizada se muestra en la figura 1. Las células primero fueron gated en CD14CD16 7AAD células monocitos, NK y células muertas (no se muestra en la figura 1). Entonces CD19+ B células fueron seleccionadas antes de bloquear en células doble por PE y APC las Ag-tetrámeros. Las células de B no específicos fueron excluidas por compuerta en BV421 las células negativas (mancha por Ag-tetrámero irrelevante).
  4. Recoger las células B en la tira de 8 tubos PCR previamente llena con 10 μl de PBS de x 1 y 10 unidades de inhibidor de la Rnasa y colocar sobre una rejilla para 96 microtubos. Congelar inmediatamente los tubos PCR a-80 ° C.
    Nota: Las máscaras del tipo seleccionadas en el instrumento de citómetro son máscara de rendimiento: 0, máscara de pureza: 32 y la máscara de fase: 0. este depósito unicelular se podría ajustar a una placa PCR de 96 o 384 pocillos, si es necesario. Las células B deben ser congeladas lo antes posible y se pueden dejar a-80 ° C durante varias semanas, si es necesario.

4. célula RT-PCR

  1. Lyse las células calentando directamente las muestras congeladas en tiras PCR a 70 ° C por 5 min en un baño seco.
  2. Transferencia de tiras para hielo y proceder a revertir la transcripción (RT) mediante la adición de 10 μl por tubo de 2 x mezcla principal tampón que contiene 1 mM dNTP, cartillas de oligod(T) de 25 μg/mL, 5 μm random hexamers, 20 unidades de inhibidor de la Rnasa y 400 unidades de transcriptasa inversa.
    Nota: Después de la descongelación de la célula, RT debe realizarse rápidamente para evitar la degradación del RNA.
  3. Incubar a 25 ° C durante 5 minutos permitir que random hexamers hibridar, incubar 1 h a 50 ° C, y terminar con una incubación a 95 ° C por 3 min detener la reacción.
  4. Continuar con dos rondas de amplificación de PCR anidada para cada una de las regiones de codificación variable pesada (vH) y kappa (vLκ) o las cadenas ligeras lambda (vLλ).
    Nota: Como alternativa, muestras de RT pueden ser congeladas a-20 ° C y durante una semana.
    1. Para la primera ronda de PCR, agregar 3 μl de cDNA para un volumen final de 40 μl, que contiene 1.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs, 2.5 unidades de ADN polimerasa y 200 nM de imprimadores exteriores (ver figura 2 y Tabla de materiales para las secuencias de la cartilla).
      Nota: Composición de la mezcla de cebadores externos. Para la amplificación de cadena pesada: 4 adelante cebadores (5' HVI mix) y atrás de 2 cartillas (3' CµCγ mix). Para la amplificación de cadena ligera kappa, 3 adelante cebadores (5' LV | mix) y 1 atrás de la cartilla (3' Cκ543-566). Para la amplificación de cadena ligera lambda, 7 adelante cebadores (5' mezcla de LVl) y 1 atrás cartilla (3' Cl).
      Nota: Cebadores fueron diseñados por Sierpe et para la amplificación de la cadena pesada y ligera genes familiares5.
    2. Aplicar las siguientes condiciones de ciclismo: 94 ° C durante 4 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 58 ° C VH VLκ (60 ° C para VLλ) y 55 paso s a 72 ° C, con una elongación final a 72 ° C por 7 min.
    3. Para la segunda ronda de PCR, use 3 μl del primer producto de la amplificación para un volumen final de 40 μl que contiene 1.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs, 2.5 unidades de ADN polimerasa y 200 nM de cebadores internos que contienen sitios de restricción enzimática para la clonación en la expresión vectores (ver figura 2 y Tabla de materiales para las secuencias de la cartilla).
      Nota: Composición de la mezcla de cebadores internos. Para la amplificación de cadena pesada: 9 adelante cebadores (5' AgeIVH mix) y atrás de 3 cebadores (3' mix de SalIJH). Para la amplificación de cadena ligera kappa, 9 adelante cebadores (5' AgeIV | mezclar) y 3 atrás cartillas (3' mix de BsiWIJκ). Para la amplificación de cadena ligera lambda, 6 adelante cebadores (5' AgeIVl mix) y 1 atrás de la cartilla (3' XhoICl).
      Nota: Cebadores fueron diseñados por Sierpe et al., para la amplificación de todos los de la familia de genes de cadena pesada y ligera5.
    4. Aplicar las siguientes condiciones de ciclismo: 94 ° C durante 4 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94° C, 30 s a 58 ° C VH LCκ (60 ° C para LCλ) y 45 paso s a 72 ° C con una elongación final a 72 ° C por 7 min.
  5. Identificar pozos positivos por migración 5 μL de los productos PCR de vH, vLκ y vLλ en gel de agarosa al 1.5% (500 bp productos para segmentos de codificación variable de cadena pesada) y un 350 bp para la cadena ligera variable codificación de segmentos.
  6. Purificar los restantes 35 μl PCR Productos remanentes de pozos positivos mediante membranas de ultrafiltración, diseñadas para la purificación de los productos PCR.
  7. Eluir los productos PCR con 60 μL de H2O.

5. expresión de clonación

  1. Preparar insertos
    Nota: Digerir 60 μL de cada PCR purificado producto en un volumen final de 100 μl que contiene el tampón de enzima de restricción apropiada.
    1. Para productos PCR de vH, añadir 50 unidades de africanas y 50 unidades de SalI e incubar durante 1 h a 37 ° C.
    2. Para los productos de la polimerización en cadena de vLλ, añadir 50 unidades de africanas y 50 unidades de XhoI e incubar durante 1 h a 37 ° C.
    3. Para productos PCR vLκ, añadir 50 unidades de africanas e incubar 1 h a 37 ° C. Purificar resúmenes utilizando membranas PCR 96 eluir con 60 μL de H2O. Digest eluido 60 μL en un volumen final de 100 μl de buffer de enzima de la restricción de BsiWI, añadir 50 unidades de BsiWI e Incube por 1 h a 55 ° C.
    4. Inactivar las enzimas por calentamiento a 80 ° C durante 15 minutos.
  2. Preparación de expresar vectores
    Nota: los productos PCR de vH son clonados en un vector de expresión (HCγ1) que contiene la cadena pesada constante Cγ1 de IgG1. vLκ productos de la PCR se clonan en un vector de expresión (LCκ) que contienen la cadena ligera constante Cκ. vLλ productos de la PCR se clonan en un vector de expresión (LCλ) que contienen la cadena ligera constante Cλ.
    1. Llevar a cabo la digestión siguiente:
      1. Mezclar 1 μg de expresión vector HCγ1 con 10 unidades de africanas y 10 unidades de enzimas de SalI en un volumen total de 20 μl de buffer de restricción recomendada por el fabricante e incubar durante 1 h a 37 ° C.
      2. Mezclar 1 μg de vector de la expresión LCκ con 10 unidades de enzimas de restricción de africanas en un volumen total de 20 μl de tampón de restricción recomendada por el fabricante e incubar durante 1 h a 37° C. Agregar 10 unidades de enzimas de restricción BsiWI e incubar 1 h a 55 ° C.
      3. Mezclar 1 μg de vector de la expresión LCλ con 10 unidades de africanas y 10 unidades de enzimas XhoI en un volumen total de 20 μl de tampón de restricción recomendada por el fabricante e incubar durante 1 h a 37 ° C
    2. Calentar cada mezcla de digestión a 65 ° C durante 10 minutos inactivar las enzimas de restricción.
    3. Realizar ligadura de 5 μl del producto PCR digerido con 2 μl (100 ng) del correspondiente vector de expresión lineal en un volumen total de 20 μl de 1 x buffer ligasa de ADN con 1 unidad de T4 ADN-ligasa por incubación durante la noche a 4 ° C.
      Nota: Como alternativa, la ligadura se realiza por 3 h a 4° C.
  3. Clonación
    1. Electroporate 1 μl de la mezcla de la ligadura de 20 μl en 45 μl de espectro casero TOP10 e. coli (protocolos actuales en Biología Molecular, sección 1.8.4-1.8.8). Inmediatamente agregar 500 μl de medio de YT X 2 e incubar en baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos bacterias propagación transformado en 2 x placas de ampicilina de YT. Incubar durante una noche a 37 ° C.
    2. Para cada transformación, pantalla de ocho colonias por PCR.
      1. Establecer una mezcla de reacción como sigue en el hielo: 45 μl de 5 x PCR Buffer, 12 μl de MgCl2 (25 mM), 4 μL de dNTPs (de una bolsa que contiene 10 mM de cada uno), 10 μl de avance cartilla (stock 10 μm) cruza por hibridación a la secuencia del vector (cartilla Ab-vec-sentido) y 10 μl del primer revés (stock 10 μm) dirigidos a la región constante de cadena pesada o ligera (véase Tabla de materiales para las secuencias de la cartilla). Componen a un volumen final de 200 μL con H2O. Luego añadir 4 μL de la enzima de ADN polimerasa (5 U/μL).
      2. Distribuir 25 μl de mezcla de reacción por tubo 8-tira del PCR en hielo.
      3. Utilice un palillo de dientes estéril para recoger las colonias individuales. Raya el palillo de dientes en un plato de ampicilina x TY 2 para constituir una placa replicar y luego introducirlo en un tubo de reacción de PCR.
      4. Realizar el examen PCR bajo las siguientes condiciones de ciclismo: 94 ° C por 10 min, seguido de 25 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 55 ° C y 50 s a 72 ° C.
      5. Identificar bacterias positivas por migración 5 μl de los productos PCR en gel de agarosa al 1.5%.
        Nota: Las colonias positivos dan un producto PCR alrededor 850 bp para el vector de cadena pesada y 600 bp para el vector de cadena ligera.
    3. Inocular cuatro colonias positivas de la placa de replicar en 2 mL de medio LB e incubar durante la noche a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
    4. Extracto de plásmidos de culturas líquidas usando un kit de purificación del plásmido, indicado por el fabricante.
    5. Verificar la correcta insercion de los dominios variables por Sanger secuenciación de la plásmidos con la cartilla de Ab-vec-sentido.
      Nota: Plásmidos con el inserto correcto (codificación de la HC y la LC correspondiente) deben ser cotransfected en 293A células de secreción. La especificidad de pequeña escala producido mAbs se evaluaron por ELISA. Luego, producción a gran escala se realiza en su caso.

6. producción de mAbs

  1. Producción en pequeña escala para el control de la especificidad
    1. El día antes de la transfección, riñón embrionario humano semilla 15.000 293A (HEK 293A) las células en 200 μL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS por pozo en placas de 96 pocillos. Incubar durante una noche en un incubador de CO2 (5% CO2) a 37 ° C.
    2. Cotransfect 293A células en medio DMEM con 10% FBS usando un derivado de polietilenimina lineal como reactivo de transfección.
      Nota: Realizar la transfección en triplicado. El siguiente protocolo es para un pozo de una placa de 96 pozos de fondo plano.
      1. Diluir 0,5 μl de reactivo de transfección de ADN en 10 μl de NaCl 150 mM. Diluir 0.125 μg de vH y 0.125 μg de vectores expresando vL en 10 μl de NaCl 150 mM. Vortex cada dilución 10 s.
      2. Añadir 10 μl diluir el reactivo de transfección de DNA en la solución de ADN 10 μl. Agitarlos durante 15 s e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Añadir la mezcla de 20 μl mediante goteo en células 293A y mezclar agitando suavemente la placa.
    3. Reemplazar el medio 16 h después de transfección y células en cultivo durante 5 días en medio libre de suero.
      Nota: Utilice el medio libre de suero para evitar suero Igs contaminando los anticuerpos producidos.
    4. Eliminar las células y desechos por centrifugación a 460 x g durante 5 minutos.
    5. Recoger sobrenadante por aspiración con una pipeta multicanal y transferirlas a una placa de 96 V-fondo-bien.
    6. Capa correspondiente Ag durante la noche a 4 ° C en 100 μl por pocillo de la capa de ELISA/biológico reconstituida tampón 1 x a una concentración final de 2 μg/mL en placas de ELISA de 96 pocillos. Ver ejemplos en 9.
    7. Bloque de pozos con medio DMEM FBS de 10% por 2 h a 37 ° C
    8. Añadir 50 μl de sobrenadante de células transfected 293A paso 6.1.5 e incubar por 2 h a TA.
    9. Añada 100 μl de un humano Ab IgG conjugado a la enzima peroxidasa (HRP) de rábano picante 1 μg/ml e incubar 1 h a temperatura ambiente. Añadir sustrato cromogénico de 50 μl (TMB) e incubar por 20 min.
    10. Leer la densidad óptica a 450 nm en un espectrofotómetro.
      Nota: Los mAbs específicos reveladas por ensayo ELISA se puede además producir en gran escala y purificado de proteína de una columna que presenta afinidad por la IgG humana.
  2. Producción a gran escala y purificación de mAbs específicos
    1. El día antes de la transfección, la riñón embrionario humano de semilla 6 x 106 293A (HEK 293A) células en frascos de2 175 cm que contiene 25 mL DMEM suplementado con 10% FBS. Incubar durante una noche en un incubador de CO2 (5% CO2) a 37 ° C.
      Nota: Las células deben ser 70% confluentes cuando transfected.
    2. Cotransfect 293A células en medio DMEM con 10% FBS usando un derivado de polietilenimina lineal como reactivo de transfección.
      1. Diluir 50 μl de reactivo de transfección de DNA en 450 μl de NaCl 150 mM. Diluir 10 μg de vH y 10 μg de vectores expresando vL en 500 μl de NaCl 150 mM. Vortex 10 s cada dilución.
      2. Añadir reactivo de transfección de DNA diluida a la solución de ADN. Agitarlos durante 15 s e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Añadir la mezcla de 1 mL mediante goteo a las células y mezclar agitando suavemente el frasco.
    3. Reemplazar el medio 16 h después de transfección y células en cultivo durante 5 días en medio libre de suero.
    4. Medio de cosecha por aspiración con una pipeta de 25 mL.
    5. Eliminar las células y desechos por centrifugación a 460 x g durante 5 minutos.
    6. Purificar los anticuerpos utilizando una columna de 1 mL con proteína A en un sistema de cromatografía líquida (FPLC) proteína rápido a 4 º C.
      1. Equilibrar la proteína una columna sepharose con 20 mM de tampón fosfato (pH 7).
      2. Filtrar el medio de cultivo celular de 6.2.5 usando un filtro 1.22 μm, luego un filtro de 0.45 μm.
      3. Cargue el medio de filtrado en la columna.
      4. Lavar con 20 mM de tampón fosfato (pH 7) y eluir con un tampón de citrato de 0,1 M (pH 3,5).
      5. Leer la densidad óptica a 280 nm en un espectrofotómetro de absorción y de inmediato neutralizar fracciones que contienen proteínas con 1 M Tris buffer (pH 9).
    7. Dializan Ab purificada durante la noche a 4 ° C en un cassette con un peso molecular de 3,5 K corte contra tampón PBS (pH 7.4).
    8. Esterilizar por 0.2 μm filtración y control de pureza por cromatografía por exclusión de tamaño, como indicado por el fabricante.

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Representative Results

A partir de PBMC procedentes de donantes sanos, presenta proyecto la generación de mAbs humana, que reconocen el péptido Pp65495 (Pp65, de citomegalovirus humano) presentado por la clase complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) molécula (HLA - A * 0201 HLA-A2). Estos mAbs pueden discriminar entre este complejo y complejos que representan otros péptidos cargados en el mismo MHC-I molécula.

PBMC fueron manchados con HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC y tetrámeros de HLA-A2/MelA2-BV421 como se describe en el protocolo anterior. Después de enriquecimiento de celular Inmunomagnética de células positivas de tetrámero PE y APC, las células eluídas se tiñeron con mAbs adicional. En el clasificador de células de citometría de flujo, magnético enriquecida de las células primero fueron gated en CD14 viableCD16CD3CD19+ camisetas (células B). La figura 1 muestra la estrategia bloquea utilizada para aislar las células B expresan BCR capaces de discriminar entre HLA-A2/Pp65 y otros relacionados con complejos péptido/HLA-A2. Selección de las células de B de interés fue realizada después que bloquean en HLA-A2/Pp65 PE+ y HLA-A2/Pp65 APC+ dobles positivos, para excluir el fluorocromo específico las células de B que solo fueron manchadas PE+ o APC+. Finalmente, las células B altamente específicas fueron identificadas por gating en células negativa HLA-A2/MelA2-BV421. Esto permite la identificación de las células B expresan BCR capaces de enlazar HLA-A2/Pp65, en un péptido y HLA-A2-dependiente de la forma, discriminar entre estas células B y las que se dirigen contra β2 microglobulina, biotina, HLA-A2 o aquellos que no discriminan entre los péptidos en la ranura de unión de MHC. Estas últimas células serán las células positivas BV421. Como anteriormente y más documentado con otros tipos de Ag, esta estrategia de exclusión es más importante debido a los aumentos en la capacidad discriminativa de las células B para el Ag9.

Una vez que las células B específicas fueron ordenadas, cDNAs codificando para pesado y ligero cadenas Ig fueron amplificados por RT-PCR. Pares de cadena pesada y ligera de codificación de segmentos obtenidos en aproximadamente el 50% de células B individuales probados (tabla 1). Dominio variable secuencias entonces se clonaron en expresión vectores que contienen secuencias de dominio constante correspondiente (pesada constante 1 y luz constante κ o λ). Células de riñón embrionario humano (HEK, 293A células) fueron cotransfected con vectores de cadena pesada y ligera. Los mAbs secretadas de isotipo IgG1 fueron cosechadas de los sobrenadantes de cultivo de células 293A 5 días después de la transfección (ver figura 3 para la estrategia global de producción de mAbs plenamente humana). Esto produjo con éxito un anticuerpo específico de HLA-A2/Pp65 a partir de 3 células de linfocitos B solo cediendo pares de cadena pesada y ligera de codificación de segmentos (tabla 1). Ensayos de ELISA demostraron claramente que este mAb fue ambos MHC-péptido-dependientes y para su unión a complejos HLA-A2/Pp65 (Figura 4A), y varios miligramos de mAb fácilmente fueron producidos para su posterior análisis (p. ej., análisis de afinidad, Análisis funcionales). Su afinidad de Unión, determinada por resonancia de plasmón superficial (SPR), era aproximadamente 7 x 10-6 M (Figura 4B).

Así, este artículo describe una combinación de métodos sensibles y eficientes, permitiendo i) detección de células B Ag específica relevantes, incluso cuando se presentan en frecuencias muy bajas en la sangre de donantes sanos y ii) la generación de mAbs humano altamente discriminativo.

Figure 1
Figura 1: Detección de células B específicas de HLA-A2/Pp65 de PBMC humano.
3 x 108 PBMC fueron manchados con HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC y tetrámeros de HLA-A2/MelA2-BV421. Después de enriquecimiento de celular Inmunomagnética de células positivas de tetrámero PE y APC, las células eluídas se tiñeron con mAbs adicional. En un clasificador de células de citometría de flujo, las células fueron gated primero en camiseta viable CD14CD16 linfocitos (no se muestra), luego en CD19+CD3 células. Luego, las células de B con HLA-A2/Pp65-PE y HLA-A2/Pp65-APC tetrámeros fueron cerradas. El tetrámero de HLA-A2/MelA-BV421 se utilizó para excluir las células de B que no reconocen el HLA-A2/Pp65, en un péptido y una forma dependiente de MHC.

Figure 2
Figura 2: estrategia para la amplificación y clonación de genes de Ig. Cadena ligera y pesada Ig-genes codificación fueron amplificados por RT-PCR anidada. Primera PCRs se realizaron con una mezcla de iniciadores hacia adelantados cruzando por hibridación la región líder y reversas cartillas específicas para las regiones constantes de kappa pesado, luz adecuada, o cadenas ligeras lambda. Segundo PCRs se realizaron con las cartillas que contienen sitios de restricción, adelante y atrás fueron respectivamente específicos para el inicio de los segmentos V y para el final de los segmentos J. Productos de PCR fueron secuenciados, digerido con enzimas de restricción y clonados en vectores de expresión que contiene dominios constantes apropiados. CMV: promotor de citomegalovirus; AmpR: gen de resistencia para ampicilina.

Figure 3
Figura 3: Estrategia general de reconstrucción de mAbs humana recombinante.
Una estrategia de clasificación tetrámero permite la detección de células B de interés. Células B altamente específicas eran unicelulares ordenados. Cadena ligera y pesada Ig-segmentos de codificación fueron amplificados mediante RT-PCR. Secuencias de dominio variable se clonaron en vectores de expresión eucariota separado en marco con segmentos génicos que codifican las regiones constantes de livianos y pesadas. Los mAbs plenamente humanas correspondientes fueron expresadas por transitorio transfected las células HEK 293A y purificados del sobrenadante de cultura. Esta figura fue modificada de Ouisse et al. (2017) 9.

Figure 4

Figura 4: Caracterización de un representante altamente discriminativo mAb contra HLA-A2/Pp65 generados a partir de sangre periférica células B circulantes.
A) especificidad de mAb PC1.02 contra HLA-A2/Pp65 probado por ELISA. Placas fueron recubiertas con relevantes (HLA-A2/Pp65) o irrelevantes complejos HLA-A2 que contiene péptidos restringidos por HLA-A2: MelA, NS3 (VHC-1) y GagP17 (VIH-1) en 2 μg/mL, el mAb PC1.02 fue agregado y un anti-humano IgG-HRP Ab fue utilizado para la detección. Densidades ópticas (OD) se leen a 450 nm. B) determinación de la afinidad del mAb PC1.02 usando resonancia de plasmones de superficie (SPR) por fluir a diferentes concentraciones de los complejos HLA-A2/Pp65 sobre CM5 chip-limite mAb. Esta figura fue modificada de Ouisse et al. (2017) 9.

Número de PBMC Número de células PE + APC + después de enriquecimiento Número de células (BV421 +) excluidas Número de células ordenadas Número de pozos analizados Número de pozos con HC y LC asociada (% recuperación) Número de mAbs producido Número de mAbs específicos
HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) 3 x 108 818 117 161 7 3 (43%) 3 1

Tabla 1: Análisis de las células B específicas HLA-A2/Pp65.
El impacto de la estrategia de exclusión inespecíficas de células de B, el rendimiento de la amplificación del gen de Ig y mAb producción de células B específicas de HLA-A2/Pp65 aisladas fueron medidos/evaluados.

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Discussion

El protocolo propuesto es un método eficaz para la generación de mAbs humana directamente de las células B Ag específicos circulantes en la sangre. Combina tres aspectos importantes: (i) el uso de un enriquecimiento magnético asociado de tetrámero, que permite un aislamiento ex vivo incluso raras Unión Ag de células de B; (ii) una estrategia bloquea que utiliza tres tetrámeros Ag (dos relevantes y uno irrelevante) etiquetados con tres fluorocromos diferentes para aislar, mediante citometría de flujo, sólo las células B expresan BCR específico para el Ag deseado; (iii) la reconstrucción de los cDNAs correspondientes de mAb recombinante por RT-PCR en el nivel unicelular y la expresión de los cDNAs en células humanas.

Estudios previos propusieron utilizando uno o dos fluorescentes antígenos relevantes para identificar las células B humanas antes de la clasificación y posterior producción de mAbs del aislado B células6,7,8. Un análisis en pacientes con artritis reumatoide y uno en un modelo de ratón autoinmune, han asociado un antígeno fluorescente irrelevante para caracterizar las células de B autoreactive y determinar su frecuencia de10,11. Lo que sabemos, el uso de una combinación de dos tetrámeros de antígeno relevante fluorescente y un tetrámero de antígeno irrelevantes no se ha descrito previamente para el enriquecimiento de células B específicas antes de su uso para la producción de mAbs plenamente humana. Este método optimizado permite plenamente humana mAbs discriminativo que se obtendrá en tan solo un mes y se puede realizar con éxito incluso cuando a partir de un repertorio de células B Naive. Así, no tiene ninguno de los principales inconvenientes de la exhibición phage, inmortalización de células B humanas, u otro descrito previamente procedimientos de reconstrucción de mAb basadas en biología molecular.

Esta célula clasificación estrategia resulta en una recuperación de alto rendimiento del Ag específico mAbs humana. Pares de segmentos de la cadena pesada y ligera de las células B aisladas se amplifican con una tasa de éxito de alrededor del 50%. Casi siempre se amplifican segmentos de cadena ligera, pero esto no es el caso de segmentos de la cadena pesada. Eficiencia RT-PCR depende en gran medida en el respeto de los siguientes puntos: i) células B ordenadas deben ser congeladas lo antes posible; II) agregar 30 unidades de inhibidor de la Rnasa y minimizar el tiempo entre tomar las células de B del congelador y el lanzamiento de la reacción de RT; III) descongelar todas las cartillas sobre hielo; IV) nunca congelación/descongelación cartillas más de tres veces; v) cartillas para un máximo de un año de siembra.

En cuanto a la eficacia de la producción de los mAbs recombinante correspondiente con la especificidad deseada, es aproximadamente 30-40% de la caja para pMHC mAbs específicos. Estos mAbs particular hay que reconocer el péptido y la molécula MHC, que es bastante exigente, y previamente hemos demostrado que el rendimiento global de recuperación de mAbs específicos dirigidos contra antígenos más convencionales es superior, hasta al 100% para el Β-galactosidasa antígeno9. Debe destacarse que la elección de un apropiado Ag para el tetrámero irrelevante es importante aumentar la especificidad de los mAbs producido.

La afinidad de la mAb anti-HLA-A2/Pp65 (PC1.02) descrito en el presente artículo es relativamente baja, 7 x 10-6 M, similar a la afinidad de un TCR. Este resultado era esperado, como aislamiento de células B se realizó de los donantes de ingenuo. Mayoría de las células de B de tetrámero+ fueron IgM+IgG-, que reduce la probabilidad de obtener buena Ag-carpetas. Sin embargo, este método puede también hacer posible la clasificación de memoria cruz-reactivo B células contra un Ag deseado de donantes de ingenuo, por pasado inmunológica de personas12. Además, este método es fácilmente aplicable a pacientes infectados o vacunados o inmunizados animales humanizados, como se describe en 9, donde en vivo maduración de la afinidad puede aumentar la afinidad de mAbs resultante a cerca de 1 x 10-9 M. varios también han descrito los procedimientos para mejorar la afinidad de mAbs en vitro, en particular a través de reproducción hipermutación somática en células que expresan el anticuerpo (revisado en 13).

En conclusión, proponemos una estrategia versátil para la producción de mAbs altamente discriminativo que puede utilizarse en varios tipos de situación, de un ingenuo individual a un donante vacunado o un paciente que sufre de una enfermedad autoinmune. MAbs plenamente humana generada de esta manera contra un epítopo deseado podría ser útil tanto para la investigación básica y la inmunoterapia.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos el servicio de citometría "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) asistencia técnica experta. Agradecemos también todo el personal de producción de proteína recombinante (P2R) y de plataformas de impacto (INSERM 1232 Santé SFR, Biogenouest, Nantes) por su apoyo técnico. Agradecemos Emmanuel Scotet y Richard Breathnach comentarios constructivos sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado financieramente por el proyecto IHU-Cesti financiado por el programa de gobierno francés «Investissements Avenir», administrado por la Agencia de investigación nacional de francés (ANR) (ANR-10-IBHU-005). El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Métropole y Région Pays de la Loire. Este trabajo fue realizado en el contexto del programa IGO LabEX apoyado por la Agencia Nacional de investigación a través de la inversión del futuro programa ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC
Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

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References

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Inmunología número 132 Inmunología biología celular anticuerpos humanos células B tetrámero citometría de flujo unicelular enriquecimiento específico de antígeno magnético

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

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Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre
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Devilder, M. C., Moyon, M.,More

Devilder, M. C., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

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