Summary
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.
Abstract
Het doel van deze procedure was om te oogsten van de #4 abdominale borstklieren van vrouwelijke nullipaar muizen teneinde ECM expressie en ductaal architectuur. Hier is een klein zakje onder de huid gemaakt met behulp van Mayo schaar, waarmee een scheiding van de klieren in het onderhuidse weefsel van de onderliggende buikvlies. Visualisatie van de klieren was geholpen door het gebruik van 3.5 x-R chirurgische micro loupes. De pelt werd omgekeerd en gespeld terug waardoor identificatie van de intact borstklier vet pads. Elk van de #4 abdominale klieren was ronduit ontleed door te schuiven van het scalpel blad lateraal tussen de subcutane laag en de klieren. Onmiddellijk na de oogst, de klieren werden geplaatst in 10% neutraal gebufferde formaline voor latere bewerking. Excisie van de hele klier is voordelig omdat het voornamelijk het risico elimineert uit te sluiten van belangrijke weefsel bestrijkende interacties tussen ductaal epitheliale cellen en andere microenvironmental cellulaire populaties die kunnen worden gemist in een gedeeltelijke biopsie. Een nadeel van de methode is het gebruik van seriële secties uit vaste weefsels die analyses van ductaal genuitdrukking en eiwit expressie naar een discrete locatie in de klier beperkt. Wijzigingen in ductaal architectuur en eiwit expressie in 3 dimensies (3D) is als zodanig niet makkelijk verkrijgbare. De techniek is over het algemeen van toepassing op studies vereisen geheel intact lymfkliertest borstklieren voor downstream onderzoeken zoals ontwikkelingsstoornissen ductaal morfogenese of borst kanker.
Introduction
Borstkanker wordt gekenmerkt door een aanzienlijke mate van weefsel fibrose1,2,3,4. Hierna de ECM, deze niet-cellulair entiteit wordt gevonden in wisselend in alle weefsels en bestaat voornamelijk uit een complexe Zitschalen van fibrillar en niet-fibrillar collagens, elastine en glycoproteïnen naast verschillende signalering moleculen die zijn afgezonderd in deze matrix. Homeostatische omstandigheden, is de afzetting en de aantasting van de ECM streng gecontroleerd. 5 tijdens borst tumorvorming, het evenwicht van ECM afzetting en afbraak wordt verstoord. Tumoren van de borst zijn als zodanig gemeld uitspreken overvloedige ECM eiwitten zoals collagens, fibronectin en tenascin-C o.a.. 6 de abnormale uitdrukking van deze proteïnen naast verhoogde patronen van matrix crosslinking is gedocumenteerd ter bevordering van de borst tumor progressie, metastase en therapie resistentie1,3, 4,7,8,9.
Om te beoordelen ECM samenstelling en ductaal morfologie, werd isolatie van intact borstklieren uitgevoerd. Hier hebben we vrouwelijke nullipaar muizen gebrekkig gebruikt voor caveolin-1, een integraal membraan eiwit die is gekoppeld aan een agressieve borstkanker tumor handtekening10,11,12, en controle over vrouwelijke nullipaar B6 muizen. Histologische verwerking en kleuring van deze weefsels toegestaan de identificatie van verschillende ECM eiwitten samen met de karakterisering van ductaal morfologie.
Over het geheel genomen geeft het isolement van geheel, intact borstklieren onderzoekers de mogelijkheid te onderzoeken weefsel bestrijkende morfologische of cellulaire veranderingen naar aanleiding van exogene of endogene factoren. Nadelen van de techniek worden geassocieerd met analyses van 2 dimensie (2D) weefselsecties in tegenstelling tot een 3D perspectief, die een vollediger beeld van de complexe morfologie van de ductaal boom zou opleveren. Gezien de complexiteit van cel-cel en cel-ECM interacties die in de melkklier plaatsvinden, is het isolement van de klieren van het geheel, intact gunstig voor het efficiënt analyseren ductaal morfologie en eiwit expressie in verschillende regio's van de borstklier RattenUitrustingen klier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen in dit protocol werden herzien en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité van de Philadelphia College of Osteopatisch Medicine en alle technieken werden uitgevoerd onder strikte ethische richtsnoeren.
1. steekproef aanbestedingen en verwerking
- Selecteer passende dierlijke onderwerp en plaats een CO 2 zaal. Gebruik voor dit experiment, 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar B6. CG-Cav1tmMIs/J en C57BI/6J.
- Inschakelen gasstroom tot 30-40%. Zodra het dier zichtbaar bewusteloos is na ongeveer 2 minuten, open de gas klep aan de volledige druk voor een extra 5 min.
Opmerking: Bevestigen dier dood door het observeren van de zichtbare tekenen van de ademhaling (bv. de beweging van de borstkas) voor een periode van 10 minuten na beëindiging van de CO 2 levering. Als het dier nog leeft, kan het terug in de CO 2-kamer worden geplaatst. Cervicale dislocatie kan ook gebruikt worden, hoewel dit niet raadzaam is als bloed kan ophopen rond de borstklieren bemoeien met de dissectie en resultaten. - Na offer, pin karkas in een liggende positie en verzadigen met 70% ethanol.
- Knijpen de pelt net boven het schaambeen met pincet en nick met een kleine chirurgische schaar. De schaar, roterende gesneden de pelt langs de ventral midline verplaatsen caudal craniale.
- Met grotere schaar of een hemostat, bot ontleden de subcutane fascia bilateraal, met voorzichtigheid niet aanprikken van het buikvlies. U snijdt langs de horizontale marges aan beide distale uiteinden van de incisie.
- Pin de pelt kleppen open en spuit weer met 70% ethanol.
Opmerking: Hoewel het gebruik van 70% ethanol toegestaan beter visueel onderscheid tussen de klier en de omringende subcutane weefsel, voorzichtig om te voorkomen dat het drogen van het weefsel als gevolg van gebruik van deze oplossing. Om te voorkomen drogen, verwijdert u de klier in een time frame niet meer bedragen dan 4 min. Als alternatief voor 70% ethanol, de onderzoeker kan ook vervangen door een algemene isoleren buffer, zoals 1 x PBS, om te voorkomen dat weefsel opdroging. - Zoeken de borstklieren van belang, schuif een #4 scalpel mes langs de binnenkant van de kleppen van pelt, snijden de melkklier en bijbehorende cutane adipeus vrij van de dermis.
Opmerking: 3.5 x chirurgische micro loupes kan steun bij gemakkelijker visualisatie van de klieren. - Direct dompelen nieuw geïsoleerd klier in conische buis met 10:1 oplossing-weefsel volume van 10% neutraal gebufferde formaline voor 24-48 h.
Opmerking: Afhankelijk van de opzet van de studie, veel alternatieve fixatives kunnen worden gebruikt zoals paraformaldehyde, ethanol voor genomic studies en verkrijgbare RNA behoud van buffers. - Volg institutionele protocollen voor het insluiten van paraffine, dienen de monsters naar een leverancier voor verwerking, insluiten, en snijden/dia montage. Afdeling weefsels op 5 µm.
Opmerking: Als gevolg van overtollige obesitas omliggende klier, kunt u overwegen verwijderen 100-200 µm van weefsel voor segmenteren en kleuring.
2. Weefsel Staining
- Immunohistochemistry
- plaats dia's te worden gekleurd op warmte blok vastgesteldop 58 ˚C voor 1 h te smelten paraffine.
Let op: Smelten van paraffine dia kan wegvloeien. In de gaten of plaats van vegen onder de dia te vangen afvoer wax.
Opmerking: Deze stap is niet essentieel en kan worden overgeslagen. Als de resultaten zijn niet zoals verwacht, het toevoegen van deze stap terug resultaten kan verbeteren. - Incubate dia's in een dia jar met 100% xyleen voor 30 min zorgen voor volledige onderdompeling. Eenmaal herhaald.
Opmerking: op dit punt, visuele inspectie moet worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat weefselsecties vrij van vetweefsel en paraffine zijn. Als extra adipeus weefsel of wax blijkt, moet de dia opnieuw worden ondergedompeld in xyleen. Wees voorzichtig om te minimaliseren van toegevoegde blootstelling aan xyleen, omdat dit leiden inkrimping van het weefsel tot kan. - Hydrateren weefsels in een pot van de dia met 100% ethanol voor 10 min. eenmaal herhaald.
- Zet dia's aan een dia jar met 95% ethanol voor 10 min. eenmaal herhaald.
- Dia's aan een dia pot met 75% ethanol voor 5 min. verplaatsen
- Dia's aan een dia pot met 50% ethanol voor 5 min. verplaatsen
- 10 mM Natriumcitraat oplossing (pH 6.0) in een hete plaat of een magnetron koken en giet in Coplin jar.
Let op: Zorgvuldig oplossing terwijl verwarming controleren en verzorgen om te voorkomen dat kook. Container zullen erg warm. Bescherming te gebruiken om te voorkomen dat brandwonden. - Langzaam plaats dia's Coplin jar, zorgen voor volledige onderdompeling, en Incubeer bij 100 ° C gedurende 10 minuten ophalen epitopes. Verwijderen en zorgvuldig droog dia.
- Tekent een barrière rond weefsel met een hydrofobe marker. Voeg genoeg endogene enzym blocker (waterstofperoxide en natriumazide, beschikbaar commercieel) te dekken weefsel en incubeer gedurende 10 min.
- Submerge dia's in 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 10 minuten
- Toevoegen genoeg serum 10% ezel in 1 x PBS te dekken weefsel en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
Opmerking: Het experiment kan hier onderbroken worden door de dia's op te slaan in de bevochtigde zaal bij 4 ° C's nachts. Terwijl donkey serum bleek optimale kleuring resultaten oplevert, kan de onderzoeker wil verschillende testsera zoals bovien serumalbumine (BSA), geit serum of paard serum om optimale resultaten. Als BSA, de onderzoeker deze vers vóór gebruik moet bereiden. - Overtollige blocker uit dia's decanteren en behoorlijk verdunde primair antilichaam in 1% serum rechtstreeks toevoegen aan dia's ervoor te zorgen dat het weefsel in de oplossing gelijkmatig bedekt is. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
Opmerking: Deze stap kan worden voortgezet voor langere tijdsduur met vochtige kamer bewaard bij 4 ° C. Zorg ervoor op te nemen van de juiste negatieve controle dia's (bijvoorbeeld een dia met geen primair antilichaam, bekend antigeen-negatieve weefsel, etc.) bij deze stap. - Zorgvuldig wassen van dia's door stroomt ongeveer 1 mL diH 2 O over weefsel en incubeer in 1 verandering van 1 x PBS voor 5 min.
- Overtollige PBS decanteren en genoeg horseradish peroxidase label weefsel en incubeer gedurende 30 min. in een bevochtigde kamer toevoegen.
Opmerking: Bij deze stap, de onderzoeker kan wil overgaan tot fluorescerende vlekken met behulp van fluorescently geconjugeerd secundaire antilichamen. Indien dit is gewenst, de volgende stappen moeten dienovereenkomstig worden gewijzigd. - Zorgvuldig wassen van dia's door stroomt ongeveer 1 mL diH 2 O over weefsel en incubeer in 1 verandering van 1 x PBS voor 5 min.
- Maken diaminobenzidine (DAB) plus chromogeen oplossing volgens de voorgestelde verhouding van fabrikant en meng door vortex.
Opmerking: Veel kant en klare kits zijn commercieel beschikbaar afgezien van degene die in dit protocol worden gebruikt. - Decant overmaat buffer van dia's en voeg 2-3 druppels (10-50 µL) chromogeen vlek direct naar weefsels en Incubeer gedurende 5 min. in vochtige kamer. Dia's door vloeiende ongeveer 1 mL diH 2 O grondig te wassen over weefsel.
Let op: DAB-chromogeen is zeer giftig. Vermijd direct contact van de vlek met huid en verzamelen stroom uit in gevaarlijke afvalstoffen.
- plaats dia's te worden gekleurd op warmte blok vastgesteldop 58 ˚C voor 1 h te smelten paraffine.
- Haematoxyline en eosine (H & E)
- laatste spoeling na chromogeen incubatie, dia's in Harris Haematoxyline voor 2-2,5 min. spoelen dia voorzichtig onder leidingwater voor 1-2 min. onderdompelen
Opmerking: zorgen om rechtstreekse waterstraal op weefsels. - Submerge dia's voor 2-3 s in differentiatie oplossing (0,25 mL zoutzuur in 100 mL 70% ethanol). Spoel van dia's voorzichtig onder de kraan water voor ongeveer 1-2 min.
- Onderdompelen van dia's in blauwe agent (4.5 mg calciumcarbonaat in 100 mL leidingwater, pH aangepast aan 9.4) voor 60 s. Rinse dia's in 95% ethanol voor 30 s.
- Submerge dia's in alcoholische eosine Y gedurende 2-3 minuten
- Weefsel in 2 wijzigingen van 95% ethanol voor 1 min elke uitdrogen.
- Weefsel van de Dehydrate in 1 wijzigen van 100% ethanol voor 1 min.
- Zorgvuldig droog dia's met een pluisvrij doekje. Toepassing 1 druppel (ongeveer 100-200 µL) van kunststof, niet-waterige, hars gebaseerde montage media naar dia en breng dekglaasje aan.
Opmerking: Indien een verschillende kleuringstechniek werd verkozen, een montage van verschillende media kan worden verlangd. Bijvoorbeeld, als de onderzoeker koos een TL-geconjugeerde secundair antilichaam, een waterige mount zou idealere. - Toestaan van dia's instellen 's nachts bij kamertemperatuur.
- laatste spoeling na chromogeen incubatie, dia's in Harris Haematoxyline voor 2-2,5 min. spoelen dia voorzichtig onder leidingwater voor 1-2 min. onderdompelen
- Picrosirius rood (PSR) Staining
- Selecteer dia's die moeten worden gekleurd en volgen van immunohistochemistry protocol via stap 6 (50% ethanol soak).
- Submerge dia's in PSR vlek voor 1 h.
- Onderdompelen van dia's in 0,5% azijnzuur voor 1-2 s, tweemaal om te onderscheiden van vlek.
- Weefsels in 2 wijzigingen van 95% ethanol voor 1 min elke uitdrogen.
- Weefsels van de Dehydrate in 1 wijzigen van 100% ethanol voor 1 min.
- Schakelt u dia's door kort opgedeeld in 100% xyleen voor over 3-4 s.
- Zorgvuldig droog dia's met een pluisvrij doekje. Toepassing 1 druppel (ongeveer 100-200 µL) van kunststof, niet-waterige, hars gebaseerde montage media naar dia en breng dekglaasje aan.
3. Proef de analyse
- Ductaal analyse
- Selecteer dia's gekleurd voor α-SMA. Met behulp van een lichte Microscoop uitgerust met een camera gemonteerd doelstelling, het verzamelen van representatieve beelden met 20 X vergroting.
- Using ImageJ (NIH), onderscheiden en tellen van leidingen in elk beeld. Dit kunnen handmatig worden geïnventariseerd of een een numerieke score kan toewijzen aan individuele leidingen. Toewijzen van een numerieke score, ImageJ openen en selecteer Plugins. Selecteer vervolgens analyseren en cel item te kiezen uit het drop down menu. Klik op Initialize en markeer Type 1 om te beginnen met het labelen van leidingen. Wanneer u klaar bent, selecteer resultaten weergeven van de ductaal graaf.
Nota: zorg om te controleren of structuren zijn Ductaal en niet vasculaire. - In ' meting instellen ' opties, Controleer ' omtrek ' en ' gebied ".
- Met het freehand vormgereedschap, tekent u een lijn rond elke buis op het myoepithelial compartiment (zichtbaarheid geholpen door α-SMA vlek). Selecteer ' maatregel ' en neem de omtrek en oppervlakte.
- Opnieuw met behulp van het freehand vormgereedschap, teken een lijn langs de apicale zijde van de ductaal epitheel binnen het interieur van de lumen. Selecteer ' maatregel ' en neem de omtrek en oppervlakte.
- Aftrekken de omtrek van de luminal afdeling van de omtrek van het compartiment van de myoepithelial met het oog op de omtrek van de ductaal epitheel. Aftrekken van het gebied van de luminal afdeling van het gebied van het compartiment van de myoepithelial te verkrijgen op het gebied van het ductaal epithelium.
- Immunohistochemistry analyse
- helderveld afbeeldingen uploaden naar een analytische software, zoals ImageJ of FIJI Suite.
Opmerking: Dit protocol beschrijft de stappen voor de kleuring van de analyse met behulp van ImageJ en de plugin IHC Toolbox. - Open IHC werkset in het menu Plugin. In de " Selecteer Model " keuzelijst met invoervak dat opent, selecteert u de juiste vlek (d.w.z. H-DAB, PSR, enz.). Selecteer de " kleur " optie te isoleren van de vlek. Hiermee opent u een resultaatvenster.
Opmerking: Deze methode is geschikt als een proteïne van belang in de extracellulaire of cytosolische ruimten ligt, of afhankelijk is van het plasma-membraan. Als de proteïne van belang nucleaire is, selecteren " kernen " wordt gevraagd de plugin voor het analyseren van de afbeelding voor positief gebeitst kernen. - Gebruiken de kleur Chooser Slide om te zorgen voor goede isolatie van de vlek zonder achtergrond opgenomen in of uitgesloten van de buitensporige vlek.
Opmerking: Als de automatische modus niet kan detecteren van de vlek of niet leidt een aanvaardbare afbeeldingen tot, teken een vierkant regio van belang (ROI) over een geïdentificeerde gekleurd regio. Selecteer op het IHC Toolbox venster, " trein " direct van de plugin om de juiste doelgroep. - De afbeelding omzetten in 16-bits. Ga naar Image → Type → 16bits.
- Drempel de afbeelding. Ga naar Image → aanpassen → Auto drempel.
- Stel de schaal van de meting van het beeld door een streep ROI direct boven de bar van de schaal in de afbeelding vervolgens de lengte toe te wijzen. Om de schaal lat, ga naar analyseren → schaal instellen. Ingang van het aantal pixels per de gewenste eenheid van lengte (bijvoorbeeld 120 pixels per 50 µm).
- Meten van de resulterende gebied en grijze waarde betekenen. Ga naar analyseren → Set metingen en het verzamelen van de meting door te klikken op analyseren → maatregel.
- helderveld afbeeldingen uploaden naar een analytische software, zoals ImageJ of FIJI Suite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vrouwelijke muizen hebben 5 paar melkklieren. Er is met name één paar van cervicale klieren (#1), twee paren van thoracale klieren (#2 en #3), één paar abdominale klieren (#4), en 1 paar inguïnale klieren (#5)(Figuur 1). Hier, we geïsoleerd van de #4 klieren zoals ze duidelijk herkenbaar zijn. In sommige gevallen werden zowel #4 en #5 klieren geïsoleerd samen zoals het onderscheid tussen de twee was moeilijk. Om te isoleren intact #4 abdominale borstklieren, de pelt was vastgemaakt en zorgvuldig gescheiden van het onderliggende buikvlies, onthullen de locatie van de klieren van de #4 aangegeven met een pijl (Figuur 1B). De #4 klieren waren zorgvuldig weggesneden en geïnspecteerd op de aanwezigheid van eventuele resterende subcutane of spier weefsel. Hoewel deze waren niet herkenbaar in onze geïsoleerde klieren (Figuur 1C), we aanzienlijk meer Onderhuids weefsel in fibronectine gebeitste klieren van weefsel blokken waarin weefsel was niet verwijderd vóór afdelen opmerking (bv oppervlakkige) (Figuur 1D) versus klieren in welke 100-200 µm van weefsel van het weefsel blok had verwijderd voorafgaand aan de vectorafbeeldingsbestanden (bijvoorbeeld diepe) (Figuur 1E). Om te krijgen een beter begrip van weefsel fibrose in de melkklier in reactie op de exogene of endogene factoren, kan de onderzoeker wilt vergelijken fibrose in oppervlakkige versus diepe bezuinigingen van de klier. Voor andere analyses, kan het nuttig zijn voor de onderzoeker deel van het weefsel blok doormidden, voordat wij overgaan tot het snijden van weefsel en indien ingrijpende subcutane vlekken en/of spierweefsel aanwezig na klier dissectie is.
Na isolatie, klieren waren vastgesteld in 10% neutraal gebufferde formaline, verwerkt en gesegmenteerd voor kleuring. De stappen die zijn gebruikt voor het analyseren van collageen expressie naast andere proteïnen van belang zijn afgebeeld in figuur 2A. Representatieve monsters van de ECM eiwitten collageen, fibronectine en tenascin-C zijn afgebeeld in Figuur 2B. Pijlen in elk van de beelden tonen de aanwezigheid van leidingen in deze weefsels (Figuur 2B).
Om te kwantificeren morfologische kenmerken van leidingen, is het belangrijk voor de behandeling van de histologische secties met zorg, zoals ongepaste behandeling leiden tot kan beschadigde weefsels en leidingen die niet meetbaar zijn. Voorbeelden van ongepaste behandeling kunnen buffers of water rechtstreeks op de weefsels, met behulp van buffers op een onjuiste temperatuur of verlaten van weefselmonsters in harde buffers zoals Natriumcitraat en azijnzuur: voor een langere periode dan vermeld in het protocol worden uitgevoerd. Een voorbeeld van een weefselsectie in welk weefsel schade is opgetreden is weergegeven in Figuur 3A. Hier, kan grote schade aan het weefsel gemakkelijk worden waargenomen als breuk punten in de buisjes (Figuur 3A). Een sectie zoals dit kan niet worden gebruikt voor analyses van ductaal structuren. Een voorbeeld van een exemplaar van de onbeschadigde weefsel waar de leidingen meetbaar en kwantificeerbaar zijn is weergegeven in Figuur 3B. Hier, de leidingen zijn niet alleen door de omliggende fibronectine gebeitste stroma gekenmerkt, maar worden ook gekenmerkt door de aanwezigheid van een dichte bevolking van epitheliale cellen voering van het lumen van de leidingen (Figuur 3B). Het is belangrijk op te merken dat tijdens de ontwikkeling, de melkklier muis een enkele buis bij de geboorte van welke laterale secundaire takken stronk bevat, vormen een ingewikkelder ductaal boom die een reeks vertakking en regressie met elke oestrische cyclus ondergaat 13. Hoewel we hebben geen rekening gehouden met de oestrische cyclus van de dieren in deze experimenten, de onderzoeker kan willen doen om informatie op ductaal nummers onafhankelijk van de oestrische cyclus te verkrijgen. De onderzoeker is verwezen naar een protocol Caligioni14 , waarin de fase van de oestrische cyclus zichtbaar kan worden bepaald. Met betrekking tot het kwantificeren van leidingen, de aanwezigheid van meerdere ductaal structuren in deze histologische secties is niet indicatief van meerdere unieke leidingen, maar is eerder kenmerkend voor een meer ontwikkelde ductaal boom ten gevolge van ductaal uitgroei. Om te inventariseren leidingen, kan men gebruik maken van een afbeelding analysesoftware zoals ImageJ (NIH) een nummer toewijzen aan individuele leidingen in een weefselsectie. De onderzoeker willen misschien kabelgoten opsommen aangezien wijzigingen in ductaal nummers, die indicatief zijn voor ontwikkelingsstoornissen afwijkingen of een pathologische aandoening. Met betrekking tot onze studie, we geloven het toegenomen aantal leidingen, een resultaat van ductaal uitgroei, is in verband met het verlies van caveolin-1, die de afwijkende expressie van groeifactoren zoals insuline groeifactor 1 (IGF-1), een bekende bemiddelaar van muis ductaal kan rijden groei 15.
Naast de aanwezigheid van intact leidingen bevatten verschillende leidingen takken, aangegeven door de pijlen in een sectie van fibronectine gebeitste (Figuur 3C). Met het oog op deze analyse, moeten deze ductaal takken niet worden beschouwd als een aparte ductaal structuur. Hoewel evalueren en meten van leidingen, is het belangrijk om te onderscheiden van de leidingen van vasculaire structuren. Vasculaire structuren kunnen niet alleen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van een endothelial enkelgelaagde voering de lumen, maar ook door de aanwezigheid van a-nucleaire, eosinofiele structuren indicatief van rode bloedcellen (RBC) binnen de lumen (Figuur 3D). Hoewel de aanwezigheid van eosinofiele structuren binnen lumen RBC geeft en therapieën suggereert, is de verplaatsing van RBC tijdens klier collectie in weefselsecties mogelijk. Het is raadzaam om vasculaire structuren met behulp van het endotheel marker CD31 bevestigen. Een voorbeeld van een histologische sectie gekleurd met CD31 is weergegeven (Figuur 3D). Om te kwantificeren ductaal omtrek en oppervlakte, kunnen vectoren in ImageJ (NIH) worden toegewezen aan de myoepithelial grens (omtrek) en de luminal grens in α-SMA-gekleurd weefselsectie schetsen. Α-SMA, een marker van zachte spiercellen, werd gebruikt als het de myoepithelial cellen die lijn leidingen vlekken. In de afbeelding komt te staan, geeft de rode lijn de myoepithelial grens terwijl de blauwe lijn de luminal grens (Figuur 3E toont). Het gebied tussen de stromale en luminal afdelingen, getoond in het schema, is het gebied bezet door de totale stromale weefsel plus de ductaal epitheliale cellen (Figuur 3E).
Figuur 1 : Isolatie van geheel, intact borstklieren voor histologisch analyses. (A) na dierlijke offer, de pelt werd zorgvuldig verwijderd en vastgemaakt terug om de borstklieren gelegen tussen de dermis en buikvlies bloot te stellen. Het schema toont de relatieve posities van de cervicale (#1), thoracale (#'s 2 en 3), abdominale (#4) en Lies (#5) klieren. (B) de #4 abdominale klieren, weergegeven in het ontleed dier en aangegeven door de rode pijlen, werden geïsoleerd. (C) representatief voorbeeld van abdominale klieren #4 geïsoleerd uit een nullipaar vrouwelijke B6 muis. (D) substantiële subcutane weefsel van klieren waarin weefsel had niet verwijderd uit het blok paraffine voorafgaand aan vectorafbeeldingsbestanden (bijvoorbeeld oppervlakkige) bleek na kleuring voor de ECM eiwit fibronectine. (E) Considerably minder subcutaan weefsel en meer fibronectine gekleurd stromale weefsel uit klieren in die 100-200 µm van weefsel had verwijderd uit het blok paraffine voorafgaand aan vectorafbeeldingsbestanden (bijvoorbeeld diepe) werden waargenomen. Histologische secties zijn afkomstig uit representatieve monsters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: histologisch verwerking en kleuring. (A) schematische weergave van de stappen die zijn gebruikt voor histologisch verwerking. Een andere reeks stappen werd gebruikt voor analyses van collageen expressie. (B) representatieve beelden van de ECM eiwitten collageen, fibronectine en tenascin-C van de klieren van vrouwelijke nullipaar caveolin-1 gebrekkige dieren. Pijlen voor collageen, fibronectine en tenascin-C geven de dichte stroma voering van de leidingen. PSR: Picrosirius rood. FN: fibronectine. Tien-C: tenascin-C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Analyses voor ductaal het platform. (A) een fibronectine gekleurd sectie illustreert uitgebreide weefselschade. Dit wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van pauzes in de ductaal structuren (pijlen). (B) een fibronectine gekleurd sectie illustreert de aanwezigheid van intact ductaal structuren die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van lumen omgeven door een of meer lagen van epitheliale cellen en een omliggende stroma. Pijlen geven aan individuele ductaal structuren. (C) een beeld van fibronectine gebeitste wijst op de aanwezigheid van ductaal takken, die worden aangegeven met pijlen. Opmerking de continuïteit van deze met het lumen van de grotere ductaal structuur. (D) vasculaire structuren (rode pijlen), gekenmerkt door een enkele laag van cellen en de aanwezigheid van a-nucleated eosinofiele structuren indicatieve van rode bloedcellen, worden vaak waargenomen in de nabijheid met de leidingen (zwarte pijl). Lage vergroting is weergegeven in de afbeelding aan de linkerkant en een bijbehorende hoge vergroting afbeelding wordt getoond aan de rechterkant. Deze beelden werden gekleurd met H & E en tenascin-C. CD31 werd gebruikt als een positieve marker voor de endotheliale cellen voering van de vasculaire structuren. Een grote vasculaire structuur in welke CD31 zijn positieve cellen zichtbaar voering van het lumen van het schip wordt getoond. Lage vergroting is weergegeven in de afbeelding aan de linkerkant en een bijbehorende hoge vergroting afbeelding wordt getoond aan de rechterkant. (E) ductaal omtrek werd gemeten in een α-SMA-gekleurd beeld met behulp van een vector (aangegeven in rood) te schetsen van het myoepithelial-compartiment terwijl ductaal gebied werd gemeten met behulp van een vector (afgebeeld in het blauw) te schetsen van het luminal compartiment. De regio tussen de compartimenten stromale en luminal werd geclassificeerd als het ductaal gebied. Schaal bar = 50 µm. schematische voorstelling van een ductaal structuur markeren de gebieden waaruit de omtrek en de oppervlakte werden gemeten. Tien-C: tenascin-C. De histologische afdeling in figuur E werd gewijzigd van: Thompson C et al. 16 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de krant, hebben we een techniek om te isoleren van de borstklieren intact muis voor downstream histologische analyses van ECM expressie en ductaal morfologie beschreven. Met betrekking tot de analyses van ductaal morfologie maakt deze methode het snelle onderzoek van ductaal het platform gebaseerd off van gebeitst histologische secties. Andere methoden van ductaal analyses, is afhankelijk van injecties van kleurstoffen om de visualisatie van de ductaal boom, methoden die technisch uitdagende en tijdrovend kunnen zijn.
Bij borstkanker, is de ECM gemeld te worden abnormaal. 1 , 2 , 6 , 9 in het bijzonder veranderingen in de overvloed en/of dwarsbinding patronen van de ECM bij zijn gemeld beïnvloeden tumor progressie, metastase en therapie resistentie3,4,6,7 ,8,9. Wijzigingen in de ECM-omgeving zijn bovendien ook gemeld te wijzigen ductaal epitheliale cel morfologie en proliferatie17, potentieel leiden tot een situatie die ten gunste van de inleiding van de tumor. Terwijl wij een caveolin-1 gebrekkig diermodel voor de beoordeling van wijzigingen in de ECM expressie en ductaal morfologie na verlies van caveolin-1 gebruikt, een kan deze methode toepast in een muismodel. Om te beoordelen ECM-expressiepatronen en ductaal architectuur, beschrijven we een techniek om te isoleren geheel, intact borstklieren voor downstream histologische analyses. Resultaten van deze methode leverde gedegen analyses van ECM expressie en klierweefsel morfologie. We vonden dat analyseren ECM expressie, vooral fibronectin, uit secties waarin 100-200 µm van oppervlakkige weefsel werd verwijderd vóór segmenteren en kleuring leverde een vollediger beeld van het klierweefsel fibrose. Daarnaast vonden we dat gebruik van ezel serum in tegenstelling tot de BSA leverde betere kwaliteit histologische monsters waarin niet-specifieke kleuring werd aanzienlijk teruggebracht.
Voor analyses voor ductaal het platform is het belangrijk dat u secties waarin weefsels zijn intact en bevatten van leidingen in die breuk punten, een gevolg van onjuist weefsel behandeling en segmenteren, zijn niet duidelijk. Bovendien is het belangrijk om te onderscheiden correct ductaal takken, een andere parameter die een onderzoeker wilt meten en vasculaire structuren die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door hun enkelgelaagde endotheel en eosinofiele structuren binnen de lumen naast kleuring met CD31. Terwijl buizen werden waargenomen in secties gekleurd voor verschillende eiwitten van ECM, myoepithelial markering αSMA en H & E counterstaining, gemarkeerd die de cellulaire component van de leidingen, de opsomming van leidingen en eventuele bijbehorende takken is haalbaar met H & E gekleurd weefselsecties alleen. Voor meer gedetailleerde ductaal morfogenese analyses of analyses van de aanwezigheid van vooraf neoplastische en/of neoplastische laesies, kan een onderzoeker wil gebruiken confocal imaging om te evalueren van de weefsels van de levende ex-vivo . In dit geval, kan dezelfde techniek in die hele klieren worden weggesneden worden toegepast met de fixatie en het weefsel verwerking stappen uitgeschakeld.
Kritische stappen in dit protocol omvatten het gebruik van chirurgische micro loupes die niet alleen de nauwkeurige identificatie van de #4 abdominale klieren ingeschakeld, maar bovendien de dissectie van de klier van het bovenliggende dermis en het onderliggende buikvlies toegestaan. De uitsluiting van aanzienlijke onderhuidse weefsels en spieren verminderd adipeus-geassocieerde inmenging in kleuring en histologie. Daarnaast wilt beter aangeven ECM expressie veranderingen in de klier, vonden wij het nuttig om het verwijderen van 100-200 µm van het weefsel blok, die geholpen elimineren residuele adipeus weefsel. Hoewel de hele melkklier isolatie biedt informatie over weefsel breed veranderingen in stromale eiwit expressie en ductaal morfogenese, de beschreven techniek is beperkt tot analyse van seriële secties van vaste, paraffine-ingebedde weefsels. Om de mate waarop wijzigingen in ductaal vertakking hebben voorgedaan, hele mount beeldvorming van levende, ex-vivo weefsels nodig zou zijn. Hier, kon een onderzoeker Cre-Lox gebruiken voor het ontwerpen van aangepaste, voorwaardelijke fluorescerende verslaggever vervoegingen klier specifieke eiwitinteractie studeren of gebruikmaken van een kleurstof om te verlichten de ductaal boom vóór18imaging. Naast dit, zou verdere analyse van proteïnen van belang in het geheel van de klier vereisen het gebruik van westelijke vlek of massaspectrometrie of andere high-throughput technieken zoals dwarsbinding immunoprecipitation (CLIP) of chromatine Immunoprecipitation (ChIP). In dit geval zou hele klieren worden ontleed, verdeelde in kleine stukjes en verwerkte dienovereenkomstig voor de downstream analyses. Bovendien kan men ook gebruik maken van fluorescerende imaging op weefselsecties. Deze techniek zou ideaal zijn voor het analyseren van meerdere eiwitten en eiwit expressie co lokalisatie in het dezelfde weefsel.
We beschrijven in het kort, een techniek die biedt de snelle Isolatievan geheel, intact borstklieren en nadere gegevens inzake histologische verwerking en ductaal analyses. Toekomstige toepassingen van deze techniek kon onderzoeken ECM expressie en bijbehorende wijzigingen in ductaal morfologie in tumor-dragende dieren. Analyses van de oriëntatie van de collageen en vezels diameter, informatie die nuttig zijn kan voor het analyseren van de dichtheid van het weefsel, kunnen bovendien ook worden uitgevoerd op PSR gekleurd secties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen April Wiles en Dr. Roger Broderson voor hulp bij het dierlijke necropsie en isolatie van de klier, respectievelijk. Financiering voor dit werk werd gesteund door de Philadelphia College of Osteopatisch Medicine centra voor chronische aandoeningen of Aging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
