Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung des gesamten, intakte Maus Milchdrüsen um Ausdruck der extrazellulären Matrix (ECM) und duktale Morphologie zu untersuchen. Maus #4 Bauch-Drüsen wurden von ca. 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous Mäusen, in neutral gepuffertem Formalin fixiert, geschnitten und gefärbt mit Immunohistochemistry für ECM Proteine extrahiert.
Abstract
Das Ziel dieses Verfahrens war #4 Bauch Milchdrüsen von weiblichen nulliparous Mäusen zu ernten, um ECM Ausdruck und duktale Architektur zu beurteilen. Hier entstand eine kleine Tasche unter der Haut mit Mayo Schere, so dass Trennung der Drüsen in das subkutane Gewebe von der zugrunde liegenden Bauchfell. Visualisierung der Drüsen wurde unterstützt durch den Einsatz von 3,5 X-R chirurgische micro Lupen. Das Fell wurde invertiert und merken zurück ermöglicht Identifikation von intakten Mamma Fettpolster. Jeder der #4 Bauch-Drüsen wurde unverblümt zergliedert durch Verschieben der Skalpellklinge seitlich zwischen die subkutane Schicht und die Drüsen. Sofort nach der Ernte, wurden die Drüsen in 10 % neutral gepuffertem Formalin für die anschließende Gewebe Verarbeitung gelegt. Exzision der gesamten Drüse ist vorteilhaft, weil es in erster Linie eliminiert das Risiko des Ausschlusses wichtiger Gewebe-weite Wechselwirkungen zwischen duktalen Epithelzellen und andere microenvironmental zellularen Bevölkerungen, die in einer partiellen Biopsie entgehen lassen könnte. Ein Nachteil der Methode ist die Verwendung von Schnittserien aus festen Geweben die Analysen des duktalen Morphogenese und Protein Ausdruck an diskreten stellen innerhalb der Drüse begrenzt. Als solche Veränderungen in duktale Architektur und Protein-Expression in 3 Dimensionen (3D) ist nicht leicht erhältlich. Alles in allem ist die Technik auf Studien, die völlig intakt murinen Milchdrüsen für nachgelagerte Untersuchungen wie Entwicklungsstörungen duktale Morphogenese oder Brust Krebs anwendbar.
Introduction
Brustkrebs ist gekennzeichnet durch ein hohes Maß an Gewebe Fibrose1,2,3,4. Als die ECM bezeichnet, diese nicht-zelluläre Einheit findet sich in unterschiedlichem Ausmaß in allen Geweben und besteht hauptsächlich aus einem komplexen Geflecht von fibrillären und nicht-fibrillären Kollagene, Elastin und Glykoproteinen neben verschiedenen Signalmoleküle, die in dieser Matrix abgesondert. Homöostatische Bedingungen wird die Ablagerung und den Abbau des ECM streng kontrolliert. 5 während Brust Tumorgenese, wird das Gleichgewicht der ECM-Ablagerung und Abbau gestört. Als solche wurden Brusttumoren berichtet, reichlich ECM-Proteine wie Kollagene, Fibronektin und Tenascin-C unter anderem zum Ausdruck bringen. 6 der abnorme Ausdruck dieser Proteine zusätzlich erhöhte Muster Matrix Vernetzungsgrad ist dokumentiert worden, zur Förderung der Brust Tumor Progression, Metastasierung und Therapie Widerstand1,3, 4,7,8,9.
Um ECM Zusammensetzung und duktale Morphologie zu beurteilen, wurde Isolation intakt Milchdrüsen durchgeführt. Hier wir weibliche nulliparous Mäusen unzulänglich für Caveolin-1 verwendet, eine integrale Membranprotein, verbunden mit einer aggressiven Brustkrebs-Tumor Signatur10,11,12, und weibliche nulliparous B6 zu kontrollieren Mäuse. Histologischen Verarbeitung und Färbung dieser Gewebe erlaubt die Identifizierung von mehreren ECM-Proteinen zusammen mit Charakterisierung von duktalen Morphologie.
Alles in allem Möglichkeit die Isolierung des gesamten, intakte Milchdrüsen Forscher die, Gewebe-weite morphologische oder zelluläre Veränderungen in Reaktion auf exogene oder endogene Faktoren zu untersuchen. Nachteile der Technik sind verbunden mit Analysen von 2 Dimension (2D) Gewebeschnitte im Gegensatz zu einer 3D Perspektive, die ein vollständigeres Bild der komplexen Morphologie des Baumes duktale erbringen würde. Angesichts der Komplexität der Zell-Zell und Zelle-ECM-Interaktionen, die stattfinden in der Brustdrüse, ist die Isolierung des gesamten, intakten Drüsen vorteilhaft für effizient analysieren duktale Morphologie und Protein Ausdruck in verschiedenen Regionen der Murine Milch- Drüse.
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Protocol
Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen in diesem Protokoll wurden geprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee des Philadelphia College of Osteopathic Medicine genehmigt und alle Techniken wurden unter strengen durchgeführt ethische Leitlinien.
1. Probe Beschaffung und Verarbeitung
- Wählen Sie geeignete tierische Betreff und Ort in eine CO-2-Kammer. Verwenden Sie für dieses Experiment 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous B6. CG-Cav1tmMIs/J und C57BI/6J.
- Schalten Sie Gasstrom zu 30-40 %. Sobald das Tier nach ca. 2 min sichtlich bewusstlos ist, öffnen Sie das Gasventil zu vollen Druck für eine zusätzliche 5 min.
Hinweis: Bestätigen Sie tierischen Tod durch die Beobachtung von sichtbaren Zeichen der Atmung (z.B. Bewegung der Brust) für einen Zeitraum von 10 Minuten nach Beendigung der CO 2 Lieferung. Wenn das Tier noch am Leben ist, kann es wieder in die CO-2-Kammer platziert. Zervikale Dislokation kann auch verwendet werden, obwohl es nicht empfohlen wird, da Blut ansammeln kann, um die Milchdrüsen stören die Dissektion und Ergebnisse. - Nach Opfer, pin-Kadaver in Rückenlage und mit 70 % Ethanol zu sättigen.
- Kneifen das Fell direkt über dem Schambein mit Pinzette und nick mit kleine chirurgische Scheren. Drehen der Schere das Fell entlang der ventralen Mittellinie bewegen auf kranialen kaudalen geschnitten.
- Mit größeren Schere oder einer Gefäßklemme unverblümt sezieren die subkutane Faszie bilateral, mit Vorsicht nicht auf um das Peritoneum zu durchbohren. Schneiden Sie entlang der horizontalen Ränder an beiden distalen Enden des Schnittes.
- Pin das Fell Klappen öffnen und wieder mit 70 % Ethanol sprühen.
Hinweis: Obwohl die Verwendung von 70 % Ethanol bessere visuelle Unterscheidung zwischen der Drüse und die umliegenden Unterhautgewebe erlaubt, seien Sie vorsichtig zu trocknen des Gewebes als Folge der Verwendung dieser Lösung. Um zu vermeiden, trocknen, entfernen der Drüsenkörpers in einem Zeitrahmen nicht zu 4 min nicht überschreiten. Als Alternative zu 70 % Ethanol, kann der Prüfer auch ersetzen einen allgemeinen isolieren Puffer, z. B. 1 X PBS, um Gewebe Austrocknung zu vermeiden. - Ortung der Milchdrüsen von Interesse, schieben Sie ein #4 Skalpellklinge entlang der Innenseite der Fell-Klappen, Schneiden der Brustdrüse und die damit verbundenen kutane Fettgewebe frei von der Dermis.
Hinweis: 3,5 x chirurgische micro Lupen können einfacher Visualisierung der Drüsen helfen. - Tauchen sofort neu isoliert Drüse in konische Rohr mit 10:1 Lösung-Gewebe-Volumen von 10 % neutral gepuffertem Formalin für 24-48 h
Hinweis: Je nach Absicht der Studie, viele alternative Fixiermittel verwendet werden wie Paraformaldehyd, Ethanol für genomische Studien und handelsüblichen RNA Puffer erhalten. - Folgen institutionelle Protokolle für die Einbettung von Paraffin, reichen Proben an einen Lieferanten für die Verarbeitung, einbetten, und schneiden/Folie Montage. Sektion Gewebe bei 5 µm.
Hinweis: Aufgrund von überschüssigem Fettgewebe umliegenden Drüse, sollten Sie entfernen 100-200 µm Gewebe vor dem Schneiden und färben.
2. Retikuläres Gewebe
- Immunohistochemistry
- Ort-Folien auf Heizblock gefärbt werden gesetzt auf 58 ° c für 1 h Paraffin schmilzt.
Achtung: Paraffin Wachs schmelzen Folie überschreiten. Aufmerksam verfolgen oder platzieren Sie wischen unter Folie, Abfluss Wachs zu erfassen.
Hinweis: Dieser Schritt ist nicht erforderlich und kann übersprungen werden. Wenn Ergebnisse sind nicht wie erwartet, Hinzufügen von diesen Schritt zurück kann Ergebnis verbessern. - Inkubieren Folien in einer Folie jar mit 100 % Xylol für 30 min vollständig untertauchen zu gewährleisten. Einmal zu wiederholen.
Hinweis: an dieser Stelle sollte Sichtprüfung durchgeführt werden um sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte sind frei von Fettgewebe und Paraffin. Wenn zusätzliche Fettgewebe oder Wachs ersichtlich ist, sollte die Folie wieder in Xylol eingetaucht sein. Seien Sie vorsichtig, um zusätzliche Exposition gegenüber Xylol zu minimieren, da dies Schrumpfung des Gewebes führen kann. - Einmal rehydrieren Gewebe in eine Folie JAR-Datei mit 100 % igem Ethanol für 10 min. wiederholen.
- Umzug Folien eine Folie JAR-Datei mit 95 % igem Ethanol für 10 min. wiederholen einmal.
- Verschieben Sie Folien eine Folie Glas enthält 75 % Ethanol für 5 min.
- Verschieben Sie Folien eine Folie Glas mit 50 % Ethanol für 5 min.
- 10 mM Natriumcitrat Lösung (pH-Wert 6,0) in einer heißen Platte oder eine Mikrowelle kochen und gießen Sie in Coplin Jar.
Achtung: Überwachen Sie Lösung beim Erwärmen und vermeiden Sie kochen über zu. Container werden sehr heiß. Schutz verwenden, um Verbrennungen zu vermeiden. - Langsam Platz Dias in Coplin jar, vollständiges Untertauchen zu gewährleisten und bei 100 ° C für 10 min zum Abrufen von Epitopen inkubieren. Entfernen und sorgfältig trocknen Folien.
- Zeichnen eine Sperre um Gewebe mit einem hydrophoben Marker. Fügen Sie genügend körpereigene Enzym-Blocker (Wasserstoffperoxid und Natriumazid, erhältlich im Handel) Gewebe abdecken und 10 min. inkubieren
- Submerge Folien in 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 10 min.
- Fügen Sie genügend Serum 10 % Esel in 1 X PBS Gewebe abdecken und für 1 h bei Raumtemperatur in eine feuchte Kammer inkubieren.
Hinweis: Das Experiment kann hier durch die Speicherung der Folien in die feuchte Kammer bei 4 ° C über Nacht angehalten werden. Während Esel Serum gefunden wurde, um optimale Färbung Ergebnisse zu erzielen, kann der Prüfer verschiedene Seren wie Rinderserumalbumin (BSA), Ziegenserum oder Pferd Serum, um optimale Ergebnisse zu bestimmen testen möchten. Wenn BSA verwenden, sollte der Prüfer diese frisch vor Gebrauch zubereiten. - Dekantieren überschüssige Blocker von Folien und richtig verdünnte Primärantikörper in 1 % Serum direkt hinzufügen Folien um sicherzustellen, dass das Gewebe in Lösung gleichmäßig bedeckt ist. 30 min bei Raumtemperatur in eine feuchte Kammer inkubieren.
Hinweis: Dieser Schritt fortgesetzt werden für längere Zeit Laufzeiten mit feuchten Kammer gelagert um 4 ° C. Achten Sie darauf, die richtige Negativkontrolle Folien (z. B. eine Folie mit keine primären Antikörper, Antigen-negativen Gewebe, etc. bekannt) bei diesem Schritt enthalten. - Sorgfältig waschen Dias durch fließt etwa 1 mL der DiH 2 O über Gewebe und inkubieren Sie 1 Änderung der 1 X PBS für 5 min.
- Dekantieren überschüssige PBS und fügen Sie genug Meerrettich-Peroxidase-Label Gewebe zu bedecken und 30 min. in eine feuchte Kammer inkubieren.
Hinweis: Bei diesem Schritt kann der Prüfer, fluoreszierende Färbung mit Gewebekulturen konjugierten Sekundärantikörper fortfahren möchten. Wenn dies gewünscht ist, sollten die nächsten Schritte beschrieben entsprechend angepasst werden. - Sorgfältig waschen Dias durch fließt etwa 1 mL der DiH 2 O über Gewebe und inkubieren Sie 1 Änderung der 1 X PBS für 5 min.
- Diaminobenzidine (DAB) plus Chromogen-Lösung entsprechend dem Hersteller empfohlene Verhältnis und vermischen von Wirbel.
Hinweis: Viele fertige Kits sind im Handel erhältlich neben in diesem Protokoll verwendet. - Dekantieren Überschuss Puffern von Folien und fügen Sie 2-3 Tropfen (10-50 µL) Chromogen Fleck direkt zu den Geweben und 5 min in die feuchte Kammer inkubieren. Sorgfältig waschen Folien durch fließende etwa 1 mL DiH 2 O über Gewebe.
Achtung: DAB-Chromogen ist hochgiftig. Vermeiden Sie direkten Kontakt des Flecks mit Haut und sammle Flow aus Sondermüll.
- Ort-Folien auf Heizblock gefärbt werden gesetzt auf 58 ° c für 1 h Paraffin schmilzt.
- Hämatoxylin und Eosin (H & E)
- Chromogen Inkubation Nachspülung nach Tauchen Folien in Harris Hämatoxylin für 2-2,5 min. Spülen Folien vorsichtig unter fließendem Wasser für 1-2 min.
Hinweis: Achten Sie darauf, direkten Wasserstrahl auf Geweben. - Folien Submerge für 2-3 s in Differenzierung Lösung (0,25 mL Salzsäure in 100 mL 70 % igem Ethanol). Spülen Sie Folien vorsichtig unter fließendem Wasser für ca. 1-2 min.
- Tauchen Sie Folien in blauen Agent (4,5 mg Calciumcarbonat in 100 mL Leitungswasser, pH-Wert eingestellt auf 9,4) für 60 S. Spülen Folien in 95 % igem Ethanol für 30 s.
- Submerge Folien in alkoholischer Eosin Y für ca. 2-3 min.
- Entwässern Gewebe in 2 Änderungen von 95 % Ethanol für 1 min.
- Gelief Gewebe in 1 von 100 % Ethanol für mind. 1 ändern
- Trocknen Folien mit einem fusselfreien Tuch. Geben Sie 1 Tropfen (ca. 100-200 µL) von synthetischen, nichtwässrigen, Harz-Basis Montage Medien zu schieben und Deckglas anzuwenden.
Hinweis: Wenn eine andere Färbung Methode gewählt wurde, möglicherweise eine andere Montage-Medien erforderlich. Zum Beispiel, wenn der Prüfer eine Leuchtstoff-konjugierten Sekundärantikörper gewählt haben, eine wässrige Halterung mehr ideal wäre. - Folien über Nacht bei Raumtemperatur einstellen lassen.
- Chromogen Inkubation Nachspülung nach Tauchen Folien in Harris Hämatoxylin für 2-2,5 min. Spülen Folien vorsichtig unter fließendem Wasser für 1-2 min.
- Picrosirius rot (PSR) färben
- Wählen Sie Folien werden gebeizt und Immunhistochemie Protokoll über Schritt 6 (50 % Ethanol einweichen) folgen.
- Submerge Folien in PSR Fleck für 1 h.
- Tauchen Sie Folien in 0,5 % Essigsäure für 1-2 s zweimal, um Flecken zu differenzieren.
- Entwässern Gewebe in 2 Änderungen von 95 % Ethanol für 1 min.
- Gelief Gewebe in 1 von 100 % Ethanol für mind. 1 ändern
- Klare Folien durch kurz eintauchen in 100 % Xylol für über 3-4 s.
- Trocknen Folien mit einem fusselfreien Tuch. Geben Sie 1 Tropfen (ca. 100-200 µL) von synthetischen, nichtwässrigen, Harz-Basis Montage Medien zu schieben und Deckglas anzuwenden.
3. Probieren Sie Analyse
- Duktales Analyse
- Select Folien gebeizt für α-SMA. Mit einem Lichtmikroskop, ausgestattet mit einem Kamera Ziel, repräsentative Bilder mit 20 X Vergrößerung sammeln.
- Mit ImageJ (NIH), zu unterscheiden und zählen Kanäle in jedem Bild. Diese können manuell aufgelistet werden oder man kann einzelne Kanäle eine Punkteskala zuweisen. Zuweisen einer Punkteskala, ImageJ zu öffnen und wählen Plugins. Als nächstes wählen Sie Analyze und Zelle Zähler aus dem Drop-down-Menü. Initialize klicken Sie unter markieren Sie Typ1 zunächst Kennzeichnung der Rohre zu. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Ergebnisse anzeigen die Anzahl die duktale.
Hinweis: Achten Sie darauf, überprüfen Strukturen sind duktale und nicht vaskulären. - In ' setzen Messung ' Optionen, aktivieren Sie ' Umfang ' und ' Bereich ".
- Mit dem Freihand Polygon-Werkzeug zeichnen Sie eine Linie um jedes Rohr auf das Myoepithelial Fach (Sichtbarkeit von α-SMA Fleck unterstützt). Wählen Sie ' Messen ' und notieren Sie den Umfang und die Fläche.
- Wieder mit dem Freihand Polygon-Werkzeug eine Linie entlang der apikalen Seite des duktalen Epithel im Innern des Gefäßlumens. Wählen Sie ' Messen ' und notieren Sie den Umfang und die Fläche.
- Subtrahieren Sie den Umfang der luminalen Abteil aus dem Umfang des Myoepithelial Fach um den Umfang des duktalen Epithel zu erhalten. Subtrahieren Sie den Bereich der luminalen Fach aus dem Bereich der Myoepithelial Fach, das Gebiet der duktalen Epithel zu erhalten.
- Immunohistochemistry Analyse
- auf eine Analysesoftware wie ImageJ oder Fidschi Suite Hellfeld Bilder hochladen.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zum Beizen Analyse mit ImageJ und der IHC Toolbox Plugin. - Öffnen Sie die Toolbox IHC aus dem Plugin-Menü. In der " Modell auswählen " Combo-Box öffnet sich, wählen geeignete Fleck (d. h. H-DAB, PSR, etc.). Wählen Sie die " Farbe " Option, um den Fleck zu isolieren. Dadurch öffnet sich ein Ergebnisfenster.
Hinweis: Diese Methode ist sinnvoll, wenn ein Protein des Interesses in den extrazellulären oder cytosolischen Räumen liegt oder an der Plasmamembran gebunden ist. Wenn das Protein des Interesses Atomkraft ist, Auswahl, " Kerne " fordert das Plugin, das Bild für positiv gefärbten Kernen analysieren. - Color Chooser schieben verwenden, um den Fleck ohne Hintergrund Einschluss oder Ausschluss der übermäßigen Fleck richtige Isolierung.
Hinweis: Wenn der automatische Modus nicht in der Lage ist, den Fleck zu erkennen oder nicht akzeptable Bilder führt, zeichnen Sie ein Quadrat Region von Interesse (ROI) über eine identifizierte Region gebeizt. Wählen Sie im Fenster "IHC-Toolbox" " Zug ", Plugin, um das entsprechende Ziel zu lenken. - Konvertieren Sie das Bild auf 16-Bit. Gehen Sie zu Bild → Typ → 16bit.
- Schwelle das Bild. Gehen Sie zu Bild → einstellen → Auto Schwelle.
- Setzen die Messskala Bild durch Ziehen einer Linie ROI direkt über die Maßstabsleiste in das Bild, dann die Länge zuweisen. Um die Maßstabsleiste einzustellen, gehen Sie zu Analyse → Set Maßstab. Geben Sie die Anzahl der Pixel pro die gewünschte Längeneinheit (z.B. 120 Pixel pro 50 µm).
- Die resultierende Fläche messen und grauen Mittelwert. Gehen Sie zu Analyze → Set Messungen und sammeln Sie die Messung durch Klicken auf Analyze → Maßnahme.
- auf eine Analysesoftware wie ImageJ oder Fidschi Suite Hellfeld Bilder hochladen.
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Representative Results
Weibliche Mäuse haben 5 paar Milchdrüsen. Insbesondere gibt es ein paar von zervikalen Drüsen (#1), zwei Paare von thorakalen Drüsen (#2 und #3), ein paar Bauch-Drüsen (#4) und 1 paar inguinalen Drüsen (#5) (Abb. 1A). Hier isoliert wir #4 Drüsen, da sie leicht zu identifizieren sind. In einigen Fällen wurden #4 und #5 Drüsen zusammen isoliert da Unterscheidung zwischen den beiden schwierig war. Zur Isolierung intakt #4 Bauch war Milchdrüsen, das Fell angeheftet und sorgfältig getrennt von der zugrunde liegenden Bauchfell, enthüllt die Lage der #4 Drüsen wird durch einen Pfeil (Abbildung 1B). #4 Drüsen wurden sorgfältig ausgeschnitten und auf das Vorhandensein von jeder verbleibende subkutane oder Muskel Gewebe untersucht. Obwohl diese nicht in unsere isolierten Drüsen (Abbildung 1C) erkennbar waren, wir wesentlich mehr Unterhautgewebe in Fibronektin-gefärbten Drüsen von Gewebe Blöcke in dem Gewebe nicht vor dem Schnitt entfernt worden beachten (z.B. oberflächliche) (Abbildung 1D) versus Drüsen in die 100-200 µm von Gewebe aus dem Gewebe Block vor Stationspunkte (z.B. Tiefe) (Abbildung 1E) entfernt worden. Um zu gewinnen, ein besseres Verständnis der Gewebe Fibrose in der Brustdrüse in Reaktion auf exogene oder endogene Faktoren, die Ermittler kann Fibrose in vergleichen wollen oberflächliche und tiefe Einschnitte der Drüse. Für weitere Analysen ist es möglicherweise vorteilhaft für den Prüfer Abschnitt den Gewebe-Block in der Mitte, bevor Sie fortfahren, um Gewebe zu schneiden und färben wenn erhebliche subkutanen und/oder Muskelgewebe nach Dissektion der Drüse vorliegt.
Nach Isolierung waren Drüsen in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert, bearbeitet und geschnitten für das Beflecken. Die Schritte zur Analyse von Kollagen Interessenbekundung neben anderen Proteinen verwendet werden in Abbildung 2Adargestellt. Repräsentative Proben aus dem ECM-Proteine Kollagen, Fibronektin und Tenascin-C sind in Abbildung 2Bdargestellt. Pfeile in jedem der Bilder zeigen das Vorhandensein von Leitungen in diesen Geweben (Abbildung 2B).
Um morphologische Merkmale von Kanälen zu quantifizieren, ist es wichtig, die histologische Abschnitte mit Sorgfalt zu behandeln, wie unsachgemäßer Behandlung entstehen im geschädigten Gewebe und Kanäle, die nicht messbar sind. Beispiele für unsachgemäße Handhabung können direkt auf das Gewebe, bei falscher Temperatur Puffer verwenden oder aus Gewebeproben in rauen Puffer wie Natriumcitrat und Essigsäure für eine längere Zeit als im Protokoll angegebenen Puffer oder Wasser ausgeführt werden. Abbildung 3zeigt ein Beispiel für eine Gewebe-Abschnitt in welchem, den Gewebe beschädigt wurde. Umfangreiche Beschädigung des Gewebes kann hier ohne weiteres als Bruch Punkte in den Kanälen(Abbildung 3)beobachtet werden. Ein Abschnitt wie diese kann für die Analyse von duktalen Strukturen verwendet werden. Abbildung 3Bzeigt ein Beispiel für eine intakte Gewebeprobe, wo die Kanäle messbar und quantifizierbar sind. Hier sind die Kanäle nicht nur durch die umliegenden Fibronektin-gefärbten Stroma geprägt, sondern zeichnen sich auch durch die Anwesenheit von einer dichten Bevölkerung von epithelialen Zellen, das Lumen der Gallenwege (Abb. 3B). Es ist wichtig zu beachten, dass während der Entwicklung der Maus Brustdrüse ein einzelnes Rohr bei der Geburt von der sekundären Seitenzweige sprießen enthält, bilden einen komplizierteren duktalen Baum, der eine Reihe von Verzweigungen und Regression mit jedem Estrous Zyklus durchläuft 13. obwohl wir nicht die Estrous Zyklus der Tiere in diesen Experimenten berücksichtigt haben, möge die Ermittler, um Auskunft über duktale zahlen unabhängig von der Estrous Zyklus. Die Ermittler bezeichnet man ein Protokoll von Caligioni14 in der Phase des Estrous Zyklus sichtbar bestimmt werden kann. Im Hinblick auf die Quantifizierung der Kanäle, das Vorhandensein von mehreren duktale Strukturen in diesen histologischen Abschnitten ist kein Hinweis auf mehrere einzigartige Kanäle, aber ist ziemlich bezeichnend für einen weiter entwickelten duktale Baum aus duktalen Auswuchs. Um Kanäle aufgelistet werden, kann eine eine Bildanalyse-Software wie ImageJ (NIH) für die einzelnen Kanäle in einem Gewebe-Abschnitt eine Nummer verwenden. Die Ermittler können Kanäle als Veränderungen in duktale Nummern aufzählen, die Entwicklungsstörungen oder eines pathologischen Zustands hindeuten kann. In Bezug auf unsere Studie wir glauben die erhöhte Anzahl der Kanäle, ein Ergebnis des duktalen Auswuchs, bezieht sich auf den Verlust von Caveolin-1, die den aberranten Ausdruck von Wachstumsfaktoren wie Insulin Wachstumsfaktor 1 (IGF-1), bekannter Vermittler der Maus duktale fahren kann Wachstum 15.
Mehrere Leitungen enthalten neben der Anwesenheit von intakten Kanäle Zweige, angezeigt durch Pfeile in einem Fibronektin-gefärbten Bereich (Abb. 3C). Für die Zwecke dieser Analyse sollte diese duktale Zweige nicht als separate duktale Struktur berücksichtigt. Bei der Bewertung und Messung der Kanäle, ist es wichtig, die Kanäle von vaskulären Strukturen zu unterscheiden. Vaskuläre Strukturen können nicht nur durch die Anwesenheit von einer endothelialen Monolage Futter das Lumen, sondern auch durch die Anwesenheit von pro-Kern, eosinophile Strukturen indikativ der Erythrozyten (RBC) in das Lumen (Abbildung 3D) identifiziert werden. Obwohl das Vorhandensein von Eosinophile Strukturen innerhalb Lumen RBC zeigt und Gefäßsystem schlägt, ist die Verschiebung des RBC während der Drüse Collection in Gewebeschnitten möglich. Es ist ratsam, vaskuläre Strukturen mit dem endotheliale Marker CD31 bestätigen. Ein Beispiel für einen histologischen Abschnitt mit CD31 befleckt ist (Abbildung 3D). Um duktale Umfang und Fläche zu quantifizieren, können Vektoren in ImageJ (NIH) zugewiesen werden, der Myoepithelial Grenze (Umfang) und der luminalen Grenze in α-SMA-gefärbten Gewebe Abschnitt zu entwerfen. Α-SMA, eine Markierung von glatten Muskelzellen, diente als es die myoepithelialen Zellen Flecken die Kanäle säumen. In der Abbildung zeigt die rote Linie die Myoepithelial Grenze, während die blaue Linie die luminalen Grenze (Abbildung 3E zeigt). Die Region zwischen den Stromazellen und luminalen Abteilen, gezeigt im Schaltplan, ist die Fläche der gesamten Stromazellen Gewebe sowie die duktalen Epithelzellen (Abbildung 3E).
Abbildung 1 : Isolierung des gesamten, intakte Milchdrüsen für histologische Analysen. (A) nach Tieropfer, das Fell wurde sorgfältig entfernt und merken sich zurück, um die Milchdrüsen befindet sich zwischen der Dermis und Peritoneum aussetzen. Das Schema zeigt die relativen Positionen der zervikalen (#1), Thorax (#'s 2 und 3), Bauch (#4) und inguinalen (#5) Drüsen. (B) die #4 Bauch-Drüsen, in das seziert Tier gezeigt und durch die roten Pfeile angedeutet wurden isoliert. (C) repräsentatives Beispiel #4 Bauch-Drüsen von nulliparous Frauen B6 Maus isoliert. (D) erhebliche Unterhaut aus Drüsen in denen Gewebe nicht aus der Paraffinblock vor Stationspunkte (z. B. oberflächliche) entfernt hatte war offensichtlich nach Färbung für ECM Protein Fibronektin. (E) ConsiderabLy wurden weniger subkutanes Gewebe und mehr Fibronektin gebeizt Stromazellen Gewebe aus Drüsen beobachtet in denen Paraffinblock vor Stationspunkte (z.B. Tiefe) 100-200 µm Gewebe entzogen hatte. Histologischen Abschnitte werden von repräsentativen Stichproben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Histological Verarbeitung und Färbung. (A) schematische Darstellung der Schritte für die histologischen Verarbeitung verwendet. Eine andere Reihe von Schritten wurde für die Analyse von Kollagen Ausdruck verwendet. (B) repräsentative Bilder der ECM Proteine Kollagen, Fibronektin und Tenascin-C aus den Drüsen weiblicher nulliparous Caveolin-1 mangelhaft Tiere. Pfeile für Kollagen, Fibronektin und Tenascin-C zeigen die dichten Stroma entlang der Kanäle. PSR: Picrosirius rot. FN: Fibronektin. Zehn-C: Tenascin-C. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Analysen der duktalen Architektur. (A) eine Fibronektin befleckt Abschnitt zeigt umfangreiche Gewebeschäden. Dies zeichnet sich durch die Anwesenheit von Pausen in den duktalen Strukturen (Pfeile). (B) eine Fibronektin befleckt Abschnitt zeigt das Vorhandensein von intakten duktale Strukturen gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Lumen umgeben von einer oder mehreren Schichten der Epithelzellen und einem umgebenden Stroma. Pfeile zeigen einzelne duktale Strukturen. (C) eine Fibronektin-gefärbten Bild unterstreicht die Anwesenheit von duktalen Zweige, die mit Pfeilen gekennzeichnet sind. Beachten Sie die Kontinuität dieser mit dem Lumen der größeren duktale Struktur. (D) vaskuläre Strukturen (rote Pfeile), zeichnet sich durch eine einzelne Schicht von Zellen und das Vorhandensein von a-kernhaltige Eosinophile Strukturen bezeichnend für den Erythrozyten, werden häufig in der Nähe mit den Kanälen (schwarzer Pfeil) beobachtet. Geringer Vergrößerung zeigt sich in dem Bild auf der linken Seite und ein entsprechende hohe Vergrößerung Bild wird auf der rechten Seite angezeigt. Diese Bilder waren voller Flecken, mit H & E und Tenascin-C. CD31 diente als positive Marker für die Endothelzellen Futter der vaskulären Strukturen. Gezeigt wird eine große vaskuläre Struktur in welche, die CD31 positive Zellen Futter das Lumen des Gefäßes sichtbar sind. Geringer Vergrößerung zeigt sich in dem Bild auf der linken Seite und ein entsprechende hohe Vergrößerung Bild wird auf der rechten Seite angezeigt. (E) duktale Umfang gemessen wurde, in ein α-SMA-gefärbten Bild mithilfe eines Vektors (gezeigt im rot), um Myoepithelial Fach zu skizzieren, während duktale Bereich mit Hilfe eines Vektors gemessen wurde (blau dargestellt) der luminalen Fach zu skizzieren. Die Region zwischen den Stromazellen und luminalen Abteilen wurde als Duktales Bereich eingestuft. Maßstabsleiste = 50 µm. schematische Darstellung einer duktalen Struktur markieren die Bereiche, aus denen der Umfang und die Fläche gemessen. Zehn-C: Tenascin-C. Histologischen Bereich in Abbildung E wurde geändert von: Thompson C Et Al. 16 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In dem Papier haben wir eine Technik, um intakte Maus Milchdrüsen für nachgeschaltete histologische Analysen der ECM Ausdruck und duktale Morphologie isolieren beschrieben. Im Hinblick auf Analysen von duktalen Morphologie ermöglicht diese Methode die rasche Untersuchung der duktalen Architektur basiert auf gefärbten histologischen Abschnitte. Andere Methoden des duktalen Analysen beruhen auf Injektionen von Farbstoffen ermöglicht Visualisierung des Baumes duktale Methoden die technisch schwierig und zeitraubend sein kann.
Bei Brustkrebs wurde das ECM berichtet, um anormal zu sein. 1 , 2 , 6 , 9 insbesondere Veränderungen der Fülle und/oder Vernetzung der ECM berichtet worden, Tumor Progression, Metastasierung und Therapie Widerstand3,4,6,7 beeinflussen ,8,9. Darüber hinaus wurden Änderungen im ECM-Umfeld auch duktale Epithelzelle Morphologie und Verbreitung17, möglicherweise führend zu eine Situation, die Begünstigung der Tumorentstehung ändern beschrieben. Während wir eine Caveolin-1 mangelhaft Tiermodell zur Beurteilung von Veränderungen in der ECM-Ausdruck und duktale Morphologie nach Verlust von Caveolin-1 genutzt, kann eines dieser Methodik in jeder Maus-Modell anwenden. Bewertung von ECM Expressionsmuster und duktale Architektur beschreiben wir eine Technik, um ganze, intakte Milchdrüsen für nachgeschaltete histologische Analysen zu isolieren. Ergebnisse aus dieser Methodik erzielt robuste Analysen der ECM Ausdruck und Drüsen Morphologie. Wir fanden diesen Analyse ECM Ausdruck, vor allem Fibronektin aus Abschnitten, die in denen 100-200 µm der oberflächlichen Gewebe entfernt wurde, vor dem Schnitt und Färbung ergab ein vollständigeres Bild der glandulären Fibrose. Darüber hinaus fanden wir, dass die Verwendung von Esel Serum im Gegensatz zur BSA bessere Qualität histologischen Proben ergab die unspezifische Färbung deutlich reduziert wurde.
Zur Auswertung der duktalen Architektur ist es wichtig, Abschnitte zu verwenden, in denen Gewebe intakt sind und Leitungen in der Bruch verweist, eine Folge der unsachgemäßen Gewebe Handhabung enthalten und schneiden, sind nicht erkennbar. Darüber hinaus ist es wichtig, richtig zu unterscheiden, Duktales Zweige, ein weiterer Parameter, die ein Ermittler messen möchten und vaskulären Strukturen, die leicht können, durch ihre Monolage Endothel identifiziert werden und eosinophile Strukturen innerhalb der Neben der Färbung mit CD31 Lumen. Während Kanäle in Abschnitten gebeizt für verschiedene ECM-Proteine, die myoepithelialen Marker αSMA und H beobachtet wurden & E Gegenfärbung, die hervorgehoben der zellulären Komponenten der Gallenwege, Aufzählung der Kanäle und alle damit verbundenen Niederlassungen ist erreichbar mit H & E gefärbten Gewebeschnitten allein. Für genauere Analysen der duktalen Morphogenese oder Analysen der Anwesenheit von Pre-neoplastischen und/oder neoplastischen Läsionen möchten vielleicht ein Ermittler nutzen confocal imaging zu live Ex-Vivo Gewebe zu bewerten. In diesem Fall kann die gleiche Technik, in der ganze Drüsen herausgeschnitten werden, mit der Fixierung und des Gewebes Bearbeitungsschritte eliminiert angewendet werden.
Wichtige Schritte in diesem Protokoll umfassen die Verwendung von chirurgischen Mikro Lupen, die nicht nur die genaue Identifizierung der #4 Bauch-Drüsen aktiviert, sondern zusätzlich die Zerlegung der Drüse aus der darüberliegenden Dermis und zugrunde liegende Bauchfell erlaubt. Der Ausschluss von erheblichen subkutanen Gewebe und Muskeln reduziert Fettgewebe-assoziierten Störungen in Färbung und Histologie. Darüber hinaus um ECM Ausdruck Änderungen in der Drüse besser zu identifizieren, fanden wir es für sinnvoll, 100-200 µm des Blocks Gewebe zu entfernen, die restliche Fettgewebe zu beseitigen half. Obwohl ganze Brustdrüse Isolierung über Gewebe große Veränderungen in der Stromazellen Protein-Expression und duktale Morphogenese informiert, die beschriebene Technik beschränkt sich auf die Analyse der Schnittserien von festen, Paraffin eingebetteten Gewebe. Das Ausmaß, welche Änderungen in duktale etablieren Verzweigung aufgetreten sind, ganze Berg Bildgebung live, Ex-Vivo -Gewebe notwendig wäre. Hier könnte ein Ermittler Cre Lox verwenden, um benutzerdefinierte, bedingte fluoreszierende Reporter Konjugationen zu studieren spezifische Proteininteraktionen Drüse oder nutzen Sie einen Farbstoff zur Beleuchtung des duktalen Baums vor imaging18entwerfen. Darüber hinaus würden weitere Analyse der Proteine des Interesses an der Gesamtheit der Drüse ist die Verwendung von western-Blot oder Massenspektrometrie oder anderen Hochdurchsatz-Techniken wie Vernetzung Immunopräzipitation (CLIP) oder Chromatin notwendig Immunopräzipitation (ChIP). In diesem Fall würde ganze Drüsen, in kleine Stücke geschnitten und verarbeitet entsprechend für die nachgeschalteten Analysen seziert werden. Darüber hinaus kann man auch fluoreszierende Bildgebung auf Gewebeschnitte verwenden. Diese Technik ist ideal für die Analyse von mehreren Proteinen und Protein Ausdruck Co Lokalisierung im gleichen Gewebe wäre.
Zusammenfassend lässt sich sagen beschreiben wir eine Technik, die bietet die schnelle Isolierung des gesamten, intakte Milchdrüsen und weitere Details auf histologischen Verarbeitung und duktale Analysen. Zukünftige Anwendungen dieser Technik könnte ECM Ausdruck und damit einhergehenden Veränderungen in duktale Morphologie in Tumor-tragenden Tiere untersuchen. Analysen von Kollagen Orientierung und Faserdurchmesser, Informationen, die möglicherweise nützlich für die Analyse von Dichte Gewebe, können darüber hinaus auch auf PSR gebeizt Abschnitte durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten April Wiles und Dr. Roger Broderson für Hilfe mit tierischen Sektions- und Drüse Isolation, bzw. zu bestätigen. Mittel für diese Arbeit wurde von den Philadelphia College of Osteopathic Medicine Centers für chronische Erkrankungen des Alterns unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
