Summary
Здесь мы представляем протокол для изоляции всего, нетронутыми мыши молочных желез расследовать внеклеточного матрикса (ECM) выражение и протоковой морфологии. #4 мыши брюшной полости желез были извлечены из 8-10 недельных самок мышей первородящих, фиксированной в нейтральных буферизации формалин, секционного и витражи, с помощью иммуногистохимия для ECM белков.
Abstract
Цель этой процедуры заключается в урожай брюшной молочных желез #4 от женского первородящих мышей для того, чтобы оценить выражение ECM и протоковой архитектуры. Здесь был создан небольшой карман под кожей, ножницами Mayo, позволяя отделение желез в подкожной клетчатке от базового брюшины. Визуализация желез опиралось на использование 3.5 x-R хирургические микро лупы. Шкура была обращена и удержал обратно, позволяющий идентифицировать нетронутыми молочной жировых отложений. Каждый из брюшной полости желез #4 тупо была рассечена скольжения лезвия скальпеля боково между подкожный слой и желез. Сразу же после сбора урожая, железы были помещены в нейтральных буферизации формалина 10% для обработки последующих ткани. Иссечение всей железы выгодно, потому что он главным образом устраняет риска исключения важные ткани общесистемного взаимодействия между протоковой эпителиальных клеток и других microenvironmental клеточных популяций, которые могут быть пропущены в частичной биопсии. Один недостаток методологии является использование последовательных секций от фиксированных тканей, который ограничивает анализ экспрессии протоковой морфогенеза и белка дискретных места в железе. Таким образом изменения экспрессии протоковой архитектуры и белков в трех измерениях (3D) не является легко доступной. В целом техника применяется для исследования, требующие совершенно нетронутыми мышиных молочных желез для вниз по течению исследования, например, развития протоковой морфогенеза или рак груди.
Introduction
Рак молочной железы характеризуется значительной степени ткани фиброз1,2,3,4. Упоминается как ECM, эта сущность неклеточное находится в различной степени во всех тканях и главным образом состоит из сложной сети фибриллярного и не фибриллярный коллагены, эластин и гликопротеинов, помимо различных сигнальных молекул, которые поглощенный в этой матрице. Гомеостатических условиях осаждения и деградации ECM жестко контролируется. 5 во время опухолей молочной железы, нарушается баланс, ECM осаждения и деградации. Таким образом опухоли груди были зарегистрированы выразить обильные протеины ECM коллагены, фибронектин и tenascin-C среди других. 6 ненормальным выражением этих белков в дополнение к повышенной модели матрицы сшивки были задокументированы, чтобы содействовать груди опухоль прогрессии, метастазов и терапии сопротивление1,3, 4,,78,9.
Чтобы оценить состав ECM и протоковой морфологии, была выполнена изоляции нетронутыми молочных желез. Здесь мы использовали самок мышей первородящих недостаточно для Кавеолин-1, интегральный мембранный белок, который был связан с агрессивным груди опухоль подписи10,11,12и контролировать женский первородящих B6 мышей. Гистологической обработки и окрашивания этих тканей допускается определение нескольких ECM белков вместе с характеризация протоковой морфологии.
В целом изоляции всего, нетронутыми молочных желез дает исследователям возможность исследовать ткани общесистемной морфологических или сотовой изменения, происходящие в ответ на экзогенных и эндогенных факторов. Недостатки метода связаны с анализом 2 разделов ткани измерения (2D) в отличие от 3D перспективы, которая даст более полную картину сложную морфологию протоковой дерева. Учитывая сложность-клеток и клеток ECM взаимодействий, которые происходят в молочной железе, изоляции всего, нетронутыми желез выгодно для эффективного анализа протоковой морфологии и белка выражение в различных регионах мышиных молочных желез железы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
с участием животных субъектов в этом Протоколе процедуры были рассмотрены и утверждены институциональный уход животных и использование Комитета Филадельфии колледж остеопатической медицины и все методы были проведены под строгим этические принципы.
1. образец закупки и переработки
- выберите соответствующие животные тему и место в камеру CO 2. Для этого эксперимента, использовать 8-10 неделя старая женщина первородящих B6. CG-Cav1tmMIs/J и C57BI/6J.
- Включение газового потока до 30-40%. Как только животное заметно сознание после около 2 мин, Откройте газовый клапан полного давления для дополнительные 5 минут
Примечание: Подтверждение смерти животного, наблюдая видимых признаков дыхания (например, движения грудной клетки) в течение 10 мин после прекращения подачи CO 2. Если животное жив до сих пор, она может помещаться обратно в камере CO 2. Шейки матки дислокации также могут быть использованы, хотя это не рекомендуется как кровь может накапливать вокруг молочных желез, мешая диссекции и результаты. - После жертвоприношения, закрепить каркаса в лежачем положении и насыщают с 70% этанол.
- Щепотка Пелт чуть выше лобка, с помощью щипцов и Ник с малые хирургические ножницы. Вращающиеся ножницы, вырезать Пелт вдоль вентральной midline перемещение хвостового черепной.
- С большей ножницы или кровоостанавливающий, тупо вскрыть подкожной фасции на двусторонней основе, используя осторожность не протыкайте брюшины. Разрезать вдоль горизонтального поля на обоих концах дистальной части разреза.
- Pin Пелт закрылки откройте и снова спрей с 70% этанол.
Примечание: Хотя допускается использование 70% этиловом спирте лучше визуальные различия между железы и окружающих подкожной клетчатки, будьте осторожным во избежание высыхания ткани в результате использования этого решения. Чтобы избежать высыхания, удалите железы в сроки не должны превышать 4 мин. В качестве альтернативы на 70% этиловом спирте, следователь может также заменить общего изолировать буфер, например, ПБС, чтобы избежать высыхания ткани. - Обнаружения молочных желез интерес, слайд #4 скальпель лезвие вдоль внутри Пелт закрылки, резка молочной железы и связанные кожный жировой свободной от дермы.
Примечание: 3,5 x хирургические микро лупы может помочь в легче визуализации желез. - Немедленно погрузиться вновь изолированных железы в коническую пробирку, содержащую объем 10:1 решение ткани нейтральных буферизации формалина 10% за 24-48 ч.
Примечание: В зависимости от цели исследования, многие альтернативные фиксативов может использоваться как параформальдегида, этанол геномных исследований, и коммерчески доступных РНК, сохраняя буферов. - Следовать институциональных протоколов для встраивания парафин, представить образцы поставщику для обработки, внедрение и нарезка/слайд монтажа. Раздел ткани на 5 мкм.
Примечание: Из-за избыточной жировой окружающие железу, рассмотрите возможность удаления 100-200 мкм ткани перед секционирование и пятнать.
2. Окрашивания тканей
- иммуногистохимии
- место слайды чтобы быть запятнано на тепла блок установлен на 58 градусов за 1 ч для плавления парафина.
Предупреждение: Плавления парафина могут выполнить отключение слайд. Следить или места протрите под слайд для захвата стока воск.
Примечание: Этот шаг не является необходимым и может быть пропущен. Если результаты не являются, как ожидалось, добавив этот шаг назад может улучшить результаты. - Инкубировать слайды в слайд банку содержащий 100% ксилола 30 мин, обеспечение полного погружения. Повторить один раз.
Примечание: на данный момент, визуальный осмотр должны выполняться для обеспечения свободной от жировой ткани и парафин разделах ткани. Если дополнительные жировой ткани или воск является очевидным, слайд повторно погружается в ксилоле. Соблюдайте осторожность для дополнительной минимизации ксилол как это может вызвать усадку ткани. - Раз повторять Регидратационный тканей в слайд jar, содержащий 100% этанола на 10 мин.
- Раз повторить перемещение слайдов слайд jar, содержащий этанола 95% за 10 мин.
- Перемещение слайдов слайд банку содержащего 75% этанола на 5 мин
- Перемещение слайдов слайд сосуд содержащий 50% этанола на 5 мин
- Варить 10 мм натрия цитрата раствор (pH 6.0) в плита или Микроволновая печь и вылить в опарник Coplin.
Предупреждение: Внимательно следить за решением при нагревании и заботиться, чтобы избежать кипения над. Контейнер будет очень жарко. Использовать защиту, чтобы избежать ожогов. - Медленно место слайды в Coplin jar, обеспечение полного погружения и Инкубируйте на 100 ° C в течение 10 мин для извлечения epitopes. Удалите и тщательно высушить слайды.
- Нарисовать барьер вокруг ткани с гидрофобным маркера. Добавьте достаточно эндогенный фермент блокатор (пероксида водорода и азид натрия, имеющиеся коммерчески) для покрытия тканей и инкубировать на 10 мин
- Submerge слайды в 1 x фосфат буфер солевой раствор (PBS) 10 мин
- Добавить достаточно осел 10% сыворотки в 1 x PBS для покрытия тканей и инкубировать 1 час при комнатной температуре в камере увлажненные.
Примечание: Эксперимент может быть приостановлена здесь, сохраняя слайды в увлажненные камере при температуре 4 ° C на ночь. В то время, как было установлено, что осел сыворотки оптимальные результаты окрашивания, следователь, возможно, пожелает проверить различные сера бычьим сывороточным альбумином (БСА), козьего сыворотки или лошадь сыворотки для определения оптимальных результатов. При использовании BSA, следователь должен подготовить этот свежий перед использованием. - Сцеживаться избыток блокиратор от слайды и добавьте должным образом разреженных основное антитело в сыворотке 1% непосредственно слайды, обеспечивая, что ткани равномерно покрыто в растворе. Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре в камере увлажненные.
Примечание: Этот шаг может быть продолжена для более длинней продолжительности времени с влажным камеры, хранящиеся в 4 ° C. Убедитесь, что включать надлежащий контроль негативные слайды (например слайд с не основное антитело, известный антигеннегативными ткани и т.д.) на этом этапе. - Тщательно вымойте слайды течет около 1 мл diH 2 O над ткани и инкубировать в 1 смену ПБС за 5 мин
- Сцеживаться избыток PBS и добавить достаточно хрен пероксидазы метку для покрытия тканей и Инкубируйте 30 мин в камере увлажненные.
Примечание: На данном этапе, следователь, возможно, пожелает приступить к люминесцентные окрашивание с помощью дневно конъюгированных вторичные антитела. Если это желательно, следующий шаги, описанные должны быть изменены соответственно. - Тщательно вымойте слайды течет около 1 мл diH 2 O над ткани и инкубировать в 1 смену ПБС за 5 мин
- Сделать Диаминобензидин (DAB) плюс хромогена решения согласно производитель предлагаемое соотношение и смешайте вихря.
Примечание: Многие готовые комплекты коммерчески доступны помимо той, которая используется в этом протоколе. - Decant избыток буфер из слайдов и добавить 2-3 капли (10-50 мкл) хромогена пятно непосредственно в тканях и Инкубируйте 5 мин в влажной камере. Тщательно мыть слайды течет около 1 мл diH 2 O над ткани.
Предупреждение: DAB-хромогена высоко токсичен. Избегайте прямого контакта пятен с кожи и собирать потока от опасных отходов.
- место слайды чтобы быть запятнано на тепла блок установлен на 58 градусов за 1 ч для плавления парафина.
- Гематоксилином и эозином (H & E)
- после окончательной промывки после инкубации хромогена, опускайте слайды в Харрис гематоксилином для полоскания слайды 2-2,5 мин осторожно под водопроводной воды для 1-2 мин
Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать прямой струей воды на тканях. - Submerge слайды для 2-3 s в растворе дифференциации (0,25 мл соляной кислоты в 100 мл 70% этиловом спирте). Промойте слайды плавно под водопроводной воды для примерно 1-2 мин
- Погружать слайды в синий агент (карбонат кальция 4,5 мг в 100 мл водопроводной воды, рН, скорректирована с 9,4) для 60 s. полоскания слайды в 95% этаноле для 30 s.
- Submerge слайды в алкогольных эозина Y на 2-3 мин
- Обезвоживания тканей в 2 изменения этанола 95% за 1 мин.
- Dehydrate ткань в 1 изменить 100% этанола за 1 мин
- Тщательно высушить слайды с ворса протрите. Применять 1 капля (около 100-200 мкл) из синтетических, неводные, на основе смолы монтажа СМИ слайд и применять coverslip.
Примечание: Если был избран другой метод окрашивания, различных монтажных СМИ могут потребоваться. Например, если следователь выбрал вторичное антитело проспряганное люминесцентные, водная гора бы идеальноее. - Позволяют слайды для задания на ночь при комнатной температуре.
- после окончательной промывки после инкубации хромогена, опускайте слайды в Харрис гематоксилином для полоскания слайды 2-2,5 мин осторожно под водопроводной воды для 1-2 мин
- Picrosirius красный (PSR) окрашивания
- выберите слайды, чтобы быть пятнами и следовать иммуногистохимия протокол через шаг 6 (50% этанола замочить).
- Submerge слайды в PSR пятно на 1 ч.
- Погружать слайды в 0,5% уксусной кислоты для 1-2 сек, дважды, чтобы дифференцировать пятно.
- Обезвоживания тканей в 2 изменения этанола 95% за 1 мин.
- Dehydrate тканей в 1 изменить 100% этанола за 1 мин
- Очистить слайды, кратко погрузив в 100% ксилола для о 3-4 s.
- Тщательно высушить слайды с ворса протрите. Применять 1 капля (около 100-200 мкл) из синтетических, неводные, на основе смолы монтажа СМИ слайд и применять coverslip.
3. Образец анализа
- Протока анализ
- выберите слайды, витражи для α-SMA. С помощью световой микроскоп с камеры установлены цели, собирать представитель изображения при 20-кратном.
- Использование ImageJ (НИЗ), различают и количество каналов в каждом изображении. Они могут быть перечислены вручную или одно может назначить балльной отдельных воздуховодов. Чтобы назначить балльной, открыть ImageJ и выберите плагины. Далее выберите анализировать и выберите счетчик соматических клеток из раскрывающегося меню. Нажмите кнопку инициализировать, а затем выделите тип 1 начать маркировки воздуховодов. Закончив, выберите результаты для просмотра протоковой граф.
Примечание: заботиться для проверки структуры протока и не сосудистых. - В ' задать измерение ' параметры, проверьте ' периметр ' и ' области ".
- С помощью инструмента freehand многоугольник, нарисуйте линию вокруг каждого протока в отсеке миоэпителиальных (видимость, опираясь на α-SMA пятно). Выберите ' меры ' и записывать периметр и площадь.
- Снова используя инструмент freehand многоугольник, нарисуйте линию вдоль в апикальной части протоковой эпителия внутри просвета. Выберите ' меры ' и записывать периметр и площадь.
- Вычесть периметра Люминал отсека от периметра миоэпителиальных отсека для получения окружности протоковой эпителия. Вычесть площадь Люминал отсека из области миоэпителиальных отсека для получения области эпителия протоковой.
- Immunohistochemistry анализ
- загрузить изображения brightfield аналитического программного обеспечения, например ImageJ или Фиджи люкс.
Примечание: Этот протокол описываются шаги для окрашивания анализ с использованием ImageJ и плагин IHC Toolbox. - Открыть панель IHC в меню плагина. В " выберите модель " поле со списком, что откроется, выберите соответствующий пятно (т.е. H-DAB, PSR, и т.д.). Выберите " цвет " возможность изолировать пятно. Это откроет окно результатов.
Примечание: Этот метод удобен, если протеин интереса расположен в внеклеточной или цитозольной пространствах, или привязан к плазматической мембраны. Если протеин интереса ядерного, выбор " ядер " будет запрашивать плагин для анализа изображения для положительно окрашенных ядер. - Использовать слайд выбора цвета для обеспечения надлежащей изоляции без фона включение или исключение чрезмерного пятно пятно.
Примечание: Если автоматический режим не может обнаружить пятно или не приводить к приемлемые изображения, нарисуйте квадрат региона интерес (ROI) над выявленных окрашенные области. На окне IHC панели инструментов, выберите " поезд " прямого плагин к соответствующему целевому. - Преобразовать изображение в 16-разрядных. Перейти к изображение → тип → 16 бит.
- Порог изображения. Перейти к изображение → настроить → Auto порог.
- Установить шкалу измерений изображения путем рисования линии ROI непосредственно над линейки шкалы в изображении, то назначение длины. Чтобы установить линейки шкалы, перейдите на анализ → задать масштаб. Введите количество пикселов на нужную единицу длины (например 120 пикселей на 50 мкм).
- Измерения результирующей области и среднее значение серый. Перейти к анализ → набор измерений и собирать измерения, нажав анализ → мера.
- загрузить изображения brightfield аналитического программного обеспечения, например ImageJ или Фиджи люкс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Самок мышей имеют 5 пар молочных желез. В частности есть одна пара желез шейки матки (#1), две пары грудной железы (#2 и #3), одну пару брюшной полости желез (#4) и 1 пара паховая желез (#5) (рис. 1А). Здесь мы изолированы желез #4, как они легко узнаваемы. В некоторых обстоятельствах #4 и #5 железы были изолированы вместе как различие между ними было трудно. Изолировать нетронутыми #4 брюшной молочных желез, шкура была закреплена и тщательно отделен от базового брюшины, показывая местоположение обозначается стрелкой (рис. 1Б) желез #4. #4 железы были тщательно вырезан и проверяется на наличие каких-либо остаточных подкожной или мышечной ткани. Хотя это не были в нашем изолированном желез (рис. 1C), мы отмечаем существенн больше подкожной клетчатки в окрашенных фибронектин желез из блоков ткани, в которых не были удалены ткани до секционирование (например поверхностные) (рис. 1D) против желез, в которой 100-200 мкм ткани из ткани блока были удалены до резания (например глубокая) (рис. 1E). Чтобы лучше понять, фиброз тканей молочной железы в ответ на экзогенных и эндогенных факторов, следователь, возможно, пожелает сравнить фиброза в поверхностных и глубоких сокращений железы. Для других анализов он может быть выгодным для следователя к разделу блока ткани в два раза, прежде чем приступать к ткани нарезки и пятнать если существенные подкожной и/или мышечной ткани присутствует, после вскрытия железы.
После изоляции желез были зафиксированы в нейтральных буферизации формалина 10%, обрабатываются и секционного для окрашивания. Шаги, используемые для анализа коллаген проявление интереса помимо других белков изображены на рисунке 2A. Репрезентативных выборок от ECM белки коллаген, фибронектин и tenascin-C приведены в рисунке 2B. Стрелки в каждом из изображения показывают наличие воздуховодов в этих тканях (рис. 2B).
Чтобы количественно оценить морфологические особенности воздуховодов, важно для лечения Гистологические срезы с осторожностью, поскольку неправильное обращение может привести к поврежденных тканей и воздуховоды, которые не поддаются измерению. Примеры неправильного обращения могут быть запущены буферов или воды непосредственно на ткани, использование буферов при неправильной температуре или оставляя образцы тканей в суровых буферов, такие как цитрат натрия и уксусной кислоты для более длительного периода времени, чем указано в протоколе. В рисунке 3приведен пример ткани раздела, в котором ткани был причинен ущерб. Здесь может наблюдаться обширные повреждения ткани легко как точки обрыва в протоках (рисA). Раздел как это не может использоваться для анализа протоковой структур. Пример образца неповрежденной ткани, где протоки, поддающиеся измерению и количественной оценке показан на рисунке 3B. Здесь, трубопроводы являются не только характеризуется окружающих фибронектин окрашенных стромы, но также характеризуется наличием густой населения эпителиальных клеток, выстилающих люмен протоков (рис. 3B). Важно отметить, что во время разработки, мыши молочной железы содержит одну трубу при рождении от которых боковых вторичных ветвей прорастают, образуя более сложные протоковой дерево, которое проходит серию ветвления и регрессии с каждой эстральный цикл 13. Хотя мы не учли эстрального цикла животных в этих экспериментах, следователь, возможно, пожелает сделать это, чтобы получить информацию о протоковой номера, независимые от эстрального цикла. Следователь протокол обозначается Caligioni14 в котором стадии эстрального цикла может определяться заметно. Что касается количественной оценки воздуховодов, наличие нескольких протоковой структур в этих Гистологические срезы не свидетельствует о нескольких уникальных каналов, но скорее свидетельствует о более развитых протоковой дерева результате протоковой нарост. Для перечисления каналов, можно использовать программное обеспечение анализа изображений например ImageJ (НИЗ) назначить ряд отдельных воздуховодов в разделе ткани. Следователь, возможно, пожелает перечислить протоков как изменений протоковой чисел, которые могут свидетельствовать о отклонениями или патологические состояния. В отношении нашего исследования мы считаем увеличение числа каналов, в результате протоковой нарост, связано с потерей Кавеолин-1, которые могут ездить аберрантных выражение факторы роста, такие как инсулин фактор роста 1 (ИФР-1), известный посредником мыши протока рост 15.
В дополнение к присутствие нетронутыми воздуховодов несколько протоков содержат ветви, обозначается стрелками в окрашенных фибронектин секции (рис. 3C). Для целей данного анализа эти протоковой ветви следует не рассматриваться как отдельная структура протока. Во время оценки и измерения воздуховодов, важно различать воздуховоды от сосудистых структур. Сосудистых структур можно не только определить присутствие эндотелиальной монослоя, вагонка люмен, но и наличием в ядерной, эозинофильный структур свидетельствует о красных кровяных клеток (РБК) в пределах люмен (рис. 3D). Хотя присутствие Эозинофильный структур в рамках люмен указывает РБК и предлагает сосудистую, перемещение РБК во время сбора железы разделах ткани возможна. Желательно, чтобы подтвердить сосудистых структур с использованием маркера эндотелиальной CD31. (Рис. 3D) приведен пример гистологические секции, окрашенных с CD31. Для того чтобы измерить протоковой окружности и площадь, векторы в ImageJ (НИЗ) может быть присвоено наметить границы миоэпителиальных (окружность) и просветный границы раздела α-SMA-окрашенных тканей. Α-SMA, маркер гладких мышечных клеток, был использован как пятна миоэпителиальных клеток, которые линия воздуховодов. На изображении показано красная линия показывает миоэпителиальных границы, а синяя линия показывает границы Люминал (рис. 3E). Регион между стромы и просветный отсеков, показано на схеме, является площадь, занимаемая всего стромальные ткани плюс протоковой эпителиальных клеток (рис. 3E).
Рисунок 1 : Изоляция всего, нетронутыми молочных желез для гистологического анализа. (A) после жертвоприношения животных, шкура была тщательно удалены и удержал обратно подвергать молочных желез, расположенных между дермы и брюшины. Схема показывает относительное расположение шейки матки (#1), грудной (#'s 2 и 3), брюшной полости (#4) и паховые (#5) желез. (B) брюшной полости желез #4, показано в расчлененных животных и обозначается красными стрелками, были изолированы. (C) пример #4 брюшной полости желез, изолированный от нерожавшие женщины B6 мыши. (D) существенные подкожной ткани из желез, в которых ткани не были удалены из парафина блока до резания (например поверхностные) был очевидным после окрашивания для ECM фибронектин белка. (E) ежегодниз желез, в которых 100-200 мкм ткани были удалены из парафина блока до резания (например глубокая) были замечены ly меньше подкожной клетчатки и более фибронектин окрашенных стромальные ткани. Гистологические срезы являются от репрезентативных выборок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Histological обработки и окрашивания. (A) схематическое представление шаги, используемые для гистологической обработки. Ряд различных шагов, была использована для анализа выражения коллагена. (B) представитель изображения ECM белки коллаген, фибронектин и tenascin-C от желез женщины первородящих Кавеолин-1 недостаточно животных. Стрелки для коллаген, фибронектин и tenascin-C указывают плотной стромы, накладки воздуховодов. PSR: Picrosirius красный. ФН: фибронектин. Десять-C: tenascin-C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: анализ протоковой архитектуры. (A) фибронектин окрашенных раздел иллюстрирует обширных тканевых повреждений. Это характеризуется наличием перерывов в протоковой структур (стрелки). (B) фибронектин окрашенных раздел иллюстрирует наличие неповрежденной протоковой структур, которые характеризуются наличием люмен, окруженный один или несколько слоев эпителиальных клеток и окружающие стромы. Стрелки указывают отдельные протоковой структур. (C) образ фибронектин окрашенных подчеркивает наличие протока ветви, которые обозначаются стрелками. Обратите внимание непрерывности этих с просвета крупной протоковой структуры. (D) сосудистых структур (красные стрелки), характеризуется один слой клеток и присутствие-тому Эозинофильный структур свидетельствует о красных кровяных клеток, часто наблюдаются в близости с воздуховодов (черная стрелка). Малое увеличение это показано на рисунке слева, и соответствующее высокое увеличение изображение отображается справа. Эти изображения были окрашенных с H & Е и tenascin-C. CD31 был использован как позитивный маркера для эндотелиальных клеток, выстилающих сосудистых структур. Показано является большой сосудистой структура, в которой CD31 позитивные клетки являются видимыми накладки в просвет сосуда. Малое увеличение это показано на рисунке слева, и соответствующее высокое увеличение изображение отображается справа. (E) протоковой окружность была измерена в α-SMA-витражные изображения с помощью вектора (показано красным) наметить отсеке миоэпителиальных хотя протоковой области была измерена с помощью вектора (показаны синим цветом) изложить Люминал отсека. Регион между стромы и просветный отсеках был классифицирован как протоковой области. Шкалы бар = 50 µm. схема протоковой структуры, определения областей, которые были измерены периметр и площадь. Десять-C: tenascin-C. Гистологические раздел на рисунке E был изменен от: Томпсон C соавт. 16 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом документе мы описали технику, чтобы изолировать нетронутыми мыши молочных желез для вниз по течению гистологический анализ ECM выражения и протоковой морфологии. Что касается анализа протоковой морфологии эта методология позволяет быстрое расследование протоковой архитектуры основан офф окрашенных Гистологические срезы. Другие методы протоковой анализов полагаются на инъекции красителей для визуализации протоковой дерева, методы, которые могут быть технически сложным и трудоемким.
В рак молочной железы ECM сообщалось быть ненормальным. 1 , 2 , 6 , 9 в частности, изменения в характере изобилия и/или сшивание ECM было сообщено влияния опухоли прогрессии, метастазов и терапии сопротивление3,4,6,7 ,8,9. Кроме того изменения в обстановке ECM сообщалось также изменить протоковой эпителиальных клеток морфологии и распространения17, потенциально ведет к ситуации, пользу опухоли посвящения. Хотя мы использовали Кавеолин-1 недостаточно животной модели для оценки изменений в ECM выражение и протоковой морфологии, после потери Кавеолин-1, одна может применять эту методологию в любой модели мыши. Чтобы оценить выражение модели ECM и протоковой архитектуры, мы опишем технику, чтобы изолировать весь, нетронутыми молочных желез для вниз по течению гистологический анализ. Результаты от этой методологии принесли надежные анализы ECM выражения и железистой морфологии. Мы обнаружили, что анализируя выражение ECM, особенно фибронектин, от разделов, в которых 100-200 мкм поверхностные ткани был удален до секционирование и пятнать принесли более полную картину железистой фиброза. Кроме того мы обнаружили, что использование сыворотки осел в отличие от BSA принесли лучше качество гистологических образцов в которых неспецифичный пятнать было существенно сокращено.
Для анализа протоковой архитектуры важно использовать разделы, в которых ткани нетронутыми и содержат каналы, в которых поломки очков, в результате неправильного ткани обработки и секционирование, не очевидны. Кроме того, важно правильно различать протоковой филиалов, еще один параметр, что следователь, возможно, пожелает оценить и сосудистых структур, которые легко могут быть идентифицированы по их монослоя эндотелия и Эозинофильный структур в рамках просвет в дополнение к пятнать с CD31. В то время как в разделах, витражи для различных белков ECM, миоэпителиальных маркер αSMA и H были замечены воздуховодов & E counterstaining, который подчеркнул сотовых компонент протоков, перечисление протоков и любые связанные ветви является достижимым с H & E только разделы окрашенных тканей. Для более подробного анализа протоковой морфогенеза или анализ присутствия предварительно опухолевой или опухолевых поражений следователь, возможно, пожелает использовать конфокальный изображений для оценки живых экс vivo тканей. В этом случае ту же технику, в которой вырезан всей железы может применяться с фиксации и ткани, ликвидированы шагов обработки.
Важные шаги в этом протоколе включают в себя использование хирургических микро лупы, которые не только позволили точное определение брюшной полости желез #4, но дополнительно Допускается вскрытие железы от вышележащих дермы и базовой брюшины. Исключение существенной подкожных тканей и мышц сократить связанные жировой вмешательства в окрашивание и гистологии. Кроме того чтобы лучше определить изменения выражения ECM в железе, мы нашли его полезным для удаления 100-200 мкм ткани блока, который помог устранить остаточное жировой ткани. Хотя весь молочной железы изоляции обеспечивает информацию на ткани широкие изменения в стромальные белков и протоковой морфогенеза, описанных техника ограничивается анализа последовательных секций с фиксированной, парафин-врезанных тканей. Чтобы установить степень, в которой произошли изменения в протоковой ветвления, вся гора изображений живой, экс vivo тканей будет необходимо. Здесь следователь может использовать Cre-Lox для разработки пользовательских, условное флуоресцентные репортер спряжения учиться железы конкретных белковых взаимодействий или использовать краситель для освещения протоковой дерево до визуализации18. В дополнение к этому дальнейшего анализа белков интерес во всей полноте железы потребует использования иммуноблоттинга или масс-спектрометрии или другой техники высокой пропускной способности, например cross-linking иммунопреципитации (клип) или хроматина Иммунопреципитация (чип). В данном случае весь желез будет расчлененный, секционного на мелкие кусочки и соответственно обработано, для анализа, ниже по течению. Кроме того одно может также использовать флуоресцентных изображений на разделах ткани. Этот метод будет идеально подходит для анализа нескольких белков и белка выражение совместно локализации в том же ткани.
В резюме мы опишем технику, которая предлагает быстрое изоляции всего, нетронутыми молочных желез и предоставляет более подробную информацию по гистологической обработки и протоковой анализов. Будущего применения этой техники может расследовать ECM выражение и связанные изменения в протоковой морфологию опухоли подшипник животных. Кроме того анализ ориентации коллагена и диаметр волокна, информация, которая может быть полезной для анализа плотности ткани, также могут быть выполнены на PSR, окрашенных секций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать апреля козней и д-р Роджер Бродерзоном для помощи с животных патанатомия и железы изоляции, соответственно. Финансирование для проведения этой работы была поддержана центры Филадельфии колледж остеопатической медицины для хронических расстройств старения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
