Summary
Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.
Abstract
#4 karın meme dokuları kadın nulliparous fareler gelen ECM ifade ve duktal mimari değerlendirmek için hasat için bu yordamı amacı oldu. Burada, deri altında küçük bir cep Mayo makas, subkutan doku içinde bezlerinin ayrılması temel karın zarını izin kullanılarak oluşturulmuş. Görselleştirme bezlerinin 3.5 kullanımı ile destekli x-R cerrahi mikro büyüteçler. Pelt ters ve geri izin olduğu gibi meme yağ yastıkları tanımlaması tutturulmuş. Her #4 karın bezlerinin açık açık neşter bıçak yanal subkutan katman ve bezleri arasında kaydırarak disseke. Hemen hasat sonrası, bezleri % 10 tarafsız tampon formalin sonraki doku işleme için yerleştirildi. Eksizyon tüm bezinin avantajlı çünkü öncelikle duktal epitel hücreleri ve kısmi biyopsi cevapsız microenvironmental diğer hücresel nüfus arasındaki önemli doku çapında etkileşimler hariç riskini ortadan kaldırır. Bir metodoloji analizleri duktal morfogenez ve protein ifade bezinin ayrı yerlere sınırlayan sabit dokular seri bölümleri kullanımını dezavantajıdır. Bu nedenle, 3 boyutlu (3D) duktal mimarisi ve protein ifadesindeki değişiklikleri kolayca elde edilebilecek değil. Genel olarak, teknik gelişim duktal morfogenez veya meme kanseri gibi aşağı akım araştırmalar için bütün olduğu gibi fare meme dokuları gerektiren çalışmalar için geçerlidir.
Introduction
Meme kanseri doku fibrozu1,2,3,4önemli bir derecesi ile karakterizedir. ECM anılacaktır, bu cep varlık derecelerde tüm dokularda bulunur ve öncelikle fibriler ve fibriler sigara collagens, elastin ve glikoproteinlerin yanı sıra çoğu çeşitli sinyal molekülleri karmaşık bir meshwork oluşur Bu matris münzevi. Homeostatik koşullar altında ifade ve ECM bozulma sıkı kontrol. 5 sırasında meme tumorigenesis, ECM ifade ve yıkımı dengesi bozulur. Bu nedenle, meme tümörleri bol ECM proteinler collagens, fibronektin ve tenascin-C diğerleri arasında gibi hızlı bildirilmiştir. 6 meme tümör ilerleme, metastaz ve terapi direnç1,3, tanıtmak için matris crosslinking artan şekillerinin yanı sıra bu proteinlerin anormal ifade belgelenmiş oldu 4,7,8,9.
ECM kompozisyon ve duktal Morfoloji değerlendirmek için olduğu gibi meme dokuları yalıtım gerçekleştirildi. Burada, caveolin-1 için kadın nulliparous fareler eksik kullanılan, agresif için bağlı bir integral membran protein meme tümör imza10,11,12ve kadın nulliparous B6 kontrol fareler. Histolojik işleme ve bu dokularda boyama duktal Morfoloji karakterizasyonu birlikte birkaç ECM proteinler tanımlaması izin.
Genel olarak, Bütün, olduğu gibi meme dokuları yalıtım araştırmacılar eksojen veya endojen faktörler cevaben meydana gelen doku çapında morfolojik veya hücresel değişiklikleri öğrenmek için fırsat verir. Dezavantaj-in teknik analizleri 2 Boyut (2D) doku bölümleri karşı karmaşık morfolojisi duktal ağacının daha kapsamlı bir resmi verim bir 3D perspektif ile ilişkilidir. Meme bezi gerçekleşecek hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimleri karmaşıklığı göz önüne alındığında, Bütün, bozulmamış bezlerinin yalıtım verimli duktal morfoloji ve protein ifade çeşitli bölgelerde meme antikorundan analiz etmek için avantajlıdır bezi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hayvan bireylerde bu iletişim kuralı ile ilgili yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Philadelphia Osteopatik Tıp Fakültesi tarafından onaylanmış ve tüm teknikleri sıkı altında yapılmıştır Etik kurallar.
1. örnek satın alma ve işleme
- seçin uygun hayvan konu ve CO 2 odası yerine. Bu deneme için 8-10 hafta kullanan eski dişi nulliparous B6. CG-Cav1tmMIs/J ve C57BI/6J.
- Gaz akışı açmak % 30-40. Bir kez hayvan yaklaşık 2 dakika sonra gözle görülür bilinci yerinde değil, ek bir 5 dakika süreyle tam basınç için gaz vanası açık
Not: hayvan ölüm (örneğin göğüs hareketi) CO 2 teslim bırakma sonra bir 10 dakika boyunca nefes görünür işaretleri gözlemleyerek onaylayın. Hayvan hala hayatta olsa, geri CO 2 odasında yerleştirilebilir. Servikal yerinden çıkması da kan diseksiyon sonuçları çalışmasına mani meme dokuları çevresinde biriktikçe tavsiye edilmez, ancak kullanılabilir. - Kurban, ardından pin karkas sırtüstü pozisyonda ve % 70 etanol ile emdirmek.
- Yukarıda forseps kullanarak pubis pelt pinch ve küçük Cerrahi makas ile nick. Makas, döner kesme taşıma ventral orta çizgi boyunca pelt Kaudal kafatası için.
- Daha büyük makas veya bir hemostat ile açık açık subkutan fasya bilateral, karın zarını delmek değil dikkatli kullanarak incelemek. Yatay kenar boşlukları boyunca belgili tanımlık kesme distal her iki uçta da kesti.
- PIN pelt Kapakları açın ve tekrar % 70 etanol ile sprey.
Not: her ne kadar % 70 etanol bezi ve çevresindeki subkutan doku arasında daha iyi görsel ayrım açiktir, doku kullanımı Bu çözümün sonucu kurutma önlemek dikkatli olun. Kurutma önlemek için 4 dk aşmayacak şekilde bir zaman dilimi içinde bezi kaldırın. % 70 etanol için alternatif olarak, araştırmacı da doku kuruma önlemek için 1 x PBS gibi genel bir ayrı tutma tampon yerine kullanabilir. - İlgi, meme dokuları bulma slayt boyunca meme bezi ve ilişkili Kutanöz yağ dermis ücretsiz kesme pelt flep içine #4 neşter blade.
Not: 3,5 x cerrahi mikro büyüteçler bezleri daha kolay görsel öğeyi yardımcı olabilir. - Hemen daldırın konik tüp için 24-48 h % 10 tarafsız tampon formalin 10:1 çözüm-doku hacmi içeren yeni izole bezi
Not: paraformaldehyde, genomik çalışmalar ve ticari olarak mevcut RNA arabellekleri korunması için etanol gibi birçok alternatif Fiksajlar çalışma amacı bağlı olarak, kullanılabilir. - Parafin katıştırma için kurumsal iletişim kuralları izleyin, bize örnek katıştırma, satıcıya işleme ve montaj Dilimleme/slayt. Bölüm 5 mikron, dokulara.
Not: aşırı yağ çevreleyen bezi nedeniyle 100-200 µm kesit ve boyama önce doku kaldırmayı düşünün.
2. Doku Staining
- ısı blokta lekeli için immünhistokimya
- yer slaytlar ayarla, parafin eritmek 1 h için 58 ˚C.
Dikkat: parafin balmumu erime slaytın dışına çalışmaya başlayabilir. Yakından izleyin veya yer silme ikinci tur balmumu yakalamak için slaytın altında.
Not: Bu adım gerekli değildir ve atlanabilir. Sonuçlar beklendiği gibi değilse, bu adımı geri ekleme sonuçları artırabilir. - Incubate slaytları bir slayt içeren % 100 Ksilen 30 dk tam batma sağlanması için jar. Bir kez yineleyin.
Not: Bu noktada, doku bölümlerde yağ dokusu ve parafin serbest olduğundan emin olmak için görsel muayene yapılmalıdır. Ek yağ dokusu veya balmumu belirgin ise, slayt Ksilen içinde yeniden ve sular altında. Bu doku büzülme neden olabilir gibi eklenen Ksilen maruz en aza indirmek için dikkatli olun. - % 100 etanol 10 dakika süreyle içeren bir slayt kavanoz rehydrate dokularda bir kez yineleyin.
- Hareket slaytlar % 95 etanol 10 dakika süreyle içeren bir slayt kavanoz için bir kez yineleyin.
- Slaytları bir slayt kavanoz içeren % 75 etanol 5 dakika süreyle hareket
- Slaytları bir slayt kavanoz içeren % 50 etanol 5 dakika süreyle hareket
- Kaynatın 10 mM sodyum sitrat çözüm (pH 6.0) sıcak bir tabak veya mikrodalga ve Coplin kavanoza dökün.
Uyarı: Dikkatli bir şekilde çözüm Isıtma sırasında izlemek ve üzerinde kaynatın önlemek için dikkat ediniz. Konteyner çok sıcak olacak. Yanık önlemek için koruma kullanın. - Yavaş yavaş Coplin yer slaytlara jar, tam batma, sağlanması, epitopları almak 10 dk 100 ° C'de kuluçkaya. Kaldırmak ve dikkatle slaytlar kuru.
- Bir engel etrafında doku hidrofobik bir marker ile çizin. Yeterli endojen enzim engelleyici ekleyin (hidrojen peroksit ve sodyum azid, mevcut ticari olarak) ve doku kapağı için 10 dk. kuluçkaya
- 10 dakika süreyle saline (PBS) Submerge slaytları 1 x fosfat tamponlu
- Eklemek yeterli % 10 eşek serum ve doku kapsayacak bir oksijen odası oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya 1 x PBS içinde.
Not: Deneme burada slaytları oksijen Odası 4 ° C'de gecede depolayarak duraklatılmış. Eşek serum en iyi boyama sonuç vermeye bulundu iken, araştırmacı sığır serum albumin (BSA), keçi serum veya en iyi sonuçları belirlemek için at serum gibi farklı sera sınamak isteyebilirsiniz. BSA kullanıyorsanız, araştırmacı bu taze kullanmadan önce hazırlamalıdır. - Aşırı engelleyici slaytlardan dikkatle boşaltmak ve düzgün seyreltilmiş birincil antikor doğrudan slaytlara doku eşit olarak çözümde kaplıdır sağlanması % 1 serum eklemek. Oksijen odası oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
Not: Bu adımı uzun zaman süreleri için nemli Odası 4'te depolanmış devam ° C. bu adımda doğru negatif kontrol slaytlar (örneğin bir slayt ile bilinen antijen-negatif doku, vb hiçbir birincil antikor) eklemek emin olun. - Dikkatle diH 2 O doku üzerinde yaklaşık 1 mL akan tarafından slaytlar yıkama ve 1 x PBS 5 dakika süreyle 1 değişiklik kuluçkaya
- Aşırı PBS dikkatle boşaltmak ve doku kapak ve 30 dk içinde oksijen odası için kuluçkaya için yeterli horseradish peroksidaz etiket ekleyin.
Not: Bu adımda, araştırmacı fluorescently konjuge ikincil antikorları kullanarak boyama floresan için devam etmek isteyebilirsiniz. Bu isterseniz, açıklanan sonraki adımları uygun şekilde değiştirilmesi. - Dikkatle diH 2 O doku üzerinde yaklaşık 1 mL akan tarafından slaytlar yıkama ve 1 x PBS 5 dakika süreyle 1 değişiklik kuluçkaya
- Yapmak diaminobenzidine (DAB) Kromojen çözüm üretici önerilen oranı göre artı ve mix gönderen vortex.
Not: Birçok hazır kitleri piyasada bulunan bu protokol için kullanılan bir kenara. - Decant fazla tampon slaytlardan ve 2-3 damla Kromojen leke (10-50 µL) doğrudan dokuların ekleyin ve nemli odasında 5 min için kuluçkaya. Dikkatle doku üzerinde slayt akan yaklaşık 1 mL diH 2 O tarafından yıkayın.
Dikkat: DAB-Kromojen çok zehirli. Tehlikeli atık içinde kapalı leke cilt ve toplamak akışı ile doğrudan temas önlemek.
- yer slaytlar ayarla, parafin eritmek 1 h için 58 ˚C.
- Hematoksilen ve Eozin (H & E)
- son durulama Kromojen kuluçka sonra takip daldırın Harris Hematoksilen musluk suyu 1-2 dakika süreyle yavaşça altında 2-2,5 dk. durulama slaytlar için slaytlar
Not: su doku üzerine doğrudan jet önlemek için dikkat ediniz. - Submerge farklılaşma çözüm (100 ml % 70 etanol hidroklorik asit 0.25 mL) 2-3 s için slaytlar. Slaytları musluk suyu yaklaşık 1-2 dakika süreyle yavaşça altında durulayın
- % 95 etanol için 30 60 s. durulama slaytlar için slaytlar mavi Agent (100 mL musluk suyundaki 9.4 için ayarlanır pH 4.5 mg kalsiyum karbonat) daldırın s.
- Alkollü Eozin Y 2-3 dakika süreyle Submerge slaytları
- % 95 etanol 1 dk. için 2 değişiklik dokusunda kurutmak.
- % 100 etanol 1 dk. değiştirmek Dehydrate doku 1
- Hav bırakmayan bir bezle dikkatlice kuru slaytlar. 1 damla uygulamak (yaklaşık 100-200 µL) sentetik, sulu olmayan, reçine tabanlı slayt ve coverslip uygulamak için ortam takma.
Not: farklı bir boyama yöntemi seçildi, farklı montaj medya gerekli olabilir. Örneğin, araştırmacı bir floresan Birleşik ikincil antikor seçerseniz, sulu bir Dağı daha ideal olurdu. - Gecede oda sıcaklığında ayarlamak slayt izin.
- son durulama Kromojen kuluçka sonra takip daldırın Harris Hematoksilen musluk suyu 1-2 dakika süreyle yavaşça altında 2-2,5 dk. durulama slaytlar için slaytlar
- Picrosirius kırmızı (PSR) Staining
- lekeli ve immünhistokimya Protokolü (% 50 etanol emmek) adım 6 ile takip için slaytları seçin.
- PSR Submerge slaytları için 1 h. leke
- %0,5 Asetik asit 1-2 s, iki kez leke ayırt etmek için slaytları daldırın.
- % 95 etanol 1 dk. için 2 değişiklik dokularda kurutmak.
- Dehydrate dokularda % 100 etanol 1 dk. değiştirmek 1
- Temizleyin slaytlar kısa bir süre için % 100 Ksilen içinde hakkında batış tarafından 3-4 s.
- Hav bırakmayan bir bezle dikkatlice kuru slaytlar. 1 damla uygulamak (yaklaşık 100-200 µL) sentetik, sulu olmayan, reçine tabanlı slayt ve coverslip uygulamak için ortam takma.
3. Örnek analiz
- Duktal analizi
- seçin slaytlar lekeli α-SMA için. Kamera monte objektif ile donatılmış bir ışık mikroskop kullanarak toplamak temsilcisi imge vasıl 20 X büyütme.
- Kullanma ImageJ (NIH), ayırt etmek ve kanalları her görüntüde saymak. Bunlar el ile numaralandırılan veya bir sayısal puanı için bireysel kanalları devredebiliriz. Bir sayısal puan atamak için ImageJ açın ve eklentileri seçin. Analiz seçin ve açılır menüsünden hücre sayacı seçin. Başlat'ı tıklatın sonra tip kanalları etiketleme başlamak için 1 vurgulayın. Ne zaman tamamlanmak, duktal sayısı görüntülemek için sonuçları seçin.
Not: duktal ve değil vasküler yapılardır doğrulamak için dikkat ediniz. - İçinde ' ölçüm ayarla ' seçenekleri, kontrol ' çevre ' ve ' alan ".
- Bir serbest Çokgen aracını kullanarak myoepithelial yuvası (α-SMA leke tarafından destekli görünürlük), her kanal etrafında bir çizgi çizin. Seçin ' ölçü ' ve çevre ve alan kaydedebilirsiniz.
- Tekrar bir serbest Çokgen aracını kullanarak duktal epitel apikal tarafında bir satır Lümen içi içinde çiz. Seçin ' ölçü ' ve çevre ve alan kaydedebilirsiniz.
- Myoepithelial bölme luminal bölmesinin gelen çevre çevre duktal epitel çevresi elde etmek için çıkarma. Duktal epitel alanı elde etmek için myoepithelial bölme alan luminal bölme alan çıkarma.
- İmmünhistokimya analizi
- Upload aydınlık alan görüntüleri bir analitik yazılım, ImageJ veya FIJI Suite gibi.
Not: Bu protokol analiz ImageJ ve IHC Toolbox eklentisi kullanarak boyama için özet bilgiler. - IHC araç kutusu eklenti menüsünden açın. İçinde " Model Seç " açar, uygun leke seçin açılan kutu (Yani H-DAB, PSR, vb). Seçin " renk " leke yalıtmak için seçeneği. Bu bir sonuç penceresi açılacaktır.
Not: Bu yöntem ilgi bir proteinin hücre dışı veya sitozolik alanlarda yer alan veya plazma zarı bağlı uygundur. Faiz protein nükleer ise, seçme " çekirdeği " olumlu lekeli çekirdekler için görüntü analiz etmek için eklenti isteyecektir.
Renk Seçici'yi slayt kullanmak uygun yalıtım olmadan arka plan içerme veya dışlama aşırı leke leke emin olmak için - .
Not: otomatik mod leke tespit edemiyor veya kabul edilebilir Albümdeki yol açmaz, bir kare bölgesi faiz (ROI) üzerinde tanımlanan bir bölge lekeli çizin. IHC Toolbox penceresi seçin " tren " uygun hedef eklentisine yönetecek. - 16-bit için resmi dönüştürün. Gidin görüntü → türü → 16 bit.
- Eşik görüntü. Gidin görüntü → ayarlamak → otomatik eşik.
- Görüntü ölçüm ölçek uzunluğu atama görüntüde bir hattı yatırım Getirisi ölçek çubuğu üzerinden doğrudan çizerek ayarlayın. Ölçek çubuğu ayarlamak için'gidin analiz → ölçeği ayarla. Piksel uzunluğu (örneğin 120 piksel / 50 µm) istenen birim sayısını girdi.
- Sonuç alan ölçmek ve gri değeri demek. Gidin analiz → ayarla ölçümleri ve ölçüm tıklatarak toplamak analiz → ölçü birimi.
- Upload aydınlık alan görüntüleri bir analitik yazılım, ImageJ veya FIJI Suite gibi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dişi fareler meme dokuları 5 çift var. Özellikle, servikal bezleri (1), iki çift göğüs bezlerinin (#2 ve #3), karın bezleri (#4) bir çift ve kasık bezleri (#5) (Resim 1A) 1 Çift bir çift vardır. Burada, kolayca tanımlanabilir oldukları gibi #4 bezleri izole. İkisi arasında ayrım zor olduğu gibi bazı durumlarda, #4 ve #5 bezleri birlikte izole edildi. Sağlam #4 karın yalıtmak için meme dokuları, pelt tutturulmuş ve dikkatli bir şekilde (şekil 1B) bir okla gösterilen #4 bezleri konumunu açığa temel karın zarını ayrılmış. #4 bezleri dikkatle varlığına ve herhangi bir kalıntı subkutan veya kas doku varlığı için denetledi. Bunlar bizim izole bezleri (Resim 1C) tanımlanabilir değildi, biz önemli ölçüde daha fazla subkutan doku içinde doku değil kaldırıldı kesit önce doku bloklarla fibronektin lekeli bezlerinde Not (Örneğin yüzeysel) (Resim 1D) bezleri hangi 100-200 µm dokusundan dokusunun içinde blok kaldırıldı parça (örneğin önce derin) (Resim 1E) karşı. Doku fibrozis meme bezi eksojen veya endojen faktörler cevaben de daha iyi anlaşılmasını sağlamak için araştırmacı fibrozis de karşılaştırmak hazırlayabilirsiniz karşı bezinin derin kesikler yüzeysel. Diğer analizler için ilerleme-e doğru doku dilimleme ve önemli Eğer subkutan boyama ve/veya kas dokusu bezi diseksiyon takip mevcuttur önce ikiye doku blok bölüm için dedektif için avantajlı olabilir.
Yalıtım, bezleri % 10 tarafsız tampon formalin içinde sabit, işlenen ve boyama için kesitli. Ek olarak diğer protein kollajen ifade ilgi analiz etmek için kullanılan adımları şekil 2Atasvir edilir. ECM proteinler kolajen, fibronektin ve tenascin-C temsilcisi örnekleri Şekil 2' deBgösterilir. Oklar her görüntülerin kanallarını varlığı bu dokularda (Şekil 2B) gösterir.
Morfolojik özellikleri olarak kanallarının ölçmek için yanlış işleme hasarlı doku ve ölçülebilir olmayan kanalları neden olabileceğinden histolojik bölümleri bakımı ile tedavi etmek önemlidir. Uygunsuz kullanım örnekleri arabellekleri veya su doğrudan dokular, uygunsuz bir sıcaklıkta arabellekleri kullanarak veya daha uzun bir süre daha belirtilen iletişim kuralı için doku örnekleri sodyum sitrat ve Asetik asit gibi sert arabellekleri bırakarak üzerinde çalışıyor olabilir. Hangi dokuda hasar oluştu bir doku bölümü örneği şekil 3' teAgösterilir. Burada, büyük zarar doku için kırılma noktaları kanalları (şekil 3A) olarak kolayca görülebilir. Bir bölümü bu gibi duktal yapıları analizleri için kullanılamaz. Şekil 3' teBkanalları ölçülebilir ve ölçülebilir nerede bir sağlam doku örneği örneği gösterilmiştir. Burada, kanalları değildir sadece çevredeki fibronektin lekeli stroma tarafından karakterize, ama aynı zamanda yoğun bir nüfus kanalları (şekil 3B) Lümen astar epitel hücrelerinin varlığı ile karakterizedir. Geliştirme sırasında fare meme bezi tek bir kanal üzerinden bir dizi dallanma ve regresyon her estrous döngüsü ile uğrar bir daha karmaşık duktal ağacı oluşturan hangi yanal ikincil dalları Fideler, doğumda içerir unutmamak gerekir 13. her ne kadar biz bu deneyler hayvanlarda estrous döngüsünü dikkate almamış, araştırmacı duktal numaraları estrous döngüsü bağımsız hakkında bilgi elde etmek için bunu yapmak isteyebilirsiniz. Araştırmacı bir iletişim kuralına estrous döngüsü aşamasını gözle görülür belirlenebilir Caligioni14 tarafından denir. Kanalları miktarının, ile ilgili olarak birden fazla duktal yapılarını histolojik Bu bölümlerdeki varlığı birden çok benzersiz kanalları göstergesi değildir ama yerine daha gelişmiş bir duktal ağacının duktal sonucu ortaya çıkan göstergesidir. Kanalları numaralandırmak için bir görüntü analiz yazılımı gibi ImageJ (NIH) doku bölümünde tek tek kanalları bir numara atamak için kullanabilirsiniz. Araştırmacı kanallarının gelişimsel anomalileri ya da patolojik durum göstergesi olabilir duktal rakamlarla değişiklikler olarak numaralandırmak için hazırlayabilirsiniz. Bizim çalışma ile ilgili olarak, biz kanalları, duktal akıbet sonucu artan sayıda inanıyorum ilgili anormal ifade (IGF-1), fare duktal bilinen bir arabulucu gibi insülin büyüme faktörü 1 büyüme faktörlerinin sürücü caveolin-1 kaybı büyüme 15.
Sağlam kanalları varlığı ek olarak, dalları, fibronektin lekeli bölümünde (şekil 3C) ok ile gösterilen birkaç kanalları içerir. Bu analiz amacıyla bu duktal dalları ayrı bir duktal yapı düşünülmemelidir. Değerlendirme ve kanalları ölçme kanalları vasküler yapılardan ayırt etmek önemlidir. Vasküler yapılar sadece Lümen astar bir endotel monolayer varlığı ile aynı zamanda bir nükleer, Eozinofilik yapıları göstergesi kırmızı kan hücrelerinin (RBC) varlığı ile Lümen (şekil 3D) içinde tespit edilebilir değil. RBC gösterir ve damarlara öneriyor Lümen içinde Eozinofilik yapıların varlığı RBC deplasman doku bölümler boyunca bezi toplama sırasında mümkündür. Vasküler yapılar endotel işaretçisi CD31 kullanarak onaylamak için tavsiye edilir. CD31 ile lekeli bir histolojik bölüm örneği (şekil 3D) gösterilir. Duktal çevresi ve alan ölçmek için vektörel çizimler ImageJ (NIH) myoepithelial sınır (çevresi) ve α-SMA-lekeli doku bölümünde luminal sınır belirlemenizi atanabilir. Boru hattı myoepithelial hücreleri lekeleri gibi α-SMA, düz kas hücrelerinin bir işaretleyici kullanıldı. Mavi çizgili luminal sınır (şekil 3E) gösterirken gösterilen resimde kırmızı çizgi myoepithelial sınır gösterir. Alan toplam stromal doku artı duktal epitel hücreleri (şekil 3E) tarafından işgal şematik gösterilen stromal ve luminal bölmeleri arasındaki bölgedir.
Resim 1 : Bütün, olduğu gibi meme dokuları histolojik analizler için yalıtım. (A) hayvan kurban, pelt dikkatle kaldırıldı ve dermis ve Periton arasında yer alan meme dokuları ortaya çıkarmak için geri tutturulmuş. Şematik servikal (#1), göreli konumları gösterir torasik (# ' 2 ve 3), (#4) karın ve kasık (#5) bezleri. (B) disseke hayvan gösterilen ve kırmızı oklarla gösterilen #4 karın bezleri, izole edildi. (C) temsilcisi örnek #4 karın bezlerinin nulliparous kadın B6 fareden izole. (D) önemli subkutan doku içinde doku parafin blok parça (örneğin yüzeysel) önce kalkmış değil bezlerinden ECM protein fibronektin için boyama takip belirgin oldu. (E) Considerably 100-200 µm doku içinde parafin blok parça (örneğin derin) önce kalkmış bezleri daha az subkutan doku ve daha fazla fibronektin stromal doku lekeli tespit edildi. Histolojik kesitler temsilcisi örnekleri vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: işleme ve boyama Histological. (A) histolojik işleme için kullanılan adımları şematik gösterimi. Farklı bir dizi adımı analizleri, kolajen ifade için kullanılmıştır. ECM proteinler kolajen, fibronektin ve tenascin-C kadın nulliparous caveolin-1 eksik hayvanlar bezleri (B) temsilcisi görüntülerini. Oklar kolajen, fibronektin ve tenascin-C için kanalları astar yoğun stroma gösterir. PSR: Picrosirius kırmızı. FN: fibronektin. On-C: tenascin-c Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: analizleri duktal mimarisinin. (A) bölüm lekeli bir fibronektin geniş doku hasarı göstermektedir. Bu tatili duktal yapılarda (oklar) varlığı ile işaretlenir. (B) bölümünde lekeli bir fibronektin varlığı bir veya daha fazla katmanı epitel hücresi ve çevresindeki stroma çevrili Lümen ile işaretlenmiş olduğu gibi duktal yapıları varlığı gösterilmiştir. Oklar, bireysel duktal yapıları gösterir. (C) oklarla gösterilir duktal dalları varlığı fibronektin lekeli görüntü vurgulamaktadır. Bunlar daha büyük duktal yapısı Lümen ile sürekliliğini unutmayın. (D) hücre tek bir katman ve Eozinofilik yapıları kırmızı kan hücreleri, gösterge parçalanmayabilir varlığı ile karakterize vasküler yapılar (Kırmızı oklar), birbirine kanalları (siyah ok) ile sık sık gözlenir. Düşük büyütme soldaki resimdeki gösterilir ve karşılık gelen bir yüksek büyütme resim sağda gösterilir. Bu görüntüleri H ile lekeli & E ve tenascin-c CD31 vasküler yapılar astar endotel hücreleri için olumlu bir işaret olarak kullanılmıştır. Büyük bir vasküler yapı hangi CD31 pozitif hücrelerinin gemi Lümen astar görülebilir gösterilir. Düşük büyütme soldaki resimdeki gösterilir ve karşılık gelen bir yüksek büyütme resim sağda gösterilir. (E) duktal alan luminal yuvası anahat için bir vektör (mavi renkle gösterilmiştir) kullanarak ölçüldü iken myoepithelial bölme anahat için bir vektör (gösterilen kırmızı) kullanarak bir α-SMA-lekeli görüntüde duktal çevresi ölçüldü. Stromal ve luminal bölmeleri arasında bölge duktal alanı olarak sınıflandırıldı. Ölçek çubuğu 50 µm. çevre ve alan ölçülü alanları vurgulayarak duktal yapısının şematik =. On-C: tenascin-c Şekil E histolojik bölümünde dan güncellenmiştir: Thompson C vd. 16 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gazetede, olduğu gibi fare meme dokuları duktal morfoloji ve ECM ifade aşağı akım histolojik analizler için yalıtmak için bir teknik anlatmıştık. Duktal Morfoloji analizleri ile ilgili olarak, duktal mimarisi lekeli histolojik kesitler kapalı tabanlı hızlı incelenmesi bu yöntemi sağlar. Duktal analizleri diğer yöntemleri görselleştirme duktal ağacının etkinleştirmek için boya teknik olarak zor ve zaman alıcı olabilir yöntemleri enjeksiyonlari güveniyor.
Meme Kanserinde ECM anormal olduğu bildirilmiştir. 1 , 2 , 6 , 9 özellikle, ECM bereket ve/veya cross-linking şekillerindeki değişiklikleri tümör ilerleme, metastaz ve terapi direnç3,4,6,7 etkilemeye bildirilmiştir ,8,9. Ayrıca, değişiklikleri ECM ortamında da potansiyel olarak tümör başlatma lehine bir durum için önde gelen duktal epitel hücre morfolojisi ve nükleer silahların yayılmasına karşı17, değiştirmek için rapor edilmiştir. Biz bir caveolin-1 eksik hayvan modeli ECM ifade ve duktal Morfoloji caveolin-1 kaybı aşağıdaki değişiklikler değerlendirmek için kullanılan iken, bir herhangi bir fare modeli bu yöntemleri uygulanabilir. ECM ifade desenleri ve duktal mimari değerlendirmek için aşağı akım histolojik analizler için bütün, olduğu gibi meme dokuları yalıtmak için bir teknik açıklar. Bu metodoloji sonuçlarından sağlam analizleri glandüler morfoloji ve ECM ifade vermiştir. Bu çözümleme ECM ifade, özellikle fibronektin, 100-200 µm yüzeysel doku kesit ve daha kapsamlı bir resmi glandüler fibrozis vermiştir boyama önce kaldırıldı bölümlerden bulduk. Ayrıca, biz eşek serum BSA aksine kullanımı daha iyi kaliteli histolojik örnekleri içinde non-spesifik boyama önemli ölçüde düşürülmüştür vermiştir bulundu.
Duktal mimari analizleri için içindeki doku sağlam ve içinde kırılma noktaları, uygun olmayan doku işleme sonucu kanalları içeren ve kesit, belirgin olmayan bölümleri kullanmak önemlidir. Ayrıca, doğru duktal şubeleri, bir dedektif ölçmek isteyebilirsiniz başka bir parametre ve kolayca kendi monolayer endotel tarafından tespit edilebilir damar yapıları ve Eozinofilik yapıları içinde ayırt etmek önemlidir Lümen CD31 ile boyama ek olarak. Kanalları çeşitli ECM protein, myoepithelial işaret αSMA ve H için lekeli bölümlerde gözlenen & E counterstaining, hangi hücresel bileşeni olarak kanallarının, kanalları numaralandırılmasına vurgulanmış ve ilişkili herhangi bir şube H ile ulaşılabilir & E lekeli doku bölümleri yalnız. Duktal morfogenez daha ayrıntılı analizlerini veya önceden neoplastik ve/veya neoplastik lezyonlar varlığı analizleri için bir dedektif confocal canlı ex vivo dokuları değerlendirmek için görüntüleme kullanmak isteyebilirsiniz. Bu durumda, hangi tüm bezleri eksize aynı tekniği fiksasyon ve adımları elimine işleme doku ile uygulanır.
Bu iletişim kuralı kritik adımlarda hangi #4 karın bezleri kesin tanımlaması etkin kalmayıp Ayrıca bezinin diseksiyon örten dermis ve temel karın zarını izin cerrahi mikro büyüteçler kullanımını içerir. Önemli subkutan doku ve kasları dışlama boyama ve Histoloji girişim yağ ilişkili azaltılmış. Buna ek olarak, daha iyi bezinin ECM ifade değişiklikleri tanımlamak için 100-200 µm kalan yağ dokuları ortadan kaldırmak yardımcı doku blok kaldırmak yararlı bulduk. Bütün meme bezi yalıtım stromal protein ifade ve duktal morfogenez geniş değişiklikler doku üzerinde bilgi sağlarken, açıklanan tekniği seri bölümler analizi için sabit üzerinden sınırlı, parafin dokularda gömülü. Hangi değişikliklerin dereceye duktal içinde kurmak için dallanma meydana gelmiştir, Bütün Dağı görüntüleme canlı, eski-vivo dokuların gerekli olacaktır. Burada, bir dedektif Cre-Lox bezi belirli protein etkileşimler ya da18Imaging önce duktal ağaç aydınlatmak için bir boya kullanmak için özel, koşullu floresan muhabir conjugations tasarlamak için kullanabilirsiniz. Buna ek olarak, daha fazla Batı leke veya kütle spektrometresi veya immunoprecipitation (klip) veya Kromatin cross-linking gibi diğer yüksek-den geçerek teknikleri kullanımı analiz proteinlerin bezinin bütünüyle ilgi gerektiren immunoprecipitation (ChIP). Bu durumda, tüm bezleri, küçük parçalar halinde kesitli ve aşağı akım analizleri için buna göre işlenmiş disseke. Buna ek olarak, bir de doku bölümlerde floresan görüntüleme kullanabilirsiniz. Bu teknik birden fazla protein ve protein ifade ortak yerelleştirme aynı doku analiz etmek için ideal olacaktır.
Özet olarak, biz bütün, olduğu gibi meme dokuları hızlı yalıtım sağlayan ve histolojik işleme ve duktal analizleri hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlar bir tekniğini tanımlamak. Bu tekniğin gelecekteki uygulamalar araştırmak ECM ifade ve tümörü taşıyan hayvanlarda duktal Morfoloji ilişkili değişiklikler. Ayrıca, kolajen Yönlendirme ve lif çapı, doku yoğunluğu, analiz etmek için yararlı olabilir bilgi analizleri bölümleri lekeli PSR üzerinde gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Nisan Wiles ve Dr. Roger Broderson sırasıyla hayvan nekropsi ve bezi yalıtım, hakkında yardım almak için kabul etmek istiyorum. Bu iş için fon Philadelphia üniversite osteopatik tıp merkezleri tarafından kronik bozuklukları, yaşlanma için destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
