Summary
Presenteren we een protocol voor de dubbele thymidine synchronisatie van HeLa cellen gevolgd door analyse met behulp van hoge resolutie confocale microscopie. Deze methode is de sleutel tot het verkrijgen van groot aantal cellen die zich synchroon van S-fase naar mitose, studies over mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies bezitten inschakelen.
Abstract
Studie van de verschillende regelgevende gebeurtenissen van de celcyclus in een fase-afhankelijke manier biedt een duidelijk inzicht over celgroei en deling. De synchronisatie van cel populaties in specifieke stadia van de celcyclus is gevonden zeer nuttig in dergelijke experimentele inspanningen. Synchronisatie van cellen door behandeling met chemische stoffen die relatief minder giftig zijn kan nuttig zijn over het gebruik van farmacologische remmende geneesmiddelen voor de studie van de daaruit voortvloeiende celcyclus gebeurtenissen en specifieke verrijking van geselecteerde mitotische fasen te verkrijgen. Hier beschrijven we het protocol voor synchroniseren menselijke cellen in verschillende stadia van de cel cyclus, met inbegrip van zowel in S-fase en M fase met een dubbele thymidine blok en vrijgeven van de procedure voor het bestuderen van de functionaliteit van de mitotische eiwitten in chromosoom uitlijning en segregatie. Dit protocol is uiterst nuttig voor het bestuderen van de mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die gevestigde interfase functies bezitten. In ons geval, kan de mitotische rol van Cdt1, een proteïne essentieel voor replicatie oorsprong licentieverlening in de G1-fase, effectief alleen wanneer G2/M-specifieke Cdt1 kan worden uitgeput worden bestudeerd. We beschrijven het gedetailleerd protocol voor uitputting van G2/M-specifieke Cdt1 met dubbele thymidine synchronisatie. We hebben ook uitleggen van het protocol van cel fixatie, en leven cel geschikt zijn met behulp van hoge resolutie confocale microscopie na thymidine release. De methode is ook handig voor het analyseren van de functie van de mitotische eiwitten onder zowel fysiologische en verontrust voorwaarden zoals Hec1, een onderdeel van het Ndc80 complex, omdat het een tot het verkrijgen van grote steekproeven van mitotische cellen voor vaste en levende cel in staat stelt analyse zoals we hier laten zien.
Introduction
In de celcyclus ondergaan cellen een aantal sterk gereguleerde en stoffelijk gecontroleerde gebeurtenissen voor de nauwkeurige duplicatie van hun genoom en proliferatie. Bij zoogdieren bestaat de celcyclus uit interfase en M-fase. In de interfase, die bestaat uit drie fasen - G1, S en G2, de cel duplicaten zijn genoom en ondergaat groei die nodig is voor de normale celcyclus progressie1,2. In de M-fase, die uit de mitose (profase, prometaphase, metafase, anafase, en telofase) en cytokinese bestaat, produceert een ouderlijke cel twee genetisch identieke dochtercellen. In de mitose, zuster chromatiden van gedupliceerde genoom zijn verkorte (profase) en op hun kinetochoren worden vastgelegd door de microtubuli van de geassembleerde mitotische spindel (prometaphase), drijft dat de uitlijning op de metafase-plaat (metafase), gevolgd door hun gelijk segregatie als zuster chromatiden zijn gesplitst naar en getransporteerd naar tegenovergestelde spindel palen (anafase). De twee dochtercellen worden fysiek gescheiden door de activiteit van een actine gebaseerde contractiele ring (telofase en cytokinese). De kinetochoor is een gespecialiseerde eiwithoudende structuur die in de centromeric regio van chromatiden assembleert en dienen als bijlage sites voor spindel microtubuli. Haar belangrijkste functie is te rijden van chromosoom vastleggen, uitlijning, en hulp bij het corrigeren van onjuiste spindel microtubulus bijlage, terwijl de spindel vergadering controlepost te handhaven van de trouw van het chromosoom segregatie3,4te bemiddelen.
De techniek van cel synchronisatie fungeert als een ideaal hulpmiddel voor het begrijpen van de molecuul- en structuurformule gebeurtenissen die betrokken zijn bij de celcyclus. Deze aanpak is gebruikt om te verrijken cel populaties in specifieke fasen voor verschillende soorten analyses, met inbegrip van profilering van genexpressie, analyses van cellulaire biochemische processen, en detectie van subcellular localisatie van eiwitten. Gesynchroniseerde zoogdiercellen kunnen worden gebruikt, niet alleen voor de studie van individuele genproducten, maar ook voor een aanpak met betrekking tot de analyse van hele genomen, met inbegrip van microarray analyse van gen expressie5, miRNA expressie patronen6, translationeel verordening7, en Proteoom analyse van eiwit wijzigingen8. Synchronisatie kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de effecten van genexpressie of eiwit knock-down of knock-out, of van chemische stoffen op de celcyclus.
Cellen kunnen worden gesynchroniseerd in de verschillende stadia van de celcyclus. Zowel de fysische en chemische methoden worden veel gebruikt voor de synchronisatie van de cel. De belangrijkste criteria voor synchronisatie van de cel zijn dat synchronisatie noncytotoxic en omkeerbaar moet. Vanwege de mogelijke negatieve cellulaire gevolgen cellen door farmacologische agenten te synchroniseren, kunnen afhankelijk van de chemische methoden nuttig zijn voor de studie van de celcyclus belangrijke gebeurtenissen. Bijvoorbeeld hydroxyurea, amphidicolin, mimosine en Lovastatine, kunnen worden gebruikt voor de synchronisatie van de cel in G1/S fase maar vanwege hun effect op de biochemische pathways, die ze remmen, ze activeren celcyclus checkpoint mechanismen en doden een belangrijke Fractie van de cellen9,10. Aan de andere kant, kan feedback remming van de DNA-replicatie door thymidine toe te voegen aan de groei-media, bekend als "thymidine blok", de celcyclus op bepaalde punten11,12,13arresteren. Cellen kunnen ook worden gesynchroniseerd op G2/M fase door behandeling met nocodazole en RO-33069,14. Nocodazole, waardoor microtubulus vergadering, heeft een relatief hoge cytotoxiciteit. Bovendien kunnen nocodazole-gearresteerd cellen terug naar interfase precociously door mitotische ontsporing. Dubbele thymidine blok arrestatie cellen in G1/S fase en na vrijlating uit het blok cellen worden gevonden om door te gaan synchroon door G2 en in de mitose. De normale voortgang van de celcyclus voor cellen verlost van thymidine blok kan worden waargenomen onder hoge resolutie confocale microscopie door cel fixatie of levende imaging. Het effect van verstoring van de mitotische eiwitten kan worden bestudeerd specifiek wanneer cellen invoert en ga door mitose na vrijlating uit dubbele thymidine blok. Cdt1, een multifunctionele eiwit, is betrokken bij het DNA replicatie oorsprong licentieverlening in de G1-fase en is ook vereist voor kinetochoor microtubulus bijlagen tijdens de mitose15. Studeren de functie van Cdt1 tijdens de mitose, moet men een methode die het effect van de uitputting op replicatie licenties tijdens de G1-fase, terwijl tegelijkertijd het verrichten van de uitputting specifiek tijdens de G2/M fase alleen vermijdt te hanteren. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen die zijn gebaseerd op de dubbele thymidine blok te bestuderen van de mitotische rol van eiwitten die meerdere functies tijdens verschillende stadia van de celcyclus door zowel vaste als live-cel imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dubbele Thymidine blok en Release: reagens preparaten
- Make 500 mL Dulbecco van bewerkt Eagle medium (DMEM) medium aangevuld met 10% FBS, penicilline en streptomycine.
- Maak 100 mM voorraad van thymidine in steriel water en winkel in aliquots bij-80 ° C.
2. protocol voor vaste cel beeldvorming van mitotische progressie (figuur 1A)
- Op dag 1, zaad ~ 2 x 105 HeLa cellen in de putjes van de plaat van een 6-well met een slip van de cover (gesteriliseerd met 70% ethanol en UV-bestraling) en 2 mL DMEM voedingsbodem. Het groeien van cellen in een bevochtigde incubator gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- 1st thymidine blok: op dag 2, meng grondig het vereiste volume van thymidine in verse DMEM media (100 mM voorraad, 2 mM eindconcentratie).
- Voeg toe 2 mL thymidine-bevattende media aan de cellen in elk putje van de 6-put plaat en incubeer gedurende 18 h.
- Op dag 3, gecombineerd het medium en wassen de cellen tweemaal met 2 mL 1 x PBS en eenmaal met verse voorverwarmde DMEM; het groeien van cellen in verse voorverwarmde DMEM medium voor 9u tot vrijlating van de cellen van het blok.
- 2nd thymidine blok: opnieuw, voeg 2 mL van thymidine-bevattende media (definitieve concentratie van 2 mM) aan de cellen in elk putje van de plaat 6-well.
- Incubeer gedurende een ander 18 h.
- Op dag 4, gecombineerd het medium en wassen de cellen tweemaal met 2 mL 1 x PBS en eenmaal met verse voorverwarmde DMEM.
- Verdunde siRNAs (controle en Cdt1) en transfectiereagens in serum gratis groeimedium voor 10 min. afzonderlijk meng ze samen en incubeer gedurende 20 min op RT. De uiteindelijke concentratie van siRNA gebruikt in elke transfectie was 100 nM. Het reactiemengsel toevoegen aan de cellen die zijn gewassen uit Thymidine.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 9-10 uur vrij te blokkeren en herstellen van de cellen op de cover slips met 4% cellen PFA voor 20 min op RT.
Let op: PFA is giftig, adequate bescherming dragen. -
Immunokleuring cellen, na permeabilizing met 0,5% (v/v) wasmiddel voor 10 min op RT en wassen van de cellen tweemaal met 1 x PBS voor elke 5 min.
- Het blokkeren van cellen met 1% BSA (w/v) in 1 x PBS voor 1 h bij RT gevolgd door behandeling van de cellen met 50 µL van primaire antilichamen (muis anti-α-tubuline antilichaam verdund op 1:1, 000, konijn anti-Zwint1 antistof verdund op 1:400 en muis anti-phospho-ɣ H2AX verdund op 1:300) bij 1% (m/v) BSA in 1 x PBS gedurende 1 uur bij 37 oC.
- Na het wassen uit de cellen met 1 x PBS driemaal, cellen met 50 µL van secundaire antilichamen voor elk cover-glas (Alexa 488 en Rhodamine rood in 1:250 verdunningen in 1% (m/v) BSA in 1 x PBS) behandelen gedurende 1 uur op RT.
- Na het wassen de cellen met 1 x PBS tweemaal voor elke 5 min, cellen met DAPI behandelen (0.1µg / mL in 1 x PBS) voor 5 min op RT.
- Plaats de cover slip geconfronteerd met cellen aan de juiste montage media op een duidelijke microscopische dia na het wassen de cellen met 1 x PBS tweemaal voor elke 5 min.
- Beeld de cellen voor de eiwitten immunostained met 60 X of 100 X 1.4 nb Plan-apochromatische DIC olie onderdompeling doelstelling gemonteerd op een omgekeerde hoge resolutie confocal microscoop uitgerust met een passende camera als nodig is voor de kwaliteit van beelden vereist.
- Verwerven beelden bij kamertemperatuur zoals z-stacks met dikte van 0,2 µm met behulp van software geschikt zijn voor de Microscoop.
3. protocol voor levende cellen beeldvorming van mitotische progressie (figuur 3A)
- Op dag 1, ongeveer 0,5-1 x 105 HeLa cellen stabiel mCherry-H2B en GFP-α-tubuline (iets variabele op basis van celtype en de eiwitten die zij uitdrukken) uitdrukken in 35 mm glas onder gerechten met 1,5 mL van DMEM medium zaad en ze groeien in een bevochtigde Incubator voor 24u op 37 oC en 5% CO2.
- 1st thymidine blok: op dag 2, voeg 1,5 mL thymidine-bevattende media aan de cellen in de schotel (100 mM thymidine, definitieve concentratie van 2 mM,).
- Incubeer gedurende 18 h.
- Op dag 3, het medium met thymidine gecombineerd en wassen van de cellen driemaal, tweemaal met 2 mL 1 x PBS en eenmaal met verse voorverwarmde DMEM.
- Verdunde siRNAs (controle en Hec1) en transfectiereagens met gratis groeimedium serum voor 10 min. afzonderlijk meng ze samen en incubeer gedurende 20 min op RT. De uiteindelijke concentratie van siRNA gebruikt in elke transfectie was 100 nM. Het reactiemengsel toevoegen aan de cellen die zijn gewassen uit Thymidine.
- Het groeien van cellen in 1,5 mL verse voorverwarmde DMEM voedingsbodem voor 8 h tot het vrijgeven van de cellen van het blok.
- 2nd thymidine blok: Voeg 1,5 mL thymidine-bevattende media (definitieve concentratie van 2 mM) aan de cellen in de schotel.
- Incubeer gedurende een ander 18 h.
- Op dag 4, gecombineerd het medium en wassen van de cellen driemaal, tweemaal met 2 mL 1 x PBS en eenmaal met verse voorverwarmde DMEM. Vervolgens groeien van cellen in verse voorverwarmde Leibovitz is (L-15) medium aangevuld met 10% FBS en 20 mM HEPES bij pH 7.0 voor 8 h tot het vrijgeven van de cellen van het blok.
- Zet de schotel in de temperatuur controle kamer instellen in de hoge resolutie confocal microscoop die ten minste 30 minuten voordat u begint met de beeldvorming om te stabiliseren de on-stage en experimentele temperaturen al heeft ontstoken.
- Focus op heldere gebied met 60 x doelstelling totdat cellen zichtbaar zijn, dan handmatig de on-stage ziften naar de regio van keuze.
- Instellen van het licht en laser macht/blootstelling, afbeelding overname parameters en duur van het experiment met behulp van de Microscoop afbeelding acquisitie software van keuze. Gebruik filters voor GFP (488 excitatie; 385 nm emissie) en mCherry (561 nm excitatie en 385 nm emissie) te verwerven van de beelden.
- De time-lapse experiment uitvoeren door afzonderlijk verwerven gepulseerde doorvallend licht en fluorescentie beelden elke 10 min voor een periode tot 16 h.
- Verwerven van beelden zoals twaalf 1.0 µm-gescheiden z-vliegtuigen om 9 h na vrijlating uit het blok van de dubbele thymidine softwarematig aan de Microscoop aangepast.
- Analyseren van de beelden voor het bijhouden van afzonderlijke cellen voor de mitotische progressie en tenslotte de bijbehorende film met de sourcesoftware Fiji/ImageJ monteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studie van de mitotische progressie en microtubulus stabiliteit in cellen vast na vrijlating uit dubbele thymidine blok
Cdt1 is betrokken bij de licentiëring van DNA replicatie oorsprong in de G1-fase. Het tijdens de S-fase is afgebroken, maar opnieuw accumuleert in G2/M fase. Om te bestuderen zijn rol in de mitose, moet de endogene Cdt1 worden uitgeput specifiek gericht is op de met behulp van de meest geschikte cel synchronisatie techniek, de dubbele thymidine blok15G/M-fase. Cellen werden met siRNAs onmiddellijk na vrijlating uit de 2nd thymidine blok, transfected wanneer cellen in de S fase en tegen die tijd de verlening van vergunningen voor replicatie oorsprong in G1, waarvoor ook Cdt1 functie, heeft lang afgerond. De uitputting van de Cdt1 na 9 h siCdt1 transfectie en dubbele thymidine blok release werd gevalideerd door het westelijke bevlekken (figuur 1B). Fixatie van de cellen 9 h na vrijlating uit het dubbele thymidine blok toont aan dat de meeste cellen in de metafase stadium in zowel controle als Cdt1 siRNA transfected cellen. Maar fixatie van de cellen 10 h na vrijlating uit het dubbele thymidine blok toont dat de meeste Cdt1 siRNA-behandelde cellen nog in late prometaphase stadium worden gearresteerd, terwijl cellen anafase invoeren en normaal hun chromosomen te als verwachte (Figuur 1 c scheiden ). Om te begrijpen van het effect van Cdt1 uitputting op kinetochoor-microtubulus (kMT) stabiliteit, werden cellen vastgesteld op 9 h na vrijlating uit dubbele thymidine blok, gevolgd door koude behandeling, die alleen stabiele kinetochoor-microtubuli (kMTs behoudt). De kMTs van Cdt1-verarmd cellen zijn relatief minder robuust na de koude behandeling vergeleken met die van de cellen (Figuur 1 d). Dus, met behulp van deze aanpak, de progressie van normale mitotische cellen na de verstoring van de functie van de mitotische expressie gebrachte eiwitten van belang kan worden bestudeerd effectief, zelfs zonder het gebruik van levende cellen imaging.
Figuur 2 toont dat het licentieverlening van DNA replicatie oorsprong is niet verstoord wanneer cellen zijn uitgeput van Cdt1 tijdens G2/M fase met behulp van onze protocol, dat ook in cellen waargenomen werd. Cellen uitgeput van Cdt1 tijdens G2/M fase heeft niet het induceren van accumulatie van gefosforyleerd ɣH2AX, een marker voor DNA-beschadiging, tijdens de daaropvolgende G2-fase; Overwegende dat siRNA transfectie van asynchrone culturen om afbrekende Cdt1 accumulatie van phospho-ɣH2AX-positieve foci, mogelijk als gevolg van DNA-schade veroorzaakt geïnduceerde door onjuiste DNA replicatie licentieverlening.
Studie van de mitotische progressie in cellen na vrijlating uit dubbele thymidine blok door levende cel imaging
Na de nucleaire envelop verdeling (NEB), normale cellen (in de afwezigheid van verstoring door een functionele mitotische eiwit) Voer mitose en ondergaan anafase begin om af te sluiten van mitose binnen ongeveer 30-60 min (figuur 3B). Maar RNAi-gemedieerde knockdown van Hec1, een belangrijke kinetochoor proteïne die nodig is voor de vorming van de bijlage van de robuuste kMT, is te vinden aan het vertragen van de normale mitotische progressie. In dit scenario de meeste cellen mitose Voer na de NEB, maar niet ondergaan anafase begin of mitose afmonsteren zelfs na enkele uren vertraging in de mitose (Figuur 3 c). Ook kan het effect van RNAi-gemedieerde knockdown van elke andere eiwit dat lokaliseert kinetochoren of met een functie tijdens de mitose dus effectief worden waargenomen met behulp van levende cellen imaging na vrijlating uit dubbele thymidine blokken. Naast het bestuderen van de aard van de mitotische progressie, vertraging en arrestatie, sommige van de andere belangrijke mitotische verschijnselen die kunnen worden bepaald met behulp van deze methode omvatten chromosoom uitlijning, de vorming van de mitotische spindel, en positionering van de activering en monddood maken van de spindel vergadering checkpoint.
Figuur 1: analyse van de mitotische progressie en de stabiliteit van kinetochoor microtubuli in vaste cellen na dubbele thymidine synchronisatie. (A) A schematische weergave van de cel synchronisatie, fixatie en immunofluorescentie. (B) westelijke vlek voor knockdown van Cdt1 na 9 h van release van 2de thymidine blok. (C) immunofluorescentie microfoto te tonen van de mitotische cellen vaste 9 en 10 h na vrijlating uit dubbele thymidine blok en behandeling met controle (boven) of Cdt1 siRNA (onder). Α-tubuline kleuring is in het rood, DNA in groen als cellen express GFP-Histone H2B. Schaal bar = 10 µm. Prometaphase en metafase cellen worden aangeduid met gele en witte pijlpunten respectievelijk. (D) HeLa cellen na behandeling met controle siRNA (bovenzijde) en na Cdt1 uitputting (onderste paneel) voor 9 h na vrijlating uit dubbele thymidine blok gevolgd door behandeling met ijskoude Leibovitz (L-15) medium en fixatie. Cellen werden gebeitste immuun voor spindel MT (groen) en een kinetochoor marker, Zwint1 (rood) en DAPI voor DNA in zwart-wit. Schaal bar = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Cdt1-uitputting tijdens G2/M fase doet niet erover replicatie licentieverlening. Asynchrone HeLa cellen behandeld met controle luciferase (bovenzijde) of cdt1 siRNAs (middelste deelvenster) of dubbele thymidine gesynchroniseerd HeLa cellen behandeld met cdt1 siRNA tijdens de 2nd thymidine wash-out gevolgd door fixatie ten 10 h na release (onderste paneel) werden gekleurd met DAPI (pseudo-gekleurde groen) en anti-phospho-ɣH2AX antilichaam (rood). Schaal Bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: analyse van de mitotische progressie door levende cel beeldvorming in gesynchroniseerd cellen. (A) A schematische weergave van de cel synchronisatie en levende cel beeldvorming. HeLa cellen stabiel mCherry-Histone H2B uitdrukken en GFP-α-tubuline werden uitgebracht van het blok van de dubbele thymidine gedurende 8 uur te laten overgaan tot G2/M fase van S fase arrestatie. Levende imaging werd uitgevoerd met behulp van een hoge resolutie confocal microscoop vanaf 8 h na het vrijgeven van de cellen van thymidine blok en voor maximaal 16 h vanaf dat punt verder. Hieronder zijn de stilstaande beelden uit de video gevangen elke 10 min voor controle cellen zonder verstoring van de mitotische eiwit (B) of voor uitgeput van de Hec1-subunit van de complexe Ndc80 (C) cellen. Schaal Bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste voordeel van dubbele thymidine synchronisatie is bevat het een uitgebreide steekproef-grootte van mitotische cellen in een korte tijd venster met veel van deze cellen invoeren van mitose in unison, waardoor ook analyses van chromosoom uitlijning, bipolaire spindel vorming en scheiding van het chromosoom met een veel hoger rendement.
Vele regelgevende eiwitcomplexen en signaalroutes zijn gewijd aan het waarborgen van de normale progressie door middel van mitose en deregulering van dit proces kan leidde tot tumorvorming. Levende cel beeldvorming van HeLa cellen stabiel mCherry-H2B en GFP-tubuline uitspreken en vrijgelaten uit de dubbele thymidine blok toont dat de meeste cellen hun chromosomen bij anafase binnen ongeveer 60 min na NEB (figuur 3B scheiden). Aan de andere kant, live cel beeldvorming van HeLa cellen verstoord met Hec1 functie laat zien dat de meeste cellen in de mitotische fase voor een lange periode met uitgelijnd chromosomen gevolgd door anafase begin of apoptosis (Figuur 3 c blijven).
Overtollige thymidine remt de synthese van DNA tijdens de S-fase, dus het blokkeren van cellen op G1/S fase11. Hoewel dubbele thymidine blok synchronisatie de meest gebruikte methode in de studie van de celcyclus en de mitotische progressie is, moet men kritisch ten aanzien van enkele van de beperkingen van deze methode. Nog belangrijker is, moet ervoor worden gezorgd dat de chemische stof heeft zijn uitgewassen grondig (voor 7-8 h) zodat het effect volledig omkeerbaar is en cellen doorgaan met normaal door de rest van de celcyclus installeren kunnen. Cellen kunnen anders niet het opgeven van de tweede cyclus veroorzaakt onjuiste progressie wel mitose. Het aandeel van gesynchroniseerde cellen wellicht niet voldoende hoog met een enkele thymidine blok en een dubbele thymidine blok kan nodig zijn te verhogen van het aantal gesynchroniseerde cellen, vooral als men is geïnteresseerd in het bestuderen van een bepaald stadium van de mitose. De duur van de behandeling van thymidine moet worden geoptimaliseerd als gevolg van verschillende gevoeligheid onder celtypes afhankelijk van de generatietijd. Bijvoorbeeld, hamster cellen hebben 16 h van tijd voor het genereren en worden behandeld met thymidine voor 11u voor optimale synchronisatie17. In deze studie, we getrakteerd HeLa cellen voor 16-18 h met thymidine. Bovendien, de overtollige thymidine niet alleen voorkomt dat DNA-herstelsynthese maar ook kan belangrijke breuken van de cellen11,12,18 doden en sluit aandacht moet worden besteed aan het controleren van dit verlies. De stockoplossing van thymidine in deze studie gebruikt moet worden voorbereid in steriel gedistilleerd water en grondig moet worden gemengd in de cel-cultuur-media, om te voorkomen dat zijn neerslag na toe te voegen aan media van siRNA transfected cellen, en ook om ervoor te zorgen de homogene verdeling rondom de gekweekte cellen.
Voor de studie van de functie van een target mitotische eiwit tijdens mitotische progressie, de cellen zou idealiter behandeld met siRNA knockdown de niveaus van de proteïne van belang tijdens het 1st thymidine blok of bij de introductie van de 1st thymidine blok, afhankelijk van de benodigde tijd voor het verkrijgen van efficiënte eiwit vechtpartij19,20,21. Aan de andere kant, voor de bestudering van de rol van multifunctionele eiwitten zoals Cdt1 tijdens de mitose, is het nodig voor de behandeling van de cellen met siCdt1 bij de introductie van de 2nd thymidine blok te verkrijgen G2/M specifieke uitputting. Cdt1 is een kritische speler in de verlening van DNA replicatie oorsprong15vergunningen. Om te begrijpen zijn gespecialiseerde rol tijdens de mitose zonder interferentie met haar rol in het verlenen van vergunningen, moet Cdt1 worden uitgeput specifiek op G2/M fase, die worden efficiënt door dubbele thymidine synchronisatie bereikt kan, dus het vermijden van de noodzaak om de toevlucht nemen tot andere mitose-specifieke perturbation benaderingen die moeilijk uit te voeren. Uitputting van de Cdt1 in de asynchrone culturen induceren DNA schade reactie als gevolg van de onderbreking van de licentiëring van DNA replicatie oorsprong, die zou op zijn beurt hebben verward de analyse van een mogelijke functie voor dit eiwit tijdens de mitose. Dus, de dubbele thymidine synchronisatie techniek biedt een unieke experimentele aanpak voor het genereren van cellen die onderging een normale G1 en S-fase, maar miste Cdt1 functie tijdens G2 en M-fase. De bijzondere betekenis van onze protocol voor gegevenssynchronisatie ligt in de remming van de multifunctionele eiwitten in de specifieke fase (G2/M) te bestuderen van hun nieuwe functies tijdens de mitose. Dus, is deze methode nuttig zijn niet alleen te onderzoeken van de rol van proteïnen die meerdere functies tijdens verschillende celcyclus stadia hebben, maar ook van die van eventuele mitotische eiwit in het proces van chromosoom uitlijning, kMT bijlagen en chromosoom segregatie zullen.
Voor levende cellen imaging, na vrijlating uit het dubbele thymidine blok, cellen moeten worden geïncubeerd in voorverwarmde Leibovitz (L-15) medium aangevuld met 10-20% FBS tot het begin van de beeldvorming. De cellen invoeren mitose op variabele tijd punten na vrijlating uit thymidine blok afhankelijk van het celtype. De begintijd van het vastleggen van het beeld of fixatie moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van het celtype. Voor levende cellen imaging, kan het gebruik van conventionele confocale microscopie photobleaching tijdens langdurige imaging veroorzaken. Aan de andere kant, geeft de hoge resolutie confocale microcopy een beeld van het duidelijke en hoge resolutie met de minste hoeveelheid photobleaching effecten.
De kritische stappen in dit protocol zijn de duur van thymidine behandeling, juiste wegspoeling van de thymidine, de timing van siRNA transfectie, en de timing van de start voor imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële interesse hebben.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan Dr Kozo Tanaka van de Universiteit van Tohoku, Japan voor het delen van HeLa cellen stabiel uiting van mCherry-Histone H2B en GFP-α-tubuline. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NCI aan DV (R00CA178188) en start-up middelen van de Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 °C |
| Leibovitz’s (1x) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 °C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 °C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1,000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 °C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35 mm Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
