Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.
Abstract
Studie der verschiedenen Ereignisse, Regulierung des Zellzyklus in einer Phase-abhängigen Weise liefert ein klares Verständnis über Zelle Wachstum und Teilung. Die Synchronisation von Zell-Populationen in bestimmten Phasen des Zellzyklus wurde festgestellt, als sehr nützlich in diesem experimentellen bemühen. Synchronisation von Zellen durch Behandlung mit Chemikalien, die relativ weniger toxisch sind kann vorteilhaft sein, über die Verwendung von pharmakologischen hemmenden Medikamenten für die Studie der konsequente Zellzyklus Ereignisse und spezifische Anreicherung von ausgewählten mitotischen Phasen zu erhalten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Synchronisierung menschliche Zellen in den verschiedenen Phasen der Zelle Zyklus, einschließlich der beiden in S und M-Phase mit einem doppelten Thymidin-Block und Verfahren zur Untersuchung der Funktionalität der mitotischen Proteine im Chromosom Ausrichtung lassen und Segregation. Dieses Protokoll wurde äußerst nützlich für das Studium der mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die etablierten Interphase Funktionen besitzen. In unserem Fall kann die mitotische Rolle der Cdt1, entscheidend für die Replikation Herkunft Lizenzierung in G1-Phase, ein Protein effektiv studiert werden, nur wenn G2/M-spezifischen Cdt1 aufgebraucht werden können. Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Abbau der G2/M-spezifischen Cdt1 mit doppelten Thymidin-Synchronisation. Wir erklären das Protokoll der Zelle Fixierung auch live Cell Imaging mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie nach Thymidin-Release. Die Methode ist auch nützlich für die Analyse der Funktion der mitotischen Proteine unter physiologischen und gestörten Bedingungen wie z. B. für Hec1, ein Bestandteil der Ndc80 Komplex, da es eine zu große Stichproben der mitotischen Zellen für feste und live Zelle ermöglicht Analyse wie wir hier zeigen.
Introduction
In den Zellzyklus durchlaufen Zellen eine Reihe von stark regulierten und zeitlich gesteuerte Events für die genaue Vervielfältigung ihrer Genom und Verbreitung. Bei Säugetieren bestehend aus den Zellzyklus Interphase und M-Phase. In Interphase, bestehend aus drei Stufen - G1, S und G2, die Zelle seines Genoms dupliziert und Wachstum, die notwendig ist für normale Zellzyklus Progression1,2erfährt. In der M-Phase, bestehend aus Mitose (Prophase, prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase) und Cytokinese, produziert eine elterliche Zelle zwei genetisch identische Tochterzellen. In Mitose, Schwester Chromatiden des doppelten Genoms sind verdichtete (Prophase) und sind an ihren Kinetochore von Mikrotubuli der montierten mitotischen Spindel (prometaphase) erfasst, das treibt ihre Ausrichtung an der Metaphase-Platte (Metaphase) gefolgt von ihrer gleich Trennung, wenn Schwester Chromatiden sind aufgeteilt in Richtung und transportiert zum gegenüberliegenden Spindel (Anaphase) Polen. Die zwei Tochterzellen sind räumlich getrennt von der Aktivität eines Actin-basierte kontraktilen Rings (Telophase und Cytokinese). Das Kinetochor ist eine spezialisierte proteinhaltige Struktur, die in der Zentromer-Region der Schwesterchromatiden montiert und dienen als Befestigung Standorte für Spindel Mikrotubuli. Seine Hauptfunktion ist zu fahren Chromosom erfassen, Ausrichtung, und Hilfe bei der Korrektur unsachgemäße Spindel Mikrotubuli Anlage, bei der Vermittlung des Spindel Baugruppe Prüfpunkt um die Treue des Chromosom Abtrennung3,4zu erhalten.
Die Technik der Zelle Synchronisation dient als ideales Werkzeug für die molekulare und strukturelle Ereignisse im Zellzyklus Fortschreiten zu verstehen. Dieser Ansatz wurde zur Zell-Populationen in bestimmten Phasen für verschiedene Arten von Analysen, einschließlich der gen-Expression profiling Analysen der zelluläre biochemische Prozesse und Erkennung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen zu bereichern. Synchronisierte Säugerzellen können nicht nur für das Studium der einzelnen Gen-Produkte, sondern auch für Ansätze mit Analyse der ganzer Genome Microarray Analyse des Gens Ausdruck5, MiRNA Ausdruck Muster6einschließlich verwendet werden, Translational Regelung7und Proteomic Analyse von Protein-Modifikationen-8. Synchronisation kann auch verwendet werden, Studie zu den Auswirkungen der gen-Expression oder Protein Knock-down oder Knock-out- oder Chemikalien auf Zellzyklus Fortschreiten.
Zellen können in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus synchronisiert werden. Physikalische und chemische Methoden sind für die Zelle Synchronisation verbreitet. Die wichtigsten Kriterien für die Synchronisierung der Zelle sind, dass Synchronisation noncytotoxic und reversibel sein sollte. Wegen der potenziellen nachteiligen zellulären folgen Zellen durch pharmakologische Wirkstoffe zu synchronisieren können chemisch-abhängige Methoden für die Untersuchung wichtigen Zellzyklus Veranstaltungen vorteilhaft sein. Z. B. Hydroxyurea, Amphidicolin, Mimosine und Lovastatin, einsetzbar für Zelle Synchronisation am G1/S-Phase aber, wegen ihrer Wirkung auf die biochemischen Bahnen, die sie hemmen sie Zellzyklus Checkpoint Mechanismen zu aktivieren und töten einen wichtigen Bruchteil der Zellen9,10. Auf der anderen Seite kann Feedback-Hemmung der DNA-Replikation durch Zugabe von Thymidin, Wachstumsmedien, bekannt als "Thymidin-Block" Zellzyklus bei bestimmten Punkten11,12,13verhaften. Zellen können auch durch die Behandlung mit Nocodazole und RO-33069,14in G2/M-Phase synchronisiert werden. Nocodazole, die Montage von Mikrotubuli verhindert, hat eine relativ hohe Zytotoxizität. Darüber hinaus können Nocodazole verhaftet Zellen zurück altklug durch mitotische Schlupf interphase. Doppelte Thymidin Block Verhaftung-Zellen am G1/S-Phase und nach der Entlassung aus dem Block, sind Zellen gefunden, synchron durch G2 und in Mitose vorzugehen. Die normale Progression des Zellzyklus für Zellen befreit Thymidin-Block kann unter hochauflösenden konfokalen Mikroskopie durch Zelle Fixierung oder live Imaging beobachtet werden. Die Auswirkungen der Störung der mitotischen Proteine kann studiert werden, besonders dann, wenn Zellen eingeben und fahren Sie durch Mitose nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Block. Cdt1, ein multifunktionales Protein ist beteiligt an der DNA-Replikation Herkunft Lizenzierung in der G1-Phase und ist auch während der Mitose15für Kinetochor-Mikrotubuli-Anlagen erforderlich. Um die Funktion des Cdt1 während der Mitose zu studieren, braucht man eine Methode zu verabschieden, die die Wirkung von seiner Erschöpfung zur Replikation Lizenzierung während der G1-Phase, während gleichzeitig bewirken seine Erschöpfung speziell in der G2/M-Phase nur vermeidet. Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle basierend auf der doppelten Thymidin-Block zur Untersuchung der mitotischen Rolle von Proteinen, die mehrere Funktionen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus von festen und live-Cell Imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. doppelter Thymidin sperren und freigeben: Reagenz Vorbereitungen
- Machen 500 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) Medium mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin ergänzt.
- Machen Sie 100 mM Lager von Thymidin in sterilem Wasser oder Store in Aliquote bei-80 ° C.
2. Protokoll für feste Cell Imaging der mitotischen Progression (Abbildung 1A)
- Am Tag 1, Samen ~ 2 x 105 HeLa-Zellen in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit einem Deckglas (mit 70 % Ethanol und UV-Bestrahlung sterilisiert) und 2 mL DMEM Medium. Wachsen Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
- 1St Thymidin Block: am 2. Tag, mischen Sie die erforderliche Menge Thymidin in frischen DMEM Medien (100 mM Lager, 2 mM Endkonzentration).
- Fügen Sie 2 mL Thymidin-haltigen Medien auf die Zellen in jede Vertiefung des 6-Well Platte und 18 h inkubieren.
- Am 3. Tag aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM; wachsen Sie Zellen in frisch vorgewärmte DMEM Medium für 9 h Zellen aus Block freizugeben.
- 2Nd -Thymidin-Block: erneut hinzufügen 2 mL Thymidin-haltigen Medien (2 mM Endkonzentration) auf die Zellen in jede Vertiefung des 6-Well-Platte.
- Ein weiterer 18 h inkubieren.
- Am Tag 4 aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM.
- Verdünnte SiRNAs (Kontrolle und Cdt1) und Transfection Reagens in Serum frei Wachstumsmedium für 10 min. separat mischen sie zusammen und 20 min bei RT inkubieren Die Endkonzentration von SiRNA verwendet in jeder Transfektion betrug 100 nM. Fügen Sie das Reaktionsgemisch auf die Zellen, die aus Thymidin gewaschen worden sind.
- Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 9-10 h von der Blockierung lösen und befestigen der Zellen auf der Abdeckung rutscht mit 4 % PFA für 20 min bei RT
Achtung: PFA ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen. -
Immunostain Zellen, nach dem permeabilizing mit 0,5 % (V/V) Reinigungsmittel für 10 min bei RT und die Zellen zweimal mit 1 X PBS für 5 min waschen.
- Sperren von Zellen mit 1 % BSA (w/V) mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei RT gefolgt von Behandlung von Zellen mit 50 µL Primärantikörper (Maus Anti-α-Tubulin Antikörper verdünnt 1:1, 000, Kaninchen-Anti-Zwint1-Antikörper verdünnt 1: 400 und Maus, die Anti-Phospho-ɣ H2AX bei 1: 300 verdünnt) bei 1 % (w/V) BSA mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei 37 oC.
- Nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS dreimal, Behandlung von Zellen mit 50 µL Sekundärantikörper für jedes Cover-Glas (Alexa 488 und Rhodamine Red bei 1: 250 Verdünnungen in 1 % (w/V) BSA mit 1 X PBS-Puffer) für 1 h bei RT
- Nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS zweimal für jeweils 5 min., Behandlung von Zellen mit DAPI (0.1µg / mL in 1 X PBS) für 5 min bei RT
- Legen Sie nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS zweimal für 5 min, das Deckglas mit Blick auf Zellen an die entsprechenden Montage-Medien auf einer klaren mikroskopische Folie.
- Bild der Zellen für die Immunostained Proteine mit 60 X oder 100 X 1,4 NA Plan-apochromatische DIC Öl eintauchen Ziel auf eine invertierte hochauflösende confocal Mikroskop, ausgestattet mit einer geeigneten Kamera als notwendig für die Qualität der Bilder erforderlich montiert.
- Abrufen von Bildern bei Raumtemperatur Z-Stapel von 0,2 µm Dicke mit Software für das Mikroskop nach Bedarf.
3. Protokoll für Live Cell Imaging der mitotischen Progression (Abbildung 3A)
- Am 1. Tag Saatgut ca. 0,5-1 x 105 HeLa-Zellen stabil mCherry-H2B und GFP-α-Tubulin (leicht variabel je nach Zelle Art und die Proteine, die sie zum Ausdruck bringen) in 35 mm unten Glasschalen mit 1,5 mL DMEM Medium ausdrücken und in eine befeuchtete wachsen Inkubator für 24 h bei 37 oC und 5 % CO2.
- 1St Thymidin Block: am 2. Tag, fügen Sie 1,5 mL Thymidin-haltigen Medien, um die Zellen in der Schale (100 mM Thymidin, 2 mM Endkonzentration).
- 18 h inkubieren.
- Am 3. Tag aspirieren Sie Thymidin-haltigem Medium und waschen Sie die Zellen dreimal, zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM.
- Verdünnte SiRNAs (Kontroll- und Hec1) und Transfection Reagens mit Serum frei Wachstumsmedium für 10 min. separat mischen sie zusammen und 20 min bei RT inkubieren Die Endkonzentration von SiRNA verwendet in jeder Transfektion betrug 100 nM. Fügen Sie das Reaktionsgemisch auf die Zellen, die aus Thymidin gewaschen worden sind.
- Wachsen Sie Zellen in 1,5 mL frisch vorgewärmte DMEM Medium für 8 h, Zellen aus Block freizugeben.
- 2Nd -Thymidin-Block: Fügen Sie 1,5 mL Thymidin-haltigen Medien (2 mM Endkonzentration) auf die Zellen in der Schale.
- Ein weiterer 18 h inkubieren.
- Am 4. Tag aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal, zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM zu. Dann wachsen Zellen in frisch vorgewärmte Leibovitz ist (L-15) Medium ergänzt mit 10 % FBS und 20 mM HEPES bei pH 7,0 für 8 h, Zellen aus dem Block freizugeben.
- Legen Sie die Schale in die Temperatur Kontrollkammer inmitten der hochauflösende confocal Mikroskop, die bereits auf mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung zur Stabilisierung der Temperaturen auf der Bühne und experimentelle gewechselt hat.
- Fokussieren im Hellfeld mit Objektiv 60 X bis Zellen sichtbar sind, und klicken Sie dann manuell in die Region der Wahl der auf der Bühne zu sichten.
- Licht und Kraft/Laserbelichtung, Erwerb Bildparameter und Dauer des Experiments mit der Mikroskop-Bild-Datenerfassungs-Software der Wahl einrichten. Verwenden Sie Filter für GFP (488 Erregung; 385 nm Emission) und mCherry (561 nm Anregung und 385 nm Emission) Bilder zu erwerben.
- Führen Sie die Zeitraffer-Experiment durch gepulste Durchlicht separat zu erwerben und Fluoreszenz Bilder alle 10 Minuten für einen Zeitraum bis zu 16 h.
- Abrufen von Bildern zwölf 1,0 µm getrennt Z-Ebenen um 9 Uhr nach der Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block mit Software das Mikroskop nach Bedarf.
- Analysieren Sie die Verfolgung einzelner Zellen für mitotischen Progression Bilder zu und schließlich montieren Sie den entsprechenden Film mit den Fidschi-Inseln/ImageJ-Source-Software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studie der mitotischen Progression und Mikrotubuli Stabilität in den Zellen fest nach Entlassung aus dem Thymidin-block
Cdt1 engagiert sich bei der Lizenzierung der DNA-Replikation Ursprünge in der G1-Phase. Es wird abgebaut, während der S-Phase aber wieder sammelt sich im G2/M-Phase. Um ihre Rolle bei der Mitose zu untersuchen, muss der endogenen Cdt1 speziell auf die mit der am besten geeigneten Zelle Synchronisation Technik, die doppelte Thymidin Block15G/M-Phase aufgebraucht sein. Zellen wurden unmittelbar nach Entlassung aus der 2Nd -Thymidin-Block mit SiRNAs transfiziert, wenn Zellen in der S phase und in welcher Zeit die Lizenzierung von Replikation Ursprung in G1, das auch Cdt1 Funktion benötigt, lange abgeschlossen wurde. Die Erschöpfung der Cdt1 nach 9 h siCdt1 Transfektion und doppelte Thymidin Blockunterricht wurde von Western blotting (Abbildung 1 b) validiert. Fixierung der Zellen 9 h nach Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block zeigt, dass die meisten Zellen in der Metaphase Stadium Kontrolle und Cdt1 SiRNA transfizierten Zellen. Fixierung der Zellen 10 h nach der Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block zeigt aber, dass die meisten Cdt1 SiRNA-behandelten Zellen noch im Spätstadium prometaphase verhaftet sind, während Kontrollzellen geben Sie Anaphase und normalerweise ihre Chromosomen zu, als erwartet (Abbildung 1 trennen ). Um die Wirkung der Cdt1 Erschöpfung am Kinetochor-Mikrotubuli (kMT) Stabilität zu verstehen, wurden Zellen um 9 Uhr nach Entlassung aus dem fixiert doppelte Thymidin Block gefolgt von Kältebehandlung, die behält nur stabile Kinetochor-Mikrotubuli (km). Die km Cdt1 erschöpft Zellen sind relativ weniger robust nach Kältebehandlung im Vergleich zu der Kontrollzellen (Abbildung 1). Somit kann mit diesem Ansatz, das Fortschreiten der normalen mitotischen Zellen nach der Störung der Funktion der mitotischen benutzt von Interesse wirksam, auch ohne die Verwendung von live Cell Imaging untersucht werden.
Abbildung 2 zeigt, dass die Lizenzierung der DNA-Replikation Herkunft nicht gestört ist, wenn Zellen des Cdt1 aufgebraucht sind, in der Phase G2/M mit unserem Protokoll, das auch in Kontrollzellen beobachtet wurde. Zellen in der Phase G2/M der Cdt1 erschöpft nicht dazu veranlassen, Anhäufung von phosphorylierten ɣH2AX, ein Marker für DNA-Schäden, während die nachfolgenden G2-Phase; während SiRNA Transfektion von asynchronen Kulturen, Cdt1 zum Abbau Anhäufung von Phospho-ɣH2AX-positiven Herde, möglicherweise aufgrund von DNA-Schäden durch unsachgemäße DNA Replikation Lizenzierung induzierte induziert.
Studie der mitotischen Progression in Zellen nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Block von live Cell imaging
Nach der Kernhülle Zusammenbruch (NEB) normale Zellen (in Abwesenheit von Störung durch eine funktionale mitotischen Protein) geben Sie Mitose und Anaphase Beginn zum Verlassen der Mitose innerhalb von ca. 30-60 min (Abb. 3 b) zu unterziehen. Aber RNAi-vermittelten Knockdown von Hec1, ein wichtiger Kinetochor-Protein, das für robuste kMT Anlage Bildung benötigt wird festgestellt, dass um normale mitotischen Fortschreiten zu verzögern. In diesem Szenario die meisten Zellen Mitose nach der NEB, treten aber nicht unterziehen Anaphase Beginn oder Ausstieg aus Mitose auch nach mehreren Stunden Verzögerung bei der Mitose (Abbildung 3). Ebenso kann die Wirkung der RNAi-vermittelten Knockdown von anderen Protein, das Kinetochore oder mit einer Funktion während der Mitose lokalisiert so effektiv beobachtet werden, mithilfe von live Cell Imaging nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Blöcke. Neben dem Studium der Natur der mitotischen fortschreiten, Delay und Festnahme, die anderen wichtigen mitotischen Phänomene, die mit dieser Methode untersucht werden können gehören Chromosom Ausrichtung, mitotischen Spindel Bildung und Positionierung der Aktivierungs und Schweigen der der Spindel Montage Checkpoint.
Abbildung 1: Analyse der mitotischen Progression und die Stabilität der Kinetochor-Mikrotubuli in festen Zellen nach Thymidin-Synchronisation. (A) A schematische Darstellung der Zelle Synchronisation, Fixierung und Immunfluoreszenz. (B) Western-Blot für Knockdown von Cdt1 nach einer Entlassung aus dem 2. Thymidin-Block 9 h. (C) Immunfluoreszenz Mikrographen, der mitotischen Zellen zeigen feste 9 und 10 h nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Block und Behandlung mit Kontrolle (oben) oder Cdt1 SiRNA (unten). Α-Tubulin Färbung ist in rot, DNA ist in grün, wie Zellen GFP Histone H2B ausdrücken. Maßstabsleiste = 10 µm. Prometaphase und Metaphase Zellen sind gekennzeichnet mit gelben und weißen Pfeilspitzen bzw.. (D) HeLa Zellen nach Behandlung mit Kontrolle SiRNA (Oberseite) und Cdt1 Erschöpfung (Bodenplatte) für 9 h nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin Block gefolgt von der Behandlung mit eiskalten Leibovitz (L-15) Medium und Fixierung. Zellen waren immun für Spindel MT (grün) und ein Kinetochor-Marker, Zwint1 (rot) und DAPI für DNA in schwarz und weiß gefärbt. Maßstabsleiste = 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Cdt1-Abbau in der Phase G2/M nicht durcheinanderbringen Replikation Lizenzierung. Asynchrone HeLa-Zellen mit Kontrolle Luciferase (Oberseite) behandelt oder cdt1 SiRNAs (Mitte Platte) oder doppelte Thymidin synchronisiert HeLa-Zellen während der 2Nd Thymidin auswaschen gefolgt von Fixierung um 10 h mit cdt1 SiRNA behandelt nach der Entlassung (Bodenplatte) waren voller Flecken mit DAPI (Pseudo-grün) und Anti-Phospho-ɣH2AX Antikörper (rot). Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Analyse der mitotischen Progression von live Cell imaging in synchronisiert Zellen. (A) A schematische Darstellung der Zelle Synchronisation und live Cell Imaging. HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck mCherry-Histon H2B und GFP-α-Tubulin erschienen von doppelten Thymidin-Block für 8 h, G2/M-Phase von S Phase Verhaftung gehen lassen. Live Bildgebung erfolgte mit einem hochauflösenden konfokalen Mikroskop ab 8 h nach Freigabe der Zellen von Thymidin-Block und weiterhin für bis zu 16 h ab diesem Zeitpunkt. Hier sind die Standbilder aus dem Video erfasst alle 10 min für Kontrollzellen ohne Störung mitotischen Protein (B) oder Zellen von der Hec1-Untereinheit des komplexen Ndc80 (C) erschöpft. Maßstabsleisten = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der wichtigsten Vorteil der doppelten Thymidin-Synchronisation ist, dass es eine höhere Stichprobengröße der mitotischen Zellen in einem kurzen Zeitfenster viele dieser Zellen in Mitose unisono bietet, wodurch auch Analysen von Chromosom Ausrichtung, bipolar Spindel-Bildung und Chromosom Segregation mit wesentlich höheren Wirkungsgrad.
Viele regulatorische Proteinkomplexe und Signalwege sind dafür normale Progression durch Mitose gewidmet und Deregulierung dieses Prozesses kann führte zu Tumorgenese. Live Cell Imaging von HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck mCherry-H2B und GFP-Tubulin und befreit die doppelte Thymidin Block zeigt, dass die meisten Kontrollzellen ihre Chromosomen bei Anaphase innerhalb von ca. 60 min nach NEB (Abb. 3 b) zu trennen. Auf der anderen Seite live Cell Imaging von HeLa-Zellen gestört, mit Hec1-Funktion zeigt, dass die meisten Zellen in der mitotischen Phase über einen längeren Zeitraum mit falsch ausgerichtete Chromosomen gefolgt von Beginn der Anaphase oder Apoptose (Abbildung 3).
Überschüssige Thymidin hemmt DNA-Synthese in der S-Phase, so blockieren Zellen am G1/S Phase11. Doppelte Thymidin-Block-Synchronisation ist, zwar die am häufigsten verwendete Methode in der Studie des Zellzyklus und mitotischen fortschreiten muss man einige Einschränkungen dieser Methode kritisch gegenüber. Wichtiger ist, muss es sichergestellt werden, dass die Chemikalie gründlich (für 7-8 h) gewaschen worden ist so dass der Effekt vollständig reversibel ist und Zellen können im weiteren Verlauf des Zellzyklus normal fortfahren. Zellen können sonst nicht den zweiten Zyklus verursacht unsachgemäße Fortschreiten aber Mitose eingeben. Der Anteil der synchronisierten Zellen möglicherweise nicht hoch genug, mit einem einzigen Thymidin-Block und ein doppelte Thymidin-Block kann erforderlich sein, die Zahl der synchronisierten Zellen, vor allem, wenn man interessiert ist, in einer bestimmten Phase der Mitose zu studieren. Die Dauer der Behandlung Thymidin muss aufgrund der unterschiedlichen Empfindlichkeit unter Zelltypen je nach Generation optimiert werden. Zum Beispiel Hamster Zellen haben 16 h der Generationszeit und mit Thymidin für 11 h für optimale Synchronisierung17behandelt. In dieser Studie behandelt wir HeLa-Zellen für 16-18 h mit Thymidin. Darüber hinaus kann überschüssige Thymidin nicht nur verhindert, dass DNA-Synthese, aber auch töten wichtige Bruchteile von Zellen11,12,18 und schließen Aufmerksamkeit muss bezahlt werden, um diesen Verlust zu überwachen. In dieser Studie verwendeten Thymidin Vorratslösung sollte in sterilem destilliertem Wasser zubereitet werden und sollte in den Zellkulturmedien seinen Niederschlag zu vermeiden, nach Medien von SiRNA hinzufügen Zellen transfizierten und auch die homogenen sicherzustellen gut durchgemischt werden Verteilung um die kultivierten Zellen.
Für das Studium der Funktion einer mitotischen Zielprotein während mitotischen Progression, die Zellen wäre idealerweise mit SiRNA, Zuschlag die Niveaus des Proteins des Interesses behandelt, entweder während der 1St -Thymidin-Block oder die Entlassung aus der 1. Thymidin-Block, je nach Zeitaufwand für effiziente Protein Knockdown19,20,21zu erhalten. Auf der anderen Seite für die Rolle des multifunktionalen Proteine wie Cdt1 während der Mitose zu studieren, ist es notwendig, die Zellen mit siCdt1 während der Freisetzung aus dem 2Nd -Thymidin-Block G2/M bestimmten Erschöpfung zu behandeln. Cdt1 ist eine kritische Spieler bei der Lizenzvergabe für DNA-Replikation Ursprünge15. Um seine spezielle Rolle während der Mitose zu verstehen, ohne seine Rolle bei der Lizenzierung zu stören, muss Cdt1 speziell auf G2/M-Phase, erschöpft sein, die durch doppelte Thymidin Synchronisierung effizient erreicht werden kann, wodurch der Bedarf an anderen Mitose-spezifische Störung Ansätze, die schwierig zu realisieren sind. Erschöpfung der Cdt1 in asynchronen Kulturen induzieren DNA Schäden Reaktion aufgrund der Unterbrechung der Lizenzierung von DNA-Replikation Origins, die wiederum die Analyse einer möglichen Funktion für dieses Protein während der Mitose durcheinandergebracht haben würde. So bietet die doppelte Thymidin-Synchronisation-Technik eine einzigartige experimentelle Herangehensweise um Zellen zu generieren, die unterzog sich eine normalen G1 und S-Phase, aber es fehlte ihm Cdt1 Funktion in G2 und M-Phase. Die besondere Bedeutung unserer Synchronisierung Protokoll liegt in der Hemmung der multifunktionalen Proteine in die konkrete Phase (G2/M), deren neuartige Funktionen während der Mitose zu studieren. Daher wird diese Methode nicht nur um die Rolle von Proteinen, die mehrere Funktionen in verschiedenen Zellzyklus Phasen haben, sondern auch, dass jede mitotische Protein in den Prozess der Chromosom-Ausrichtung, kMT Anhänge und Chromosom Abtrennung zu studieren nützlich sein.
Für das live Cell Imaging, nach der Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block Zellen inkubiert werden sollte, in vorgewärmte Leibovitz (L-15) Medium bis zum Beginn der Bildgebung mit 10-20 % FBS ergänzt. Die entsprechenden Körperzellen gelangen Mitose zu Variablen Zeitpunkten nach Entlassung aus dem Thymidin-Block je nach Zelltyp. Der Zeitpunkt des Beginns der Bildaufnahme oder Fixierung muss je nach Zelltyp optimiert werden. Für das live Cell Imaging, kann die Nutzung der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie Immunofluoreszenz während der langfristigen Bildgebung führen. Auf der anderen Seite gibt die hochauflösende konfokale Microcopy eine klare und hochauflösende Bild mit der geringsten Ausdehnung Immunofluoreszenz Effekte.
Die entscheidenden Schritte in diesem Protokoll sind die Behandlungsdauer Thymidin, richtige Auswaschung der Thymidin, das Timing von SiRNA Transfection und den Start-Zeitpunkt der Bildgebung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierendes finanzielles Interesse haben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass Dr. Kozo Tanaka der Tohoku University, Japan für den Austausch von HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck mCherry-Histon H2B und GFP-α-Tubulin. Diese Arbeit wurde durch ein NCI Zuschuss an DV (R00CA178188) und Starthilfe von der Northwestern University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 °C |
| Leibovitz’s (1x) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 °C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 °C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1,000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 °C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35 mm Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
