Summary
선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.
Abstract
연구 단계에 종속적으로 세포 주기의 다양 한 규제 이벤트의 세포 성장 및 부문에 대 한 명확한 이해를 제공합니다. 세포 인구 세포 사이클의 특정 단계에서 동기화 실험적인 노력에 매우 유용 하 게 발견 되었습니다. 치료는 상대적으로 덜 독성 화학 물질에 의해 세포의 동기화 연구 결과 세포 주기 이벤트 하 고 선택한 mitotic 단계의 특정 농축을 위한 약리 억제 약물의 사용을 통해 유리한 수 있습니다. 동기화 인간의 세포는 세포의 여러 단계에서 S 단계 및 이중 티 미 딘 블록와 M 단계 모두를 포함 하 여 주기 고 염색체 정렬에 mitotic 단백질의 기능을 공부에 대 한 절차를 공개 프로토콜 설명 하는 여기, 그리고 분리입니다. 이 프로토콜 설립된 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할을 공부 하는 데 매우 유용 했습니다. 우리의 경우에서 Cdt1, 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 대 한 중요 한 단백질의 mitotic 역할 수 수 공부 효과적으로 g 2/M-특정 Cdt1 고갈 될 수 있는 경우에. 우리는 더블 티 미 딘 동기화를 사용 하 여 g 2/M-특정 Cdt1의 고갈에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 셀 고정, 프로토콜을 설명 하 고 라이브 셀 이미징 티 미 딘 릴리스 후 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여. 방법은 하나 고정 및 라이브 셀 mitotic 세포의 큰 샘플 크기를 수 있습니다 Hec1, 복잡 한, Ndc80의 구성 요소와 같은 생리 적 및 교란 조건에서 mitotic 단백질의 기능을 분석 하는 데 유용도 분석으로 우리가 여기에 표시.
Introduction
세포 주기에서 세포 그들의 게놈 및 확산의 정확한 복제에 대 한 높은 규제 하 고 일시적으로 제어 이벤트의 시리즈를 받 다. 포유류에서 세포 주기 interphase 및 M으로 구성 됩니다. Interphase에 구성 된 3 단계-G1, S, 및 g 2 셀 그것의 게놈을 복제 하 고 정상적인 세포 주기 진행1,2에 필요한 증가 겪 습. M-단계에서 이루어진 유사 분열 (의향, prometaphase, 분열, anaphase, 및 telophase) cytokinesis, 부모의 셀 두 유전으로 동일한 딸 세포를 생성 합니다. 그 뒤 분열 중 기 격판덮개 (분열)에 그들의 정렬 드라이브 유사 분열, 중복 된 게놈의 chromatids 압축된 (의향) 이며 조립된 mitotic 스핀 들 (prometaphase)의 microtubules 잡혀 자신의 kinetochores에 자매 들 자매 chromatids는으로 분할 하 고 반대 스핀 들 이송 기둥 (anaphase) 분리를 동등한. 2 개의 딸 세포는 걸 기반으로 수축 성 반지 (telophase 및 cytokinesis)의 활동에 의해 물리적으로 구분 됩니다. kinetochore chromatids의 centromeric 지역에서 조립 전문된 배치할 구조 이며 스핀 들 microtubules에 대 한 첨부 파일 사이트 역할. 그것의 주요 기능은 염색체 캡처, 맞춤, 운전 하 여 염색체 분리3,4의 충실도 유지 하기 위해 스핀 들 어셈블리 검사점을 중재 하는 동안 부적 절 한 스핀 들 microtubule 첨부 파일 수정에 도움이입니다.
셀 동기화의 기술은 세포 주기 진행에 관련 된 분자 구조 이벤트를 이해 하기 위한 이상적인 도구 역할을 합니다. 이 접근은 다양 한 형태의 분석, 유전자 발현의 프로 파일링을 포함 하 여 세포질 생화학 과정의 분석 및 단백질의 subcellular 지 방화의 검출에 대 한 특정 단계에서 세포 인구를 풍부 하 게 사용 되었습니다. 개별 유전자 제품의 연구 뿐만 아니라 전체 게놈 유전자 식5, 미르 식 패턴6, microarray 분석 등의 분석을 포함 하는 방법에 대 한 동기화 된 포유류 세포를 사용할 수 있습니다. 변환 규칙7, 그리고 단백질 수정8의 proteomic 분석. 동기화는 또한 세포 주기 진행에 유전자 발현 이나 단백질 노크 다운 또는 노크-아웃, 또는 화학 물질의 효과 연구에 사용할 수 있습니다.
세포 세포 주기의 여러 단계에서 동기화 할 수 있습니다. 물리적, 화학적 방법은 널리 셀 동기화에 사용 됩니다. 셀 동기화에 대 한 가장 중요 한 기준은 동기화 되도록 noncytotoxic 하 고 되돌릴 수 있습니다. 동기화 약리학 대리인에 의해 세포의 잠재적인 불리 한 세포 결과, 때문에 화학 종속 방법을 공부 하는 주요 세포 주기 이벤트에 대 한 유리한 수 있습니다. 예를 들어 hydroxyurea, amphidicolin, mimosine, 그리고로 바 스타 틴, G1/S 단계에서 셀 동기화에 사용할 수 있습니다 하지만, 그들이 억제 생화학 경로에 그들의 효력 때문에 그들은 세포 주기 검문소 메커니즘을 활성화 하 고 중요 한 죽 셀9,10일부 다른 한편으로, "티 미 딘 블록"로 알려진 성장 매체에 티 미 딘을 추가 하 여 DNA 복제의 피드백 저해 특정 포인트11,,1213에 세포 주기를 체포 수 있습니다. 또한 nocodazole와로-33069,14처리 하 여 셀 G2/M 단계에 동기화 수 있습니다. Nocodazole, microtubule 어셈블리를 방지 하는 상대적으로 높은 세포 독성. 또한, nocodazole 체포 셀 interphase 조 mitotic 미끄럼으로 돌아갈 수 있습니다. 이중 티 미 딘 블록 체포 셀 g 1/S 단계에서 블록에서 출시 후, 셀 통해 G2 및 유사 분열으로 동시 진행을 찾을 수 있습니다. 티 미 딘 블록에서 발표 하는 세포의 세포 주기의 정상적인 진행 셀 고정 또는 라이브 영상으로 높은 해상도 confocal 현미경에서 관찰할 수 있습니다. 셀 입력 하 고 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 유사 분열을 통해 진행 하는 경우에 특히 mitotic 단백질의 섭 동 효과 공부 될 수 있다. Cdt1, 다기능 단백질 DNA 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 관련 된 이며, 유사 분열15중 kinetochore microtubule 첨부 파일에 대 한 필요 이기도. 유사 분열 동안 Cdt1의 기능을 공부 하나는 복제 라이센스만 G2/M 단계 동안 특히 그것의 소모를 초래 하는 동시에 g 1 단계에 고갈의 효과 방지 하는 방법을 채택 해야 합니다. 여기, 우리는 고정 및 라이브 셀 이미징에 의해 이중 티 미 딘 블록 세포 주기의 다른 단계 동안 여러 기능을 수행 하는 단백질의 mitotic 역할을 연구 하기에 따라 상세한 프로토콜 제시.
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Protocol
1. 더블 티 미 딘 블록 및 릴리스: 시 약 준비
- 500 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 매체와 10 %FBS, 페니실린, 스 보충을 확인 합니다.
- 살 균 물과 aliquots-80 ° c.에 있는 매장에서 티 미 딘 100 m m 재고 확인
2. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 1A)의 고정된 셀 이미징에 대 한
- 6 잘 플레이트 커버 슬립 (70% 에탄올과 UV 방사선 살 균)과 DMEM 매체의 2 mL의 우물으로 하루 1, 105 HeLa 세포 x 씨 ~ 2. 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 습도 인큐베이터에서 세포 성장.
- 1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 철저 하 게 신선한 DMEM 미디어 (100 m m 재고, 2mm 최종 농도)에 티 미 딘의 필요한 볼륨을 혼합.
- 티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 셀 6-우물의 각 음에 미디어 접시 및 18h에 품 어.
- 3 일에 매체를 발음 하 고 씻고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀과 신선한 prewarmed DMEM; 한 번 9 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체에서 세포를 성장 한다.
- 2차 티 미 딘 블록: 다시 티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 셀 6 잘 플레이트의 각 음에.
- 또 다른 18 h에 대 한 품 어.
- 4 일에 매체를 발음 하 고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀 및 신선한 prewarmed DMEM 한 번 씻어.
- (제어 및 Cdt1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체에 혼합 그들이 함께 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.
- 차단 해제 4% 커버 슬립에 셀을 수정 하 9-10 h 37 ° C에서 세포를 품 어 PFA 실시간에서 20 분
주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용. -
Immunostain 셀, RT에서 10 분 동안 0.5% (v/v) 세제 permeabilizing 및 5 분의 1 x PBS로 두 번 셀을 세척 후.
- 1 시간 뒤에 1% (w/v)에 1 차 항 체 (마우스 안티-α-tubulin 항 체 1:1, 000, 토끼 안티-Zwint1 항 체 희석 1:400, 및 안티-인-ɣ H2AX 희석 1:300에서 마우스에 희석)의 50 µ L로 세포를 치료 하는 RT에 대 한 1 x PBS에서 1 %BSA (w/v)으로 세포를 차단 1 x 1 h 37 oc.에 대 한 PBS에 BSA
- 씻은 후 1 x PBS로 세포 밖으로 몇 번이 고, 실시간에 1 시간에 50 µ L의 각 커버 유리 (알 렉 사 488와 1% (w/v) BSA 1 x PBS에서 1: 250 희석에 Rhodamine 빨간색)에 대 한 2 차 항 체와 세포 치료
- 씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, DAPI와 세포 치료 (0.1µg / mL 1 x PBS에) 실시간에서 5 분
- 씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, 셀 분명 현미경 슬라이드에 적절 한 설치 미디어를 직면 하 고 커버 슬립을 놓습니다.
- 60 X 100 X 1.4 나 계획 Apochromatic DIC 기름 침수 목표와 immunostained 단백질에 대 한 셀 필요한 이미지의 품질에 대 한 필요에 따라 적절 한 카메라를 장착 하는 거꾸로 높은 해상도 confocal 현미경에 장착 된 이미지.
- Z-스택 소프트웨어를 사용 하 여 0.2 µ m 두께의 현미경에 적합으로 실 온에서 이미지를 취득 합니다.
3. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 3A)의 라이브 셀 이미징에 대 한
- 하루에 1, 씨앗 약 0.5-1 x 105 HeLa 세포 안정적 DMEM 매체의 1.5 mL와 35 m m 유리 하단 요리에 mCherry H2B GFP-α-tubulin (약간 세포 유형 및 표현 하는 단백질을 기준으로 변수) 표현 하 고는 습도에 그들을 성장합니다 37 oC, 5% CO2에서 24 h에 대 한 보육.
- 1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 셀 접시 (100 m m 티 미 딘, 2mm 최종 농도)에 미디어.
- 18 h에 품 어.
- 3 일에 티 미 딘을 포함 하는 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어.
- (제어 및 Hec1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체와 함께 그들을 혼합 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.
- 8 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체의 1.5 ml에서 세포 성장.
- 2차 티 미 딘 블록: 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 접시에 셀.
- 또 다른 18 h에 대 한 품 어.
- 하루에 4, 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어. 그런 다음 셀을 성장에서 신선한 prewarmed Leibovitz의 (L-15) 중간 보충 10 %FBS 20 mM HEPES 8 h 블록에서 셀 출시를 위한 pH 7.0에서.
- 이미 무대와 실험 온도 안정 시키기 위해 이미징 시작 하기 전에 적어도 30 분에 전환 했다는 고해상도 confocal 현미경에 설정 온도 제어 챔버에 접시를 놓습니다.
- 셀 표시 될 때까지 60 x 목적으로 밝은 분야에 초점을 맞춥니다 다음 수동으로 선택의 영역에는 무대를 구별 합니다.
- 빛과 레이저 전원/노출, 이미지 수집 매개 변수 및 선택의 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 실험 기간을 설정 합니다. GFP (488 여기; 385 nm 방출) 및 mCherry (561 nm 여기 및 385 nm 방출) 이미지에 대 한 필터를 사용 합니다.
- 별도로 최대 16 h 동안 펄스 전송된 빛과 형광 이미지 마다 10 분을 획득 하 여 시간 경과 실험을 수행 합니다.
- 현미경에 적합 한 소프트웨어를 사용 하 여 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 9 h는 12 1.0 µ m 구분 된 z 비행기로 이미지를 취득 합니다.
- Mitotic 진행에 대 한 개별 셀을 추적 하는 이미지를 분석 하 고 마지막으로 소스 소프트웨어 피지/ImageJ 해당 영화를 조립.
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Representative Results
Mitotic 진행 및 셀에서 microtubule 안정성의 연구에서 출시 후 두 티 미 딘 블록 고정
Cdt1 g 1 단계에서 DNA 복제 근원의 라이선스에 포함 된다. 그것은 S 단계 저하 하지만 다시 G2/M 단계에 축적. 공부 하 고 유사 분열에서의 역할, 생 Cdt1를 사용 하 여 가장 적합 한 셀 동기화 기법, 더블 티 미 딘 블록15G/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 필요가 있다. 셀에에서 있을 때 셀 S 단계 및 시간에 의해 또한 Cdt1 기능 필요, g 1에서 복제 근원의 라이선스 오래 완료 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 직후 siRNAs와 페 했다. 9 h siCdt1 transfection와 더블 티 미 딘 블록 출시 후 Cdt1 고갈 부 럽 (그림 1B)에 의해 검증 되었다. 고정 셀 9 h 이중 티 미 딘 블록에서 릴리스 보여줍니다 대부분 세포 분열 단계에서 제어 및 Cdt1 siRNA는 후의 transfected 세포. 그러나 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 셀 10 h의 고정 제어 셀 anaphase 입력 하 고 정상적으로 예상된 (그림 1C로 그들의 염색체를 분리 하는 동안 대부분 Cdt1 siRNA 치료 셀 prometaphase 단계에서 체포 여전히는 보여준다 ). Kinetochore-microtubule (kMT) 안정성에 Cdt1 고갈의 영향을 이해 하 셀 고정 했다 9 h에서 출시 후 더블 티 미 딘 블록 뒤에 감기 치료만 안정적인 kinetochore-microtubules (kMTs)를 유지. Cdt1 고갈 세포의 kMTs는 제어 셀 (그림 1D)에 비해 감기 치료 후 상대적으로 덜 강력한. 따라서,이 방법을 사용 하 여, 관심의 mitotic protein(s)의 함수의 섭 동 후 정상적인 mitotic 세포의 진행 수 수 공부 효과적으로, 라이브 셀 이미징의 사용 없이.
그림 2 는 DNA 복제 근원의 라이선스는 하지 불안정 세포는 또한 제어 셀에서 관찰 되었다 우리의 프로토콜을 사용 하 여 G2/M 단계 Cdt1 고갈 하는 경우를 보여 줍니다. 셀 g 2/M 단계 Cdt1의 고갈; 후속 g 2 단계 phosphorylated ɣH2AX, DNA 손상에 대 한 표시자의 축적을 유도 하지 않았다 반면 비동기 문화 Cdt1 고갈의 siRNA transfection 부적절 한 DNA 복제 라이센스에 의해 유도 된 DNA 손상으로 인해 인 ɣH2AX 양성 foci의 축적을 유도 한다.
라이브 셀 이미징에 의해 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 셀에 mitotic 진행의 연구
핵 붕괴 (코), 후 (기능 mitotic 단백질에 의해 섭 동 부재)에 정상 세포 유사 분열을 입력 하 고 약 30-60 분 (그림 3B) 내에서 유사 분열에서 종료 하려면 anaphase 발병을 받 다. 하지만 RNAi 중재 최저 Hec1, 강력한 kMT 첨부 형성에 필요한 키 kinetochore 단백질의 정상적인 mitotic 진행 지연 발견 된다. 이 시나리오에서 대부분 셀 코, 후 유사 분열을 입력 하지만 anaphase 발병을 받아야 하거나 마십시오 지연 유사 분열 (그림 3C)의 몇 시간 후에 유사 분열에서 종료. 마찬가지로, localizes kinetochores 또는 함수 유사 분열 동안에 다른 단백질의 최저 RNAi 중재의 효과 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 라이브 셀 이미징 사용 하 여 효과적으로 관찰 수 있다 따라서. Mitotic 진행, 지연 및 체포의 자연 공부, 함께이 메서드를 사용 하 여 분석 될 수 있는 다른 주요 mitotic 현상의 일부 염색체 정렬, mitotic 스핀 들 형성 및 활성화 위치 및의 입을 포함는 스핀 들 어셈블리 검사점입니다.
그림 1: mitotic 진행과 더블 티 미 딘 동기화 후 고정된 셀에 kinetochore microtubules의 안정성의 분석. (A) A 셀 동기화, 고정, 및 면역 형광의 도식 적인 표현입니다. (B) 2 티 미 딘 블록에서 방출의 9 h 후 Cdt1의 최저에 대 한 서쪽 오 점. (C) 표시 mitotic 세포 면역 형광 현미경 더블 티 미 딘 블록 및 제어 (위) 또는 Cdt1 siRNA (아래) 치료에서 출시 후 9, 10 h 고정. 빨간색에서은 α-tubulin 얼룩, DNA는 그린 셀 GFP 히스톤 H2B 익스프레스. 눈금 막대 = 10 µ m. Prometaphase 및 분열 세포 노란색을 사용 하 여 표시 됩니다 및 화살촉을 각각 화이트. (D) 헬러 세포 제어 siRNA (상단 패널)과 치료 후과에서 출시 후 9 h Cdt1 고갈 (하단 패널) 후 두 티 미 딘 블록 뒤에 얼음 처럼 차가운 Leibovitz (L-15) 치료 매체 및 고정. 세포 면역-스핀 들 MT (녹색) 및 Zwint1 (빨간색)와 흑인과 백인 dna DAPI kinetochore 마커 얼룩이 있었다. 눈금 막대 = 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: G2/M 단계 Cdt1 고갈 복제 라이센스 교란 하지 않습니다. 비동기 HeLa 세포 제어 luciferase (상단 패널)로 치료 또는 cdt1 siRNAs (중간 패널) 또는 더블 티 미 딘 동기화 HeLa 세포는 2nd 티 미 딘 워시 아웃 뒤에 10 h에 고정 하는 동안 cdt1 siRNA로 치료 릴리스 (하단 패널) 후 DAPI (의사 색된 녹색)와 안티-인-ɣH2AX 항 체 (레드) 얼룩이 있었다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 라이브 셀 이미징에 의해 mitotic 진행의 분석 동기화 셀. (A) A 셀 동기화 및 라이브 셀 이미징의 도식 적인 표현입니다. 헬러 세포를 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B 표현 그리고 GFP-α-tubulin 8 h S 단계 체포에서 G2/M 단계로 진행을 위한 이중 티 미 딘 블록에서 발표 했다. 라이브 이미지는 티 미 딘 블록에서 셀을 공개 하 고 그 시점에서 최대 16 시간 계속 후 8 h를 시작 하는 높은 해상도 confocal 현미경을 사용 하 여 실시 되었다. 여기은 캡처한 모든 mitotic 단백질 (B)의 섭 동 없이 제어 세포 또는 세포는 Hec1 소 단위 복잡 한 Ndc80의 (C)의 고갈에 대 한 모든 10 분 비디오에서 스틸 이미지입니다. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이중 티 미 딘 동기화의 가장 중요 한 장점은 이러한 세포 유사 분열 염색체 맞춤, 양극의 분석 또한 활성화 한 마음으로 입력의 많은 짧은 시간 창에 mitotic 세포의 증가 샘플 크기 제공 훨씬 더 높은 효율성과 형성과 염색체 분리를 주축.
많은 규제 단백질 복합물 및 신호 통로 유사 분열을 통해 정상적인 진행을 보장에 헌신 하는 고이 과정의 규제 완화 수 있습니다 tumorigenesis. 라이브 셀 이미징 HeLa 세포 안정적으로 mCherry H2B와 GFP tubulin 그리고 대부분 제어 셀 코 (그림 3B) 후 anaphase 약 60 분 이내에 그들의 염색체 분리 이중 티 미 딘 블록 쇼에서 발표의. 다른 한편으로, Hec1 기능을 보여줍니다 대부분 셀 고르지 염색체 anaphase 발병 또는 apoptosis (그림 3C)와 오랜 기간 동안 mitotic 단계에 머물와 교란된 HeLa 세포의 세포 이미징 라이브.
초과 티 미 딘 따라서 G1/S 단계11에서 세포를 차단 S 단계에서 DNA 합성 억제. 이중 티 미 딘 블록 동기화는 가장 일반적으로 사용 되는 방법 세포 주기 및 mitotic 진행의 연구에서 하나이 방법의 제한 사항 중 일부의 중요 한 필요 합니다. 중요 한 것은, 그것은 그 화학 물질은 씻 겨 밖으로 철저 하 게 (h를 위한 7-8) 효과 되돌릴 하 고 세포를 세포 주기의 나머지 부분을 통해 정상적으로 진행 하는 것을 보장 될 필요가 있다. 셀 수 있습니다 그렇지 않으면 부적절 한 진행 하지만 유사 분열 일으키는 두 번째 주기를 입력 하지. 동기화 된 셀의 비율 단일 티 미 딘 블록으로 충분히 높은 되지 않을 수 있습니다 그리고 하나는 유사 분열의 특정 단계를 공부에 관심이 있는 경우에 특히 이중 티 미 딘 블록 동기화 된 셀의 수를 증가 하는 데 필요한 수 있습니다. 티 미 딘 치료 기간 셀 형식 생성 시간에 따라 다른 감도 때문에 낙관 되어야 한다. 예를 들어 햄스터 세포의 생성 시간 16 h 있고 최적의 동기화1711 h 티 미 딘으로 취급 됩니다. 이 연구에서 우리는 HeLa 세포에 티 미 딘과 16-18 h에 대 한 치료. 또한, 초과 티 미 딘 뿐만 아니라 DNA 종합을 방지 하지만 또한 고 수 있습니다 셀11,,1218 의 중요 한 부분을 죽 일이 손실 모니터를 지불 될 필요가 관심을 닫습니다. 이 연구에 사용 된 티 미 딘 재고 솔루션 멸 균 증류수에 준비 되어야 한다 고 세포 배양 세포 페 siRNA의 미디어를 추가 후 그것의 강 수를 방지 하 고 또한 그것의 균질 성 보장에 철저 하 게 혼합 한다 배양된 세포 주위 분포입니다.
Mitotic 진행 하는 동안 대상 mitotic 단백질의 기능을 공부, 셀 이상적으로 것으로 치료 siRNA 최저에 관심사의 단백질의 레벨 1st 티 미 딘 블록 또는 1st에서 출시 하는 동안 티 미 딘 블록, 효율적인 단백질 최저19,20,21을 얻을 하는 데 필요한 시간에 따라. 다른 한편으로, 유사 분열 동안 Cdt1 등 다기능 단백질의 역할을 연구, 그것은 G2/M 특정 소모를 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 하는 동안 siCdt1 가진 세포를 치료 하는 데 필요한. Cdt1는 DNA 복제 기원15의 라이선스에서 중요 한 선수 이다. 라이선스의 역할을 방해 하지 않고 유사 분열 동안 그것의 전문화 된 역할을 이해, Cdt1 해야 효율적으로 더블 티 미 딘 동기화를 통해 달성 될 수 있다, G2/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 다른 리조트 필요가 피 실행 하기 어려운 유사 분열 전용 섭 동 접근. 비동기 문화에서 Cdt1의 고갈 것 차례로 muddled이 단백질에 대 한 가능한 함수의 분석 유사 분열 동안 DNA 복제 근원의 라이센스의 중단으로 인해 DNA 손상 응답 유도. 따라서, 이중 티 미 딘 동기화 기술은 정상적인 g 1과 S 단계 수술 하지만 g 2와 M 단계 Cdt1 기능 부족 셀 생성 하 독특한 실험 방식을 제공 합니다. 우리의 동기화 프로토콜의 특별 한 의미 (G2/M) 유사 분열 동안 그들의 소설 기능을 공부 하는 특정 단계에서 다기능 단백질의 그것의 억제에 있다. 따라서,이 방법은 뿐만 아니라 단백질 기능을가지고 여러 다른 세포 주기 단계 뿐만 아니라 염색체 정렬, kMT 첨부 파일, 및 염색체 분리 과정 mitotic 단백질 어떤의 그의 역할을 연구 하기 유용할 것 이다.
이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 라이브 셀 이미징에 대 한 미리 따뜻하게 Leibovitz (L-15)에서 세포를 incubated 매체 화상의 시작까지 10-20 %FBS 보충. 셀 셀 유형에 따라 티 미 딘 블록에서 출시 후 가변 시간 지점에서 유사 분열을 입력합니다. 이미지 캡처 또는 고정 시작 시간 셀 유형에 따라 최적화가 필요 합니다. 라이브 셀 이미징에 대 한 전통적인 confocal 현미경 검사 법의 활용 장기 이미징 동안 photobleaching를 발생할 수 있습니다. 다른 한편으로, 높은 해상도 confocal microcopy photobleaching 효과의 최소 범위를 명확 하 고 고해상도 이미지를 제공합니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 티 미 딘 치료 기간에 티 미 딘, siRNA transfection의 타이밍 그리고 영상의 시작 타이밍의 적절 한 유실.
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Disclosures
저자 들은 경쟁 금융 관심 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B GFP-α-tubulin 표현 HeLa 세포를 공유 하기 위한 동북 대학, 일본의 박사 고조 다나카에 감사. 이 작품은 DV (R00CA178188)에 NCI 그랜트와 노스웨스턴 대학에서 창업 자금 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 °C |
| Leibovitz’s (1x) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 °C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 °C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1,000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 °C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35 mm Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
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