Summary
簡単で迅速なサルモネラの分離法をご紹介-ビオチンとストレプトアビジン菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。
Abstract
サルモネラは、人間の胃腸炎を引き起こす通性細胞内細菌です。粘膜、S.の侵略の後ネズミチフス菌迅速検出し貧するの大食細胞によって、低下するためファゴゾームと呼ばれる小胞に含まれています。Sの分離ネズミチフス菌-含むファゴゾームは、広く研究に使用されているどのようにs.感染症は、細菌の劣化を防ぐためファゴソーム成熟のプロセスを変更します。細菌を含む分離従来、ファゴゾーム ショ糖勾配遠心法によって実行されました。ただし、このプロセスは時間がかかり、専用の装置とある程度の器用さが必要です。Sの分離の簡単かつ迅速な方法は、ここで説明しました。ネズミチフス菌-ビオチン-ストレプトアビジン共役磁気ビーズの細菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。分離ファゴゾーム アッセイ、脂質、代謝、タンパク質解析などの広い範囲のための利用可能の選択の任意のバッファーで本法で得られたファゴゾームを中断できます。要約すると、このSの分離法ネズミチフス菌の特定、効率的、迅速なファゴゾームを含む最低限の機器を必要とする、古典的なショ糖勾配超遠心分離法よりも汎用性が。
Introduction
マクロファージ循環専門の貪食細胞検出、巻き込む、および任意の異物侵入の細菌など微生物細胞のアポトーシスに至る末梢の組織内に存在の低下しています。一般微生物 (病原体関連分子パターンまたは PAMPs として知られている) の表面に存在する病原体特定マーカーの表面受容体を介した認識時にマクロファージを開始の細胞膜における複雑な再編囲むと病原体1を phagocytize の順。
包まれて病原体、ファゴソームと呼ばれる細胞内小胞のマクロファージによって含まれています。エンドソーム、リソソームなど他の小胞の分裂と融合の一連、病原体を含むファゴソームは組の phagosomal コンテンツの除去に必要な蛋白質を取得します。したがって、ファゴソームの酵素の組成は、ファゴソーム成熟2として知られているこのプロセスの過程で非常に可変です。
直後に貪食、エンドソーム3融解によるファゴソーム膜を組み込む複雑な空胞 ATPase (V-atpase) ポリコームタンパク。この複合体は、ファゴソーム4ルーメンに細胞質からポンプのプロトンに ATP を利用しています。ファゴソームの酸性化は、5その他の小胞の融合イベントおよび pH 依存分解酵素6の偉大な数の活性化が不可欠です。別ポリコームタンパク酵素複合体ファゴソーム膜上に組み立てはすぐに NADPH オキシダーゼ (NOX) 複合体であります。複雑な NOX は、ファゴソームの内腔に分泌して包まれて微生物7の殺害に大幅に貢献する活性酸素種 (ROS) を生成するために NADPH を酸化させます。
成熟の最初の手順では、ファゴゾームは通常 Rab5 など v ATPase8V0サブユニットと共にそれぞれの初期と後期エンドソームの Rab7 マーカーを提示します。リソソームと後期エンドソーム ファゴゾームの融合貧するの病原体のさまざまな加水分解酵素カテプシン プロテアーゼ、リパーゼ、β-ガラクトシダーゼ9などへの暴露で起因します。内腔の酸性化もこれらの酵素の活性化のために必要です。たとえば、アクティブな短いフォームを生成するカテプシン D の胸の谷間は pH 依存性10です。これらの酵素は、病原体が低下してマクロファージ主要組織適合遺伝子複雑な (MHC) クラス II 分子11適応免疫応答をトリガーする T 細胞に提示された病原体由来のペプチドの生産を仲介します。
したがって、ファゴソーム成熟は生得の免疫反応のため非常に重要ですし、自然免疫と適応免疫システムの腕をリンクします。病原体はファゴソーム成熟の上記プロセスを介してマクロファージによって除去を克服する戦略を進化している驚きではないです。たとえば、細胞内細菌結核菌、レジオネラ ・ ニューモフィラ防止抑制 V-atpase アセンブリとそれに伴う内腔の酸性化12,13 によるファゴソーム成熟.リステリア菌や赤痢菌など他の細菌は、細胞質14,15に脱出するファゴソーム膜の細孔形成を誘発します。その一方で、サルモネラ血清型ネズミチフス菌(S。ネズミチフス菌)そのレプリケーション16の適切な場所に変換する液胞内ファゴソームのプロパティを変更することです。この機能によって、 s.ネズミチフス菌ファゴソーム成熟の病原体を介した干渉を研究する非常に興味深いモデル。
ネズミチフス菌は通性細胞内細菌人間の胃腸炎を引き起こすです。粘膜、 s.の侵略の後ネズミチフス菌迅速検出し貧するの大食細胞によっておよびファゴゾーム17の内で含まれています。いくつかのレポートはそのs.を前述しました。ネズミチフス菌-エンドソーム、リソソームは18メーカーで示し、他の研究は、米に防いだファゴソームとリソソームの融合を発見した含んでいる phagosomeネズミチフス菌感染症19。
S.によって最初に、ファゴソーム成熟蛍光顕微鏡による感染症について調べた。細菌を含む分離技術の開発ファゴゾームはエンドソームやライソソーム マーカー ファゴソーム内容のより正確な研究を有効にします。までに、主要な細菌を含む分離使用方法ファゴゾームはショ糖ステップ グラデーション18,20細胞レベル下の分別。ただし、このメソッドは、ファゴゾームに機械的な損傷を引き起こす可能性が、phagosomal コンポーネント (蛋白質・脂質) の安定性に影響を与えることができます、時間がかかる複数の遠心分離手順を必要です。また、それは、超遠心機の使用を必要です: は、アクセスできないすべての研究室の専門機器の一部。
最近では、新しいアプローチは、細菌を含む分離に適用されている phagosome、ビオチン化 lipopetide (Lipobiotin) と後に細菌性病原体は、ラベル付けは、ストレプトアビジン共役磁気ビーズ21 を使用して抽出.磁気ビーズのストレプトアビジン共役続いて NHS ビオチンと細菌表面アミン含有高分子の分類によって相補的な方法を提案します。本法で得られたファゴゾーム エンドソームやライソソーム マーカーで濃縮され非常とアッセイ、オミックス解析タンパク質解析からの広い範囲に使用できます。さらに、ultracentrifuges などの特殊な機器は不要です。また、遠心分離手順を排除し、ファゴゾームに機械的な損傷や採用時の量が大幅に削減します。このメソッドは、グラム陽性球菌、この原稿にも含まれているなど、他の細菌を含むファゴゾームの隔離のために簡単に対応できます。要約すると、このSの分離法ネズミチフス菌-ファゴゾームを含む、シンプルでコスト効率の高い、ショ糖で古典的な分離より時間もかかります以下勾配遠心、高度のレンダリング濃縮細菌含むファゴゾーム。
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Protocol
病原性 s. の使用を含むすべての手順ネズミチフス菌 は、BSL 2 またはより高い生物学的セキュリティ レベルの施設で実施する必要があります。文化と S のコーティングネズミチフス菌として骨髄由来マクロファージ (BMDMs) の感染は、汚染を防ぐための層流フードの下で行う必要があります。S の分離ネズミチフス菌-ファゴゾームを含む任意 BSL 2 実験室ベンチで実行できます
。骨髄のマクロファージへの分化のマウスからの抽出され動物の福祉制度のガイドラインに沿って行われ、自然、ノルトライン = ヴェストファーレン州の機関によって承認されました。環境および消費者保護 [Landesamt für Natur、環ならびにノードラインヴェストファーレン州 Verbraucherschutz (LANUV);ファイル: 84 02.05.40.14.082、84 02.04.2015.A443] とケルン大学
。1 養殖 s
- Inoculate s.。ネズミチフス菌(SL1344 株) 細菌のループを使ってブレインハートインフュー ジョン (BHI) 5 mL に単一の細菌のコロニーから 。
- 揺れで一晩 37 ° c の定温器の細菌懸濁液をインキュベートします 。
- 次の日に 19 mL 三角フラスコに BHI ブイヨンの細菌懸濁液の 1 mL に転送し、, 振動インキュベーターで 37 ° C で 。
- 監視 s.600 の光学濃度 (OD) を測定することによって成長を ネズミチフス菌 nm (外径 600) 分光光度計。測定すべき約 30 分ごとに
- とき外径 600 1.0 に達する、インキュベーターと 50 mL のチューブに転送から細菌懸濁液を取り外します。4 細菌 15 分 5,400 × g で遠心分離機 ° C
- 上清を除去し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 10 mL で再懸濁します 。
- 4 ° C で 15 分間 5,400 × g で遠心します。
- 上澄みを除去し、4.9 mL の滅菌 PBS 中の細菌を再懸濁します 。
2。NHS ビオチン/ストレプトアビジン化磁気ビーズの サルモネラ のコーティング
ソリューション (NHS ビオチンはジメチルスルホキシド、DMSO に溶解) 細菌懸濁液に作りたてのリンク- 10 mg/mL の追加の 100 μ L ビオチン前の手順で準備します。たとえば、滅菌 DMSO 0.5 mL に NHS ビオチン 5 mg を希釈します。上下に数回ピペッティングにより正しくミックス 。
- 5 1.5 mL チューブにミックスを分割します 。
- 350 rpm で一定の揺れで、サーモに室温 (RT) で 2 時間加温します 。
- RT で 10 分間 15,000 × g でチューブを遠心し、上澄みを廃棄します 。
- 1 mL の滅菌 PBS、15,000 × g で RT で 10 分間遠心で再懸濁します、上澄みを廃棄します 。
- 余分なビオチン ソリューションのリンクを完全に削除する手順 2.5 を 2 回繰り返します 。
- 最後の洗浄後に、1 mL の滅菌 PBS でペレットを再懸濁します 。
- 1.5 mL チューブに 10 mg/mL 磁気ビーズのストレプトアビジン共役溶液 100 μ L を転送し 5 分間磁気ラックにそれを残す
- ピペットで溶媒を除去、磁気ラックからストレプトアビジン - 共役磁気ビーズ ソリューションを取るし、2.7 準備したビオチン コーティング細菌懸濁液の 1 mL でそれを再懸濁します 。
- 350 rpm で一定の揺れで、サーモに RT で 1 時間加温します 。
- 磁気ラック ソリューションを配置; 5 分待つし、ピペットと壁に付着した細菌を削除 (レッテルをチューブでそれを保つ " 非コーティング細菌 ")。マグネットに接触して管の壁に付着した分数はビオチン/ストレプトアビジン コーティング細菌 。
- 磁気ラックからラベル付きの細菌を含むチューブを削除し、1 mL の滅菌 PBS に再懸濁します 。
- 磁気のラックに再びそれを置き、5 分待つし、ピペットを使用して PBS を削除します 。
- ストレプトアビジン共役磁気ビーズでコーティングされていないすべての細菌を除去する手順 2.13 と 2.14 2 回以上を繰り返します 。
- 最後の洗浄後、コーティング細菌を 500 μ L の滅菌 PBS に再懸濁し、ラベルとして管 " 菌をコーティング ".
- カウント コロニー形成単位 (cfu) 両方の " 非コーティング細菌 " と " 菌をコーティング " BHI 寒天培地プレート上のシリアル希薄をめっきによってソリューション。約 2 × 10 8 cfu/mL のコーティングされた細菌は、外径 600 1.0 の初期の細菌懸濁液 20 mL から取得されます。マクロファージに感染する次の日に使用する 4 ° C でコーティングした細菌懸濁液を維持します 。
3。BDMDs の感染
- ビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズの細菌のコーティングと同じ日にプレート完全に差別化された BMDMs 22 皿あたり 5 x 10 の 6 セルの密度で 6 cm 料理 。
- 次の日 4時 5 分 15,000 × g でコーティングされた細菌懸濁液を遠心分離機 ° C
- 上澄みを除去し、10 x 10 6 cfu/mL の濃度 10% 牛胎児血清 (FBS) ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 培で再懸濁します 。 10、感染 (MOI) の多様性でマクロファージに感染する
- は、BMDMs からメディアを取り出して、準備コーティング細菌懸濁液 5 mL を加えます。すべてのセル型や分離のファゴゾームの実験目的のため最適な MOI の評価がある 。
- 貪食を同期する 10 分間常温加温します 。
- 貪食を開始する 30 分間 5% CO 2 インキュベーターで 37 ° C に加温します。他のセルタイプが細菌の内面化を確保するため異なるインキュベーション時間を必要があります 。
- 料理から細菌を含む培地を外し、非内面の細菌を除去する RPMI でセルを 3 回洗浄します 。
- 任意の非貧する細菌を殺すために 10 %fbs および 50 μ G/ml のゲンタマイシンを含む RPMI の 10 mL を最後に追加します 。
- では、目的の時点までの 5% CO 2 と 37 ° C で感染した BMDMs 孵化させなさい。目的の時点は、分析の目的と使用する携帯型細菌によると実験的に決定する必要があります。S の初期エンドソーム-ファゴソーム融合事象の研究ネズミチフス菌感染 BMDMs 30 分インキュベーションをお勧めします。後の事象の分析、2 時間または 4 時間後ファゴゾームを抽出できます。S と大食細胞の長期培養24 時間を超えてネズミチフス菌はマクロファージの死の結果します。ファゴソーム抽出可能性がありますおそらくビオチン分子の劣化につながる前に細胞内感染症を拡張します。ただし、24 時間まで見られなかったコーティング細菌でビオチンの損失
4。S の分離ネズミチフス菌-ファゴゾームを含む
- 準備必要ファゴソームのボリューム分離バッファー (50 mM 管、50 ミリメートル MgCl 2, 5 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 pH.7) ジチオトレイトール (DTT) を最終濃度 1 mM、サイトカラシン B 決勝に追加することによって10 μ M、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤の製造元の推奨どおり濃度
。 注: DTT、サイトカラシン B を加えなければなりませんファゴソーム分離バッファー A に常に直前に使用します。サイトカラシン B 破壊細胞骨格、細胞膜の破壊を促進する 。
- 希望の時間にポイントし、感染細胞からメディアを取り出して、右に温めた滅菌 PBS で洗浄
- Phagosom の追加 750 μ Le 分離は一皿 A バッファーに格納し、氷の上の 20 分を孵化させなさい。分離バッファー A のボリュームを比例して調整する必要があります別のセル番号を使用するときです 。
- (50 mM のパイプ、pH.7、50 mM MgCl 2、グリコールエーテルジアミン四酢酸 5 mM、220 mM、マンニトールと 68 mM ショ糖) ファゴソーム分離バッファー B の追加 250 μ L。ロック プレート皿の完全な表面をバッファーに届くように。分離バッファー B のボリュームを比例して調整必要があります別のセル番号を使用している場合 。
- そっとゴム警官を使用して削ってお皿からセルを削除し、中古冷蔵 1.5 mL チューブに転送します 。
- は、26 G 針、少なくとも 15 回 1 mL 注射器を使用して (1 つの吸引プラス 1 回の細胞懸濁液の数の 1 つ放出) を細胞懸濁液を通過します。これは BMDMs のゾル性細胞質のコンテンツをリリースするのに十分です。針通過の数は、細胞の種類ごとに最適化する必要が 。
- 磁気ラックに細胞懸濁液、5 分を待ちます。磁石に粒子がコーティング-s. を含むファゴゾームです。ネズミチフス菌。懸濁液には細胞成分の残りの部分が含まれています 。
- というレッテルを 1.5 mL チューブに懸濁液を転送 " 細胞質 ".
- 磁気ラックから隔離されたファゴゾームとチューブを削除し、それらを 1 mL の滅菌 PBS に再懸濁します 。
- 磁気ラックにファゴソーム サスペンションを置き、5 分待つし、PBS を削除します 。
- 4.9 と 4.10 分離 米 を洗う手順を繰り返ネズミチフス菌-ファゴゾームを含むします 。
- は最後に PBS を削除し、必要なバッファー; たとえば、タンパク質解析のための radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファー、ファゴゾームを再懸濁します。細胞の初期量と感染の慣性モーメントによって、このプロトコルを次のサンプルあたり約 50-200 μ g のタンパク質を取得します 。
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Representative Results
細菌を含む分離このプロトコルによってファゴゾーム細菌の最初のステップとしてビオチン化が必要です。我々 したがって、 s.の有効性を評価ビオチン標識に感染した BMDMs の共焦点顕微鏡解析によるネズミチフス菌ビオチン化 mCherry-S。ネズミチフス菌Cy5 ストレプトアビジンが付いた。簡単に、BMDMs は、mCherry-Sとこのプロトコルで説明されているように感染していた。ネズミチフス菌ビオチン標識したストレプトアビジン共役磁気ビーズをインキュベートないが。37 ° C で 30 分後、セルは温かみのある PBS で洗浄され右固定で 20 分に立寄られた PBS で広範な洗浄の 4% のホルムアルデヒドで固定します。セルが、グリセリン RT。 感染した BMDMs で 5 分間 PBS でトリトン次いで, Cy5 ストレプトアビジン 4 ° C で 20 分間 3%広範な洗浄後共焦点顕微鏡 (図 1) によるサンプル分析の準備をしました。ビオチン化しない mCherry-S。ネズミチフス菌は陰性対照として使用されました。ビオチンで専ら Cy5 ストレプトアビジンから蛍光信号を認めた mCherry-S。ネズミチフス菌細菌のビオチン化を確認しました。「60 X O2 NA: 1.40」を用いた共焦点顕微鏡に顕微鏡による解析を行った目的。蛍光色素の励起波長が 405 nm (DAPI) 559 nm (mCherry)、635 nm (cy5 の組合せ)、および光電子増倍管電圧はそれぞれ 574v、565v、443v で設定されました。
以来マクロファージのSによって引き起こされる免疫反応。ネズミチフス菌はマクロファージ表面の受容体活性化細菌リガンドに大きく依存して、我々 は次の場合をテストSのコーティング。ビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズネズミチフス菌は、感染した BMDMs における自然免疫応答を変えることができます。私たちは最初Sのコーティングかどうかを評価します。ネズミチフス菌は、共焦点顕微鏡による BMDMs の貪食能力を変えることができます。BMDMs は、mCherry-Sとこのプロトコルで説明されているように感染していた。ネズミチフス菌ビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズまたは光沢 mCherry-Sをコーティングします。ネズミチフス菌。37 ° C で 30 分インキュベーション後、セル暖かい PBS で洗浄し、室温に 20 分間 4% ホルムアルデヒドと固定PBS で広範な洗浄後共焦点顕微鏡によるサンプル分析の準備をしました。図 2のように、マクロファージ貧するコーティングとコーティングされていない mCherry-S。ネズミチフス菌も同様に。
次に、 Sによって引き起こされる炎症性の応答を分析しました。ネズミチフス菌ビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズ (図 3)。コーティングおよびコーティングされていないs.に感染した BMDMs から培養上清分泌されるインターロイキン-6 (IL-6) の酵素免疫測定法 (ELISA) 感染の 24 h 後ネズミチフス菌を採取されました。Sのコーティング。ネズミチフス菌ビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズは、マクロファージの炎症性応答を大幅変わりませんでした。
このプロトコルを採用することにより得られる細菌含んでいる phagosome の純度を評価するためには、分離 mCherry-Sを分析しました。ネズミチフス菌-イムノブロット ファゴゾームを含みます。特定抗体 mCherry タグを使用して、mCherry を表現するSの重要な濃縮がわかった。同じサンプル (図 4) から得られた細胞質画分と比較して分離ファゴゾームのネズミチフス菌。MCherry- Sを含む分離ファゴゾーム。ビオチンと以前コーティングされたいないネズミチフス菌は陰性対照として使用されました。これらの結果は、このプロトコルが細菌で濃縮され高い phagosome の浄化のためにできることを示しています。
次に行ったSを含む分離ファゴゾーム内エンドソームやライソソームのマーカーのイムノブロット解析。ネズミチフス菌(図 5)。4 時間 30 分と比較すると感染の後で分離されたファゴゾーム内エンドソームやライソソームのマーカーのほとんどを観測した.Rab5 エンドソーム マーカーの濃縮とカテプシン D と同様、Rab7、リソソーム マーカー v ATPase (V0と V1サブユニット) が認められました。興味深いことに、感染後 4 時間で分離されたファゴゾームにおけるカテプシン D の劈開のフォームのみが観察されました。プロのカテプシン D の谷間ファゴソーム分離のこのプロトコルの特異性を示す細胞質ではなく phagosome で短いアクティブ フォーム (33 kDa) を生成する (48 kDa) にのみ発生します。
以来、細胞小器官ミトコンドリアや小胞体 (ER) などからのマーカーは、細菌を含む分離ファゴゾーム、 Sの準備でしばしば検出されます。ネズミチフス菌-含んでいる隔離されたファゴゾームいたミトコンドリア トランスポーター Tomm20 と小胞体タンパク質カルネキシン (図 6) などに対する特異抗体をプローブします。また、解糖系酵素分離ファゴゾームのゾル性細胞質の汚染を査定 GAPDH 抗体ともそれらをテストしました。Sにミトコンドリアや小胞体マーカーを見つけた。ネズミチフス菌-ゾル性細胞質の汚染なし、ファゴゾームを分離しました。
細菌を含むファゴゾーム、ビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズの隔離のためのプロトコルの多様性を研究するには、塗装手順は、グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌に適用されました。同じ固定を採用し前述の mCherry-Sのためのプロトコルを汚します。ネズミチフス菌緑色蛍光タンパク質 (GFP) の成功したビオチン化を確認した (図 1) 表現する-黄色ブドウ球菌(図 7)。さらに、我々 はエンドソーム マーカー Rab7 とリソソーム マーカー V-atpase (V0サブユニット) の濃縮を検出され、カテプシン D の免疫ブロット法により分離された GFP-黄色ブドウ球菌-ファゴゾーム (図 8) を含みます。その成熟したフォームにカテプシン D の胸の谷間は、感染細胞質画分ではなく分離ファゴソーム サンプルで 4 h 後検出のみでした。黄色ブドウ球菌の分離-含んでいる phagosome GAPDH のバイオアセッテイで示すように、ゾル性細胞質の汚染の自由であった。
要約すると、私たちファゴソームの隔離のプロトコルが高濃縮細菌含むファゴゾーム、ゾル性細胞質の汚染の無料の隔離を可能を確認しました。Pha を勉強するエンドソームやライソソーム マーカーの分析の分離ファゴソーム準備を使えますgosome 成熟。さらに、グラム陰性菌およびグラム陽性細菌にこのプロトコルが使えるし、ラベリング手順にはマクロファージの免疫反応は変わりませんを示した。
図 1: 蛍光顕微鏡によるビオチン化米の解析ネズミチフス菌Cy5 ストレプトアビジンを使用します。BMDMs は、mCherry-Sと 30 分のため感染していた。ネズミチフス菌はビオチン化 (「ビオチンS。T.」)、このプロトコルで記述されています。ビオチン化しない mCherry-S。ネズミチフス菌(「ないビオチン化S。T.")ネガティブ コントロールとして使用されました。固定セルの透過後、サンプルを添加して Cy5 ストレプトアビジン 4 ° C で 20 分核 (DAPI) mCherry-s.からの蛍光信号ネズミチフス菌と Cy5 ストレプトアビジンは、共焦点顕微鏡を用いて分析しました。Cy5 ストレプトアビジンからの信号は、以前付けられてビオチン、効率的なビオチン化を裏付けて細菌でのみ検出でした。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: BMDMs mCherry-Sと感染の顕微分析。ネズミチフス菌ビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズ コーティングします。BMDMs は、mCherry-におけるこのプロトコルで記述されているビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズ付けに感染していた。30 分間、細菌を phagocytize にマクロファージを可能にした後セル室温に 20 分間 4% ホルムアルデヒド固定しました。マクロファージによる貧するコーティングされた細菌が、共焦点顕微鏡による分析します。解析によれば、コーティングされた細菌の摂取量 (「コートS.T.")ラベルのない mCherry 細菌の摂取量に匹敵する (" Sコーティングいません。T.")、ビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズ ラベルを示すSの貪食能は変わりません。マクロファージによるネズミチフス菌。核染色による DAPI で顕微鏡可視化。± S.E.M. を意味するようにデータが表示され、統計的有意性を用いて受講者のt-テストとして表されます * p = < 0.05;* * = p < 0.01;p = < 0.001。スケール バー = 40 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: BMDMs による il-6 分泌は、ビオチンとストレプトアビジン化磁気ビーズ、標識Sに感染しています。ネズミチフス菌ラベルSと比較しています。ネズミチフス菌.BMDMs はs.に感染していたネズミチフス菌このプロトコルで説明されているようにビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズ コーティングします。感染症の 24 h 後清は elisa 法による il-6 分泌のさらなる分析のために収集されました。清は、コーティングされていないSに感染した BMDMs を形成します。ネズミチフス菌のコントロールとして使用されました。コーティングSによって il-6 分泌の誘導。ネズミチフス菌は、コーティングされていないSのそれに比較して有意差はなかった。ネズミチフス菌。± S.E.M. を意味するようにデータが表示され、スチューデント t 検定を用いて有意として表されます * p = < 0.05;* * = p < 0.01;p = < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 隔離されたファゴゾーム内細菌濃縮します。タグ付きの mCherry s.の濃縮ネズミチフス菌分離ファゴゾーム 30 分と感染の 4 h 後収集では細胞質画分と比較しました。Β-アクチンは、ローディング コントロールとして使用されました。否定的な制御は、コーティングされていないSを使用して分離されたファゴゾームを指します。ネズミチフス菌感染後 30 分で。ファゴソーム分離ラベルs.を使用して、期待どおりの最終的な出力ネズミチフス菌大量 mCherry または β-アクチン プロトコルの特異性を示すが表示されません。蛋白質の 20 μ g は、1 サンプルあたり読み込まれました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 絶縁Sのエンドソームやライソソームのマーカーの解析。ネズミチフス菌-ファゴゾームを含むします。絶縁Sの Rab5 エンドソーム マーカーとカテプシン D と Rab7、リソソーム マーカー v ATPase (V0と V1サブユニット) の濃縮を行った.ネズミチフス菌-30 分と感染の 4 h 後に抽出されたファゴゾームを含みます。Β-アクチンは、ローディング コントロールとして使用されました。蛋白質の 20 μ g は、1 サンプルあたり読み込まれました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: ミトコンドリア、小胞体、および絶縁Sのゾル性細胞質マーカーの解析。ネズミチフス菌-ファゴゾームを含むします。GAPDH のゾル性細胞質のマーカー、ER マーカー カルネキシンとSのミトコンドリア マーカー Tomm2030 分、感染後 4 時間で分離したネズミチフス菌ファゴゾーム イムノブロット分析し、対応する細胞質画分と比較しています。サンプルあたり蛋白質の 20 μ g を読み込みました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: GFP-黄色ブドウ球菌の顕微鏡分析感染マクロファージ。BMDMs は、 Sに感染していた。緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表現する球菌ラベル with ビオチン米の分類のための方法論で説明されているようネズミチフス菌。30 分間、細菌を phagocytize するマクロファージを可能にした後セルを修正しました。コーティングされていない黄色ブドウ球菌(「ないビオチン化S。A.")ネガティブ コントロールとして使用されました。固定セルの透過後、サンプルを添加して Cy5 ストレプトアビジン 4 ° C で 20 分核 (DAPI) から蛍光信号 GFP-S。黄色ブドウ球菌、および Cy5 ストレプトアビジンは、共焦点顕微鏡によって分析されました。Cy5 ストレプトアビジンからの信号は、以前ビオチン、ビオチン化効率を確認するラベルの付いた細菌だけが見えた。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 絶縁Sのエンドソームやライソソームのマーカーの解析。黄色ブドウ球菌-ファゴゾームを含むします。S.黄色ブドウ球菌-V-atpase 対応する細胞質画分と比較して、Rab7、phagosomal マーカー Rab5 のイムノブロット分析した 30 分、2 h と 4 h 後感染症で分離されたファゴゾームを含みます。サンプルあたり蛋白質の 20 μ g を読み込みました。また、GAPDH、 Sを分離したことを示す抗体が特定のサンプルがテストされました。黄色ブドウ球菌-含んでいる phagosome、ゾル性細胞質の汚染の自由。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
新しいSの分離法ネズミチフス菌-ここで説明はファゴゾームを含むビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズ細菌をコーティングします。細胞膜の穏やかな中断の後、磁気ラックを使用して細菌を含むファゴゾームできます簡単に抽出しました。示す細菌の炎症を誘発する病原体の能力を維持宿主細胞の貪食のプロパティは変更されません。このメソッドによって得られるファゴゾームが細菌やエンドソーム/リソソームで濃縮され重要なは、マーカーとゾル性細胞質汚染を欠いています。
このメソッドは、ショ糖勾配分離を採用しています伝統的なファゴソーム分離方法に比べていくつかの利点を示します。それは複数の遠心分離手順、研究者より少ない時間でより多くのサンプルを処理し、洗浄手順の数を簡単に増やすことによって純粋ファゴソーム サンプルを取得時間がかかる排除します。このプロトコルの使用には、超遠心法など、専門的かつ敏感な機器の必要があります。高速遠心分離が小胞の特性を変更でき、このプロトコルで回避は最終的な収量22に、削減します。我々 が実証もSのコーティングビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズネズミチフス菌はマクロファージの貪食能を変更しません。また、il-6 が感染したマクロファージ誘導標識Sです。ネズミチフス菌は、ラベル付けされていない細菌が感染したマクロファージと比較して変更できませんでした。したがって、 Sのコーティングネズミチフス菌の病原性に重要な変更を誘発しません。私たちの知る限り、 Sのコーティングネズミチフス菌分離のファゴゾーム用共通実験解析技術のいずれかの障害を表していません。
ネズミチフス菌-含んでいる phagosome このメソッドによって分離された細菌と現在の典型的なエンドソームや劈開成熟したプロテアーゼおよび V1 v atpase 活性サブユニット V0などのライソゾーム マーカーで濃縮されています。カテプシン D 分離ファゴソーム分数でのみ検出することができます。さらに、我々 が見つかりましたミトコンドリアと小胞体マーカー分離のs.ネズミチフス菌-ファゴゾームを含みます。ただし、ファゴゾーム小胞体との相互作用は、広く研究されている小胞体に存在からの蛋白質の量ファゴゾームの病原体を含む病原体研究と細胞型と異なる場合があります。たとえば、ファゴゾームブルセラ素人食細胞から分離したを含む、ER マーカー23がマクロファージ24から分離されたものではなく、豊富です。S.が以前検出されたカルネキシンネズミチフス菌含むファゴゾームのショ糖勾配18によって分離されました。不活性のビードを含むファゴゾームとミトコンドリアの密接な相互作用はまた以前報告された25、隔離されたファゴゾームの Tomm20 の存在を説明するをされています。ミトコンドリア蛋白質は隔離されたファゴゾームl26または27結核菌を含むで発見されています。ただし、ショ糖勾配遠心法による分離病原体を含むファゴゾームの準備でミトコンドリアのコンポーネントの検出はしばしばこのオルガネラの同じような密度が原因であると考えられているとファゴソームの病原体を含むため、非特異的28。本手法はこのような汚染問題を回避でき、ミトコンドリア膜は phagosomal 膜が付き合う可能性があります示唆してより信頼性の高い情報を提供します。要約すると、それは困難になります小胞体や病原体を含むミトコンドリア マーカーを避けるため分離ホスト セルの種類と病原体に応じて、ファゴゾーム準備。隔離されたファゴゾームの純度の確認をお勧めは、ウェスタンブロットによる細菌の検出のためタグ細菌や特定のタグ抗体を使用することです。またこの分離方法がビオチン化をすることができます利用可能な表面アミン グループと他の微生物に適応できることを示す.例として、我々 は正常に適用される黄色ブドウ球菌を分離する我々 のプロトコル-ファゴゾームを含みます。ファゴゾームこのプロトコルを使用して分離された黄色ブドウ球菌を含む V-atpase (V0サブユニット) など Rab7、リソソームおよびエンドソームのマーカーでそれぞれ、濃縮されが、GAPDH などゾル性細胞質マーカーはありません。
エンドソーム/phagosomal 小胞は病原体の分解のためのユニークな環境を提供するが、適応免疫系のシグナル用抗原を維持します。モノヨードおよび成熟プロセスを広範囲に調査が様々 な病原体をホスト ファゴソーム内微小環境は、とらえどころのないまま。また明確である細胞の代謝変化ファゴソーム成熟とそのコンテンツの変更方法。したがって、ここで詳細なプロトコルは、ファゴソーム器官と様々 な疾患のコンテキストで関数を勉強するより多くの機会を与えます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
Aging-Associated 病、ケルン大学、ドイツの細胞ストレス反応にケルンの卓越性クラスターからの資金調達でロビンソンのラボで研究をサポート (CECAD; エクセレンス イニシアチブは、ドイツ連邦内 DFG によって資金を供給し、国家の政府) とドイツ研究振興協会 (SFB 670)、ケルン富と、ドイツのケルン大学のマリア ペッシュ財団からの助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
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