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Immunology and Infection

Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56515

Summary

Une méthode simple permettant d’obtenir des clones NK et des lymphocytes T chez des patients CAEBV a été développée avec rendement élevé, une petite quantité de sang périphérique et une faible dose d’il-2.

Abstract

Un certain nombre de méthodes ont été décrit pour établir des lignées de cellules NK/T de patients atteints de syndrome lymphoprolifératif ou de lymphome. Ces méthodes employées des cellules nourricières, les cellules NK ou T purifiées autant que 10 ml de sang ou une dose élevée d’il-2. Cette étude présente une nouvelle méthode avec une stratégie simple et puissante pour établir des lignes NK et des lymphocytes T en cultivant le périphérique du sang des cellules mononucléaires (PBMC) avec l’ajout d’il-2 de recombinante humaine (rhIL-2) et utilise aussi peu que 2 mL de sang total. Les cellules peuvent proliférer rapidement dans les deux semaines et être maintenues pendant plus de 3 mois. Avec cette méthode, 7 lignes de NK ou les lymphocytes T ont été établis avec un taux de réussite élevé. Cette méthode est simple, fiable et applicable à l’établissement de lignées cellulaires de plus de cas de lymphome à cellules NK/T ou de CAEBV.

Introduction

Virus d’Epstein - Barr (EBV) est omniprésent et infecte non seulement B cellules, mais aussi T et natural killer (NK), ce qui provoque un certain nombre de maladies de Syndromes lymphoprolifératifs associés à l’EBV NK/T (LPD) et Lymphome/leucémie, telles que l’activation macrophagique associés à EBV familiale, hydroa vacciniforme type lymphome, lymphome à cellules NK/T extraganglionnaires, type nasal et NK agressive cellule leucémie1,2,3. Parmi ceux-ci est la maladie chronique grave actif EBV (SCAEBV), qui est incident principalement en Asie du sud-est, et qui est maintenant considéré comme un LPD causée par une expansion clonale d’infectées par l’EBV T ou NK cellules4,5,6, 7, mais sans l’immunodéficience apparente présent dans la mononucléose infectieuse (MNI)-comme symptômes, y compris la fièvre, une hépatosplénomégalie, une lymphadénopathie et dysfonction hépatique persistante ou récurrente, ainsi que EBV-ADN haute charge dans la sang périphérique8,9. Patients atteints de CAEBV ont un mauvais pronostic10,11et sa pathogenèse, et ignore le rôle de l’EBV. Donc, lignées dérivées de maladies lymphoprolifératives associés à EBV NK/T de cellules et de lymphomes sont très utiles comme modèles cellulaires pour clarifier le mécanisme d’EBV induit la prolifération NK et des lymphocytes T et sa relation à forte incidence de la leucémie ou lymphome.

A ce jour, plusieurs lignées cellulaires ont été établies avec différentes techniques12,13,14,15,16. Une lignée humaine de cellules NK, NK-YS, créait de leucémie/lymphome à cellules NK, co-culture avec une lignée de cellules stromales de souris comme conducteur et en présence de rhIL-2 à une concentration de 20U par tranche de15mL. KAI3 était une autre lignée de cellules NK, établie à partir de patients présentant une allergie sévère moustique ou SCAEBV avec la lignée lymphoblastoïde autologue (LCL), les lymphocytes B transformés par EBV, sous forme de cellules nourricières et ajout de rhIL-2 à 100U/mL16. SNK6 et SNT8 ont été dérivées de tissus de tumeur nasale patients de lymphome de cellules NK/T en ajoutant de fortes doses de rhIL-2 (700U/mL)12. Avec une technique similaire, la cellule de SNK-1 était de patients CAEBV, cultivées de PBMC en enlevant les cellules T et ajoutant 700U/mL rhIL-213,,17. SNT13 et SNT15 ont été créés en supprimant les CD4 + et CD8 + cellules18. Jusqu'à présent, autres lignées cellulaires de cellules T et NK de patients EBV-NK/T LPD ont tous été conçues avec cette méthode19.

Les inconvénients des méthodes existantes mentionnées ci-dessus comprennent l’emploi de cellules nourricières, l’exigence d’une forte dose de IL-2, l’utilisation d’autant que 10 mL de sang total ou la purification des cellules NK/T, qui est très difficile dans la clinique due à la nécessité de vérifier quels types de cellules que EBV latentes infecte avant de commencer à la culture. CAEBV se produit principalement chez les enfants en Asie, 10 mL de sang n’est pas facile à acquérir dans toutes les régions. Dans cette étude, nous avons développé une nouvelle méthode simple avec un taux de réussite élevé pour établir des lignes NK et des lymphocytes T en cultivant des PBMC de patients CAEBV en utilisant une faible dose de rhIL2 et un volume de 2 mL de sang total sans cellules nourricières. Les résultats de cette méthode ont prouvé sa grande efficacité et gain de temps.

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Protocol

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut de génétique et biologie du développement, Académie chinoise des Sciences, et le protocole suit les lignes directrices pour le bien-être de l’humanité.

Remarque : Voir la Figure 1 pour un schéma du flux de travail.

1. isolement des PBMC de Patients CAEBV

  1. Purifier les PBMC primaire de 2 mL de sang total des patients CAEBV en dégradé (par exemple, gradient de Ficoll-plaque) centrifugation en suivant les instructions du fabricant. Alternativement, décongelez les PBMC cryoconservé d’azote liquide avec milieu RPMI 1640.
  2. Ajouter 2 µL de bleu trypan (0,4 %) à 18 µL de la suspension cellulaire, attendez pendant 3 min à cellules, transférer la suspension à la plaque de renfort de cellule et mesurer la concentration des cellules et la viabilité avec un compteur de cellules automatisées.
  3. Préparer la suspension de cellules à une densité de 2-3 × 106 cellules/mL additionné de milieu de culture RPMI 1640 complet contenant 20 % de sérum humain (chaleur inactivée à 56 ° C), 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques (100 µg/mL de streptomycine, 100 U/mL de pénicilline). Semences de 1 mL de suspension PBMC par puits dans les plaques de culture cellulaire de 24 puits.
  4. Ajouter 150 U rhIL-2 / puits.
  5. Placer les plaques de culture dans un incubateur à2 CO 5 % à 37 ° C.
  6. Jour 2, observer la morphologie des cellules au microscope (grossissement de 200 X) ; les cellules sont en bon état lorsqu’elles sont lumineuses et rond.

2. l’expansion des cellules et les cellules viables de numérotation

  1. Observer la morphologie des cellules au microscope (grossissement de X 200) et surveiller la condition de la croissance cellulaire en numérotant les cellules avant de changer de milieu : ajoutez 2 µL de bleu trypan (0,4 %) à 18 µL de la suspension cellulaire, puis calculer la concentration des cellules (voir 1.2, Figure 2).
  2. Jeter 500 µL de milieu dans une plaque 24 puits et ajouter 500 µL frais milieu culture complet. Ajouter 150U rhIL-2 / puits.
  3. Changer le milieu deux fois par semaine comme à l’étape 2.2.
  4. Tracer la courbe de croissance cellulaire (Figure 3).
  5. Lorsque concentration les cellules viables dépasse 5 × 106par millilitre, diviser les cellules en nouveaux puits à une concentration de 1 à 2 × 106 cellules/mL dans chaque puits. Ce processus prend de 2 à 4 semaines.

3. cellule phénotypage par cytométrie en flux

  1. Lorsque les cellules ont développé, collecter 1 × 106 cellules pour déterminer les phénotypes des lignées cellulaires. Centrifuger à 240 x g pendant 5 min à température ambiante, les cellules (cellules NK/T vont précipiter au fond du tube).
  2. Jeter le surnageant, laver la précipitation en ajoutant 7 mL de PBS. Centrifuger pendant 5 min à 240 x g à la température ambiante. Répéter une fois.
  3. Ajouter 200 µL de sérum humain dans chaque tube, bien mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante.
  4. Centrifuger les cellules à 240 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules à 1 × 106par millilitre avec la LNPP froid (PBS+0.2%BSA). Diviser des cellules en 5 tubes, chaque tube contenant 2 cellules de5 × 10.
  5. Cellules de centrifugeuse à 240 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec un tampon LNPP ou LNPP contenant 10 µL PE (ou PE-Cy7) et 10 µL FITC marqué anticorps pour souiller des récepteurs des cellules T ou NK sur glace comme l’indique la Figure 4. Cellules suspendues avec le tampon de la LNPP sont utilisés comme contrôle négatif.
  6. Incuber les cellules avec des anticorps pendant 20-30 min sur la glace dans l’obscurité.
  7. Laver les cellules deux fois avec la LNPP froid, remettre en suspension les cellules avec 300 µL LNPP froid.
  8. Analyser le phénotype cellulaire avec un cytomètre en flux.
    1. Mettre en place le cytomètre de flux en état de « Créer la feuille de calcul ». Mettre en place le modèle expérimental, avec un terrain de dot qui s’affiche avant dispersion (FSC) versus diffusion latérale (SSC).
    2. Chargez le tube isotype de contrôle afin d’optimiser les tensions FSC et SSC et optimiser la valeur de seuil FSC pour éliminer les débris sans interférer avec la population de cellules d’intérêt. Supprimer tous les paramètres sauf FSC, SSC, FITC, PE et PE-Cy7.
    3. Effectuer une compensation en utilisant le contrôle de l’isotype et un seul contrôle positif dans chaque groupe d’analyse de 2 couleurs.
    4. Charger des échantillons et créer HLA-DR VS CD19, CD4 CD8 VS, CD56 VS CD16 et CD3 VS CD16 dot emplacements montrant les différentes populations de cellules.
      NOTE : PBMC ont été utilisés pour effectuer une compensation en utilisant le contrôle négatif/isotype et le seul contrôle positif. 2 couleurs immunofluorescence avec cytomètre en flux a été utilisé couramment pour analyser l’expression des marqueurs de surface. Les anticorps suivants sont inclus : anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 conjugué avec l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 conjugué à la phycoérythrine (PE) et anti-CD19 conjugué avec PE-Cy7.

4. expansion et la cryoconservation des cellules NK/T

  1. Changer le support lors de l’analyse du phénotype cellulaire est terminée. Avec précaution, retirer la moitié du liquide surnageant et évitez de toucher les cellules au fond de la plaque. Ajouter le même volume de milieu de culture frais contenant 300 U/mL rhIL-2 pour les plaques de la cellule.
  2. Changer la moitié de la moyenne tous les 3 jours (comme 2.2) jusqu'à la cellule grappes sont clairement visibles au microscope (Figure 2). En général, ce processus prend 2-3 semaines.
  3. Transférer les cellules de plaques 24 puits à T25 flacons de culture après le mélange des différents puits de la même lignée. Doubler le volume de milieu de culture qu’il se colore en jaune jusqu'à ce que le volume du milieu se développe à 10-15 mL. Ajouter rhIL-2 avec la concentration de 150 U/mL.
  4. Changer de milieu 24 h avant de les congeler après 2-3 semaines de plus en plus, lorsque la cellule de masse peut être observée à le œil nu. Mesurer la concentration cellulaire avec un compteur de cellules.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 240 x g et Resuspendre le culot cellulaire à une densité de 5-10 x 106 cellules/mL avec la solution mère congelée, qui contient le sérum de veau fœtal 90 % et 10 % diméthylsulfoxyde (DMSO). Gel à raison de 1 ° C / min jusqu'à-80 ° C et puis les transférer directement dans l’azote liquide.

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Representative Results

Après que 3 jours culture lors de la création de lignées cellulaires, les cellules polymorphes commencent à apparaître (Figure 2). Après 7 jours, les cellules se développent rapidement, comme le numéro et la viabilité des cellules croissent à un rythme élevé (Figure 3). Petits amas de cellules sont clairement visibles après 10-14 jours de plus en plus, lorsque la concentration en cellules peut dépasser les 3 à 6 × 106. Au cours de cette période, les cellules devraient être élargies par la division en deux ou trois puits de la plaque de culture. Environ un mois plus tard, une fois la cellule numéro atteint 3 à 5 × 107, le comte est suffisamment élevée pour la conservation.

Une autre question importante est de déterminer les phénotypes lorsque les cellules ont été cultivées avec succès. Nos résultats indiquent que T (L196) et les cellules NK (M296) peuvent être cultivées par la méthode décrite ci-dessus (Figure 4), et des lignées cellulaires a peuvent être établies avec cette technique, comme les cellules a augmenté de plus de 3 mois en bon état.

Figure 1
Figure 1 : représentation schématique du flux de travail. Le premier jour, anticoagulant sanguin ont été recueilli chez des patients CAEBV, puis PBMC ont été isolées et cultivées avec un milieu 1640 contenant 20 % de sérum humain et 150U/mL de rhIL-2. Les cellules NK/T ont été cultivées à 37 ° C en présence de 5 % de CO2. Après 2 à 4 semaines de culture, les cellules ont commencé à se développer rapidement. Lorsque la concentration dépasse 5 × 106 par millilitre, nous avons divisé les cellules en 2-3 puits à concentration de 2 × 106. Poursuivant la culture pendant 2-3 semaines, les cellules furent transférés de la plaque 24 puits dans ballon T25 lorsque agrégats cellulaires étaient clairement visibles au microscope. Cryoconservé cellules quand la cellule masse peut être observée à le œil nu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : changements morphologiques cellulaires dans le processus de mise en culture. Les cellules sont cultivées et observés pour le nombre de jours indiqué. Cellules polymorphes (les flèches pointés) étaient visibles au microscope clairement après 3 à 7 jours, et des cellules a commencé à croître rapidement après la culture de 7 à 14 jours. Le grossissement original pour la microscopie a 200 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : les courbes de croissance de la prolifération cellulaire. Après 7 jours de culture, les cellules ont commencé à croître rapidement (A) et à la viabilité haute (B). Concentration et la viabilité des cellules ont été mesurés par un compteur cellulaire automatisée avec la procédure suivante : ajouter 2 µL de bleu trypan (0,4 %) à 18 µL de suspension cellulaire pour la coloration, attendre 3 minutes, transférer la suspension à la plaque de renfort de cellule et mesurer LiPo la concentration et la viabilité des cellules avec un compteur de cellules automatisées. Les barres d’erreur sont les écarts-types des trois répliques. L196, Z290, M296, l 311 sont les noms des quatre lignées cellulaires. La concentration initiale pour mesurer la courbe de croissance est d’environ 3 × 106. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : représentant gating stratégie pour analyse en cytométrie en flux de lignées cellulaires L196 et M296. PBMC ont été utilisés pour ajuster les tensions FSC et SSC. Le cluster des lymphocytes direct et unique a été fermé pour P1 dans le complot FSC et SSC. Le contrôle de l’isotype et seul ceux positifs ont été utilisés pour effectuer une compensation. Quatre paires de 2 couleurs immunofluorescence conjugué anticorps coloration ont été utilisées pour analyser l’expression des marqueurs de surface. Anti-HLA-DR et anti-CD19 ont utilisé pour détecter les cellules B, tandis que les anti-CD3, anti-CD4 et CD8-anti ont été utilisés pour détecter les cellules T. Anti-CD16 et CD56-anti ont servi à définir les cellules NK. (A) le phénotype de L196 est CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, le type de cellule principale est CD8 +. (B) M296 est CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, le type de cellule principale est CD16 + CD56 +. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans ce protocole, une nouvelle technique pour l’établissement de lignées de cellules NK/T de sang des patients CAEBV a été développée. Comparaison avec les méthodes existantes, l’avantage majeur de cette méthode est sa simplicité et son exigence de seulement une petite quantité de sang, alors qu’il présente un taux de réussite élevé et de bonnes conditions de viabilité des cellules. En outre, les lignées de cellules NK/T peuvent être établies en cultivant des PBMC sans déterminer les types de cellules l’EBV latentes infectée à l’avance, comme la détermination consommeraient plus de sang et de temps avant la mise en culture. Alternativement, les lignées cellulaires peuvent être analysées et différents phénotypes de cellules peuvent être purifiés par cytométrie en flux après la création de ligne cellulaire. En outre, la méthode utilise une faible dose de rhIL-2 et a besoin d’aucune des cellules nourricières. Avec cette méthode, nous avons développé 7 lignées cellulaires de 8 patients CAEBV et cryoconservés eux moins d’un mois. Celui qui n’a pas été développé dans une lignée cellulaire peut être maintenue en vie pendant plus de 5 mois sans prolifération significative, et les raisons derrière ce besoin d’une étude plus poussée.

Il est nécessaire de noter que la croissance des cellules est strictement dépendante de la présence de recombinante humaine il-2, qui est conforme aux précédents rapports20,21; avec aucun humain il-2, les cellules vont mourir dans les 3 semaines. De toute évidence, une haute qualité d’il-2 est essentielle pour la prolifération des cellules, bien que les facteurs qui déterminent la capacité proliférative des cellules in vitro doivent encore être clarifiées. La dose d’il-2 requis est variable entre les différentes lignées cellulaires, par exemple, 50U/mL est satisfaisante pour maintenir la prolifération des M296. Toutefois, la concentration la plus économique et fiable pour l’établissement de lignées de cellules NK/T n’a pas été présentée dans l’étude ; en effet, 150 U/mL est suffisante pour réussir.

Dans ce processus de mise en culture cellulaire, des éléments qui affectent la croissance des cellules, la viabilité des PBMC primaire est le plus important. Pour assurer le succès, le PBMC devrait être aussi frais que possible. Sans aucun doute, la concentration cellulaire est un facteur important affectant la culture réussie, c’est pourquoi la valeur du seuil doit être au minimum de 105 / mL. Si le nombre total de cellules isolée de l’échantillon est inférieur à 106, en utilisant une plaque de cellules de mini-puits à maintenir une concentration suffisante de cellules est une alternative de choix dans la culture initiale. En outre, ligne NK et des lymphocytes T pu être établie avec même une quantité limitée de sang périphérique lors de l’utilisation de la réaction hémolytique à enrichir les PBMC comme nous l’indiquions précédemment22. Comme décrit dans le protocole, le sérum humain est un autre facteur clé pour la survie des cellules au début de la culture. Nous croyons que certains ingrédients inconnus existent dans le sérum qui sont absents ou différents dans le sérum de veau fœtal et sont nécessaires à la prolifération des cellules T/NK.

Il existe deux limites de la méthode. Tout d’abord, il y a plusieurs questions sans réponse sur cette méthode, tels que comment et pourquoi l’EBV infecte le NK ou T cells in vivo, les mécanismes du NK/T cell la croissance et la prolifération in vitro, et quels types de cellules peuvent être mis en place dans les lignées cellulaires en un seul patient. Bien que nous ne pourrions pas contrôler le type de cellule et de la pureté, qui ne sont pas déterminés par la méthode, ces facteurs pourraient être dépendants sur les cellules QU'EBV infecte chez les patients. Avec ce protocole, NK et les lymphocytes T pourraient s’établit dans les lignées cellulaires, si cette méthode ne pourrait pas préférentiellement culture un type. Néanmoins, il y a un groupe dominant de ces cellules. Deuxièmement, il y avait un rapport que les NK et les lymphocytes T clones de patients atteints de LPD ou lymphomes NK/T a pu être établi aux lignées cellulaires, tandis que d’autres pourraient être maintenus pendant plusieurs mois17. Les cellules obtenues dans la présente étude peuvent proliférer bien plus de 3 mois, cependant qu’ils pourraient proliférer indéfiniment doit être validé.

En résumé, à l’aide de cette méthode, plusieurs lignées de cellules de lymphomes CAEBV ou NK/T peuvent être obtenues avec une quantité limitée de sang et une faible dose d’il-2 sans cellules nourricières. Ces lignées cellulaires contribuera à l’étude de la persistance d’EBV dans les cellules NK/T et pathogenèse de l’EBV associés de leucémie ou lymphome.

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Disclosures

D.Z. X.Z. et X.C. sont co-inventeurs sur en attente de demandes de brevet couvrant les utilisations possibles de cette méthode pour créer des lignées de cellules NK/T et les lignées cellulaires établies dans la présente étude. D.Z. X.Z. et X.C. ne déclarent aucun intérêts financiers concurrents dans ce travail. Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la clé des projets de chinois Académie des Sciences (KFZD-SW-205), stratégique biologique ressources technologie système de soutien de chinois Académie des Sciences (CZBZX-1 et ZSSB-004) et par des subventions de la Fondation nationale des sciences de Chine ( 81401640) et Shanghai fonds de sciences naturelles (14ZR1434800).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hu HLA-DR FITC BD 560944 antibody for FACS
Hu CD4 FITC BD 555346 antibody for FACS
Hu/NHP CD8 PE BD 557086 antibody for FACS
Hu CD3 PE BD 555340 antibody for FACS
Hu CD16 FITC 3G8 BD 555406 antibody for FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31 BD 556647 antibody for FACS
hu/CD19 PE-Cy7 BD 560728 antibody for FACS
human IL-2 Roche 11147528001
human serum MRC CCC118-125
CO2 incubator SANYO
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
microscope OLYMPUS CKX53 CKX53
Automated Cell Counter Countstar IC 1000 For cell counting
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene
FBS Gibco 10270 Component of cell medium
RPMI Medium 1640 life 22400089 For cell medium
L-Glutamine Amresco 374 Component of cell medium
100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of cell medium
Ficoll paque plus GE Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
DMSO Sigma D2650 For freezing cells
flow cytometer BD BD FACSAria II
soft ware BD BD FACSDiva soft ware FACS analysis

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References

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Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T.,More

Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T., Wu, X., Xie, Z., Duan, Z. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (133), e56515, doi:10.3791/56515 (2018).

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